关键词： 三阴性乳腺癌   紫草素   靶向纳米药物   肿瘤转移   联合治疗  

摘要： 目的:三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）是一种化疗、免疫治疗敏感性低,临床预后差,且易复发转移的恶性肿瘤。目前临床常用药物多柔比星、紫杉醇等由于毒副作用难以满足TNBC的治疗,因此亟需探索新型有效的治疗药物。近年来,传统中药来源的天然活性成分已经成为新型抗癌药物研发的重要来源。紫草素（Shikonin,SHK）,传统中药紫草的重要天然活性成分,前期研究表明其具有较好的广谱抗肿瘤活性且安全性良好,有望成为临床治疗TNBC的潜在药物。然而,其极低的生物利用度极大地限制了临床推广应用,故亟待紫草素类药物的剂型改良。目前已有采用纳米技术对SHK进行剂型改造用于TNBC治疗的相关研究,虽取得了一定的治疗效果,但仍存在靶向性不佳,生物利用度有限等问题,未能最大限度地增敏SHK对肿瘤治疗的疗效。基于上述问题,本论文提出了两种靶向递送SHK的新策略用于TNBC精准治疗:（1）杂化细胞膜伪装的普鲁士蓝纳米颗粒负载SHK（Hybrid membrane@ICG/PEI@HPB@SHK,HMGPHS NPs）联合光热治疗TNBC的研究;（2）SHK和银的纳米复合物（MUC1@Chi-Ag@CPB@SHK,MUC1@ACS NPs）通过诱导坏死性凋亡增强免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death,ICD）治疗转移性TNBC的研究。 方法:（1）杂化细胞膜伪装的普鲁士蓝纳米颗粒负载SHK联合光热治疗TNBC的研究:通过搅拌法和静电吸附法制备了HMGPHS NPs;通过粒径、电位、透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）、X射线衍射（X-ray diffraction,XRD）、傅里叶变换红外（Fourier Transform Infrared,FTIR）和Western blotting表征HMGPHS NPs;通过808 nm激光照射后考察HMGPHS NPs光热性能、光热稳定性、光热转换效率;通过调节p H考察HMGPHS NPs释放SHK的效率;通过巨噬细胞、BGC-823细胞、VSMC细胞、4T1细胞和3D肿瘤球考察HMGPHS NPs的免疫逃逸、摄取、靶向和渗透能力;通过荷瘤小鼠和小动物成像考察HMGPHS NPs的体内靶向和半衰期;通过MTT、活死细胞染色、流式细胞术、Western blotting、伤口愈合实验、Transewell侵袭和转移实验考察HMGPHS NPs的体外抗肿瘤活性;通过荷瘤小鼠、H&E、TUNEL、免疫组化和免疫荧光考察HMGPHS NPs的体内抗肿瘤作用。 （2）SHK和银的纳米复合物通过诱导坏死性凋亡增强免疫原性细胞死亡（Immunogenic cell death,ICD）治疗转移性TNBC的研究:通过MTT和Synergy Finder软件考察SHK和壳聚糖银纳米（Chitosan-silver nanoparticles,Chi-Ag NPs）的协同效果;通过活死细胞染色、流式细胞术、Western blotting、ROS、LDH和ATP实验考察SHK与Chi-Ag NPs联用的作用机制;通过搅拌法、静电吸附法和化学键修饰法制备了MUC1@ACS NPs;通过粒径、电位和TEM表征MUC1@ACS NPs;通过调节p H考察MUC1@ACS NPs释放SHK的效率;通过4T1、MCF-10A、HUVEC、Hep G2细胞和3D肿瘤球考察MUC1@ACS NPs的摄取、靶向和渗透能力;通过荷瘤小鼠、小动物成像和免疫荧光考察MUC1@ACS NPs的体内靶向、渗透和半衰期;通过MTT和3D肿瘤球模型考察MUC1@ACS NPs的体外药效;通过荷瘤小鼠、H&E、TUNEL、免疫组化和免疫荧光考察MUC1@ACS NPs的体内抗肿瘤作用;通过流式分析肿瘤组织CD8+T、CD4+T和Treg细胞含量以及淋巴结中DCs成熟含量考察MUC1@ACS NPs的体内抗肿瘤免疫作用;通过远端肿瘤模型考察MUC1@ACS NPs的体内远端肿瘤和转移抑制。 结果:杂化细胞膜伪装的普鲁士蓝纳米颗粒负载SHK联合光热治疗TNBC的研究:（1）通过搅拌法和静电吸附法制备了HMGPHS NPs,表征结果显示HMGPHS NPs呈立方体形状,表面有膜涂层,粒径大小为124.3±3.5 nm,电位大小为-12.9m V,且合成过程中杂化膜的膜蛋白成功保留;XPS、FTIR和XRD确认了HMGPHS NPs的成分和结构特征;光热性能结果显示HMGPHS NPs的温度升高与激光功率和NPs浓度呈正相关,多个周期照射后具有较好的光热稳定性,光热转换效率为31.6%;体外释放结果显示HMGPHS NPs释放行为呈p H和

关键词： 溶酶体降解技术   自噬靶向嵌合体   含溴结构域蛋白4   三阴性乳腺癌  

摘要： 作为生命体内广泛存在的生物大分子,蛋白质在酶催化、信号转导、能量供给、基因调控、维持机体稳态等方面扮演重要角色。与此同时,许多人类疾病的发生源于蛋白质的突变或异常积累,特异性降解这些致病蛋白可以从根本上干预或治疗疾病,因此靶向蛋白质降解成为生物医学研究和药物发现的重要工具。近年来相继涌现出不同类型的蛋白质降解策略:包括基因干扰技术（如RNAi和CRISPR）,基于泛素化-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）的分子胶水和发展更为成熟的蛋白水解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chimera,PROTAC）技术。与传统的小分子抑制剂相比,PROTACs在用药剂量、耐药性、毒副作用和“非成药”靶标等方面的潜在优势引起了药学工作者的广泛关注。但由于UPS表达范围的局限性,导致PROTACs主要诱导特定细胞内蛋白质的降解,而不能够有效地清除其他更易引发多种癌症、神经退行性疾病及自身免疫性疾病的致病蛋白,如蛋白聚集体、胞外蛋白以及膜蛋白。因此亟需寻找和探索蛋白质降解的新技术,拓展蛋白质降解剂技术的靶点范围。 基于溶酶体系统的蛋白质降解技术通过其胞吞和自噬途径可以有效降解上述各种致病蛋白,极大地丰富了蛋白质降解的靶标范围。其中,自噬-溶酶体途径在维持细胞内蛋白质稳态和正常代谢活动中起着重要作用,其作用机制主要是自噬关键蛋白LC3通过自噬货物受体p62/SQSTM1将靶蛋白包裹进自噬体,随后与溶酶体融合将靶蛋白降解。因此,充分利用LC3在连接靶蛋白和自噬体之间的桥梁作用,探究通过自噬-溶酶体途径降解致病蛋白的技术具有重要的科学意义及临床价值。另一方面,含溴结构域蛋白4（bromodomain-contain 4,BRD4）是溴结构域及超末端结构（bromodomain and extra-terminal domain,BET）家族的一员,其上调与各种实体瘤的恶性进展密切相关,已成为开发抗癌药物的热门靶点。BRD4小分子抑制剂会使BRD4在体内大量积累,导致其抑制效率降低,同时耐药问题也使其临床效果不理想,因此靶向BRD4降解是一种更有效控制肿瘤恶性发展的新思路,开发基于自噬途径降解BRD4对探索自噬降解技术具有重要意义。 基于此,本论文利用已报道的LC3和BRD4配体,结合自噬靶向嵌合体（autophagy-targeting chimeras,AUTACs）技术,合成了一系列靶向降解BRD4蛋白的降解剂AUTACs,并进行了BRD4降解机制验证和相关抗肿瘤活性研究。首先,我们经过文献调研发现化合物JQ1是一种有效的可逆性BET溴域抑制剂,可作为靶向BRD4的弹头分子,并已有报道证实JQ1羧基位置上的化学修饰不会影响其与BRD4蛋白的结合。此外,有报道称化合物GW5074可以与LC3有效结合,且不影响细胞整体自噬功能。同样地,GW5074的4-羟基延伸对LC3仍具有较高的亲和力,因此从该位置引入不同长度的连接链是可行的。基于上述分析,作为概念验证,我们以不同长度的纯烷烃链作为linker合成了AUTACs14a-14j,靶蛋白降解活性结果显示该系列降解剂活性均不理想,BRD4降解率在0～23%之间。其中,LC3配体为5-碘吲哚酮取代（14f-14j）化合物的降解活性略强于5-溴吲哚酮取代（14a-14e）。因此,我们将5-碘吲哚酮骨架结构保留,将纯烷烃linker替换为不同长度的聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）链,合成了AUTACs 14k-14r。降解结果显示该系列化合物均表现出比14a-14j更高的BRD4降解活性（20μM浓度下,BRD4降解率达到30～92%）。经过两轮化学结构修饰和靶蛋白降解活性分析,我们最终获得了优选的BRD4自噬-溶酶体降解剂14m,其在MDA-MB-231细胞中的Dmax可达92%,IC50为0.9μM。 接下来,我们通过蛋白免疫印迹分析验证了14m在几种三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）细胞中均能有效降解BRD4,10μM浓度下,在MDA-MB-231细胞中的降解效率甚至超过99%,并能显著下调BRD4下游效应蛋白c-MYC的水平。在探讨14m对BRD4降解的量-效和时-效关系时,我们发现14m（0.5μM）作用2小时便能有效诱导几种TNBC细胞中的BRD4降解。机制研究表明,14m诱导BRD4的降解依赖于完整的AUTAC分子。随后对代表性化合物的表面等离子体共振（surface plasmon resonance,SPR）分析结果表明,与GW5074相似,降解剂14h-14r对LC3具有一定的亲和力,其中优选降解剂14m对LC3的KD值为1.3μM。降解机制验证

关键词： 三阴性乳腺癌   抗菌肽   自噬抑制   癌细胞   细胞凋亡  

摘要： 乳腺癌在全球发病率和死亡率居女性癌症首位，三阴性乳腺癌约占其中的15%-20%。三阴性乳腺癌缺乏其他类型乳腺癌的治疗靶点（如雌激素、孕激素受体和人表皮生长因子受体）的表达，是一种侵袭性较强且治疗难度较大的乳腺癌亚型。目前临床治疗常用手术联合化疗药物治疗，但传统化疗药物存在选择性差、毒副作用大和耐药性等弊端，亟需开发新型抗三阴性乳腺癌药物。抗菌肽是一类固有免疫系统的小分子肽，具有抗菌、抗病毒和抗真菌等活性。研究发现部分抗菌肽在肿瘤治疗领域具有潜力，这类抗菌肽不仅低毒性、对肿瘤细胞选择性高，并且对休眠期和生长缓慢的肿瘤细胞也具有抗癌活性。抗菌肽Pep19-2.5是一种正在开发的抗感染和中和内毒素的合成多肽，安全性高，目前尚无其抗肿瘤活性的报道。本课题组通过筛选发现抗菌肽Pep19-2.5可在体外显著抑制三阴性乳腺癌细胞增殖，但分子机制不明。最近研究表明，三阴性乳腺癌的治疗效果可能受细胞自噬的影响，自噬是一种细胞内的降解和回收过程，涉及细胞内蛋白质、细胞器和其他大分子物质的降解。因此，本课题拟通过体内外系统实验，围绕自噬流、自噬-溶酶体途径研究抗菌肽Pep19-2.5的抗三阴性乳腺癌作用及其分子机制。本文主要研究方法和结果如下：　　1. 抗菌肽Pep19-2.5调节自噬能力的检测：选取课题组前期筛选抑制三阴性乳腺癌细胞株 MDA-MB-231 增殖活性效果较好的Pep19-2.5、Tiger17、AH90、DRGN-1、SHAP1五种抗菌肽，采用稳定表达GFP-LC3B的三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231检测它们调节自噬的能力，发现只有Pep19-2.5具有自噬调节作用。Western blot、RT-PCR和透射电子显微镜结果显示，抗菌肽Pep19-2.5提高了自噬分子LC3B、SQSTM1/p62蛋白表达水平、增加了自噬小体数量，说明Pep19-2.5是一种有效的自噬调节剂。进一步联用Pep19-2.5和自噬早期/晚期抑制剂进行分析，Western blot结果表明Pep19-2.5抑制自噬晚期。　　2. 抗菌肽Pep19-2.5抑制自噬流抗三阴性乳腺癌的体外作用研究：CCK8和细胞克隆形成实验表明，抗菌肽Pep19-2.5显著抑制三阴性乳腺癌细胞增殖，并增强了肿瘤细胞对化疗药顺铂的敏感性。流式细胞术、Tunel和Western blot结果显示，抗菌肽Pep19-2.5诱导肿瘤细胞凋亡。敲除ATG5（自噬小体形成的必需基因）的细胞株不具备形成自噬流的能力。CCK8检测抗菌肽Pep19-2.5对ATG5KO MDA-MB-231细胞增殖的影响，结果表明抗菌肽Pep19-2.5是通过抑制自噬流来抑制MDA-MB-231细胞增殖的。流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测结果显示，抗菌肽Pep19-2.5可穿透肿瘤细胞膜，定位于溶酶体。自噬小体和溶酶体共定位观察实验结果表明Pep19-2.5抑制自噬体-溶酶体降解。ELISA结果显示溶酶体标志酶ACP和溶酶体主要蛋白酶CTSB、CTSD相对酶活性降低，说明抗菌肽Pep19-2.5 影响了溶酶体水解功能，可能影响了溶酶体的pH。RNA-Seq分析结果表明，抗菌肽Pep19-2.5作用相关的途径有：细胞增殖、生物调节、癌症途径、抗癌药物的耐药性等。通过Pulldown-MS蛋白靶点垂钓实验及蛋白靶点的筛选和验证，初步推测，ATP6V1A可能是抗菌肽Pep19-2.5抑制自噬流抗三阴性乳腺癌的作用靶点，但仍有待进一步研究。　　3. 抗菌肽 Pep19-2.5 在动物体内的药效评价：通过构建NOD/SICD小鼠人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞移植瘤模型，对抗菌肽Pep19-2.5进行药效评价。HE染色、TUNEL染色、免疫荧光、免疫组化检测小鼠对抗菌肽Pep19-2.5的耐受性、肿瘤组织的凋亡率及自噬分子LC3、SQSTM1/p62的表达情况，结果表明Pep19-2.5在小鼠体内具有良好的耐受性，能够同样有效的抑制自噬流、诱导肿瘤凋亡。　　4. 抗菌肽Pep19-2.5的结构基础及活性结构初步分析：CCK8结果表明抗菌肽 Pep19-2.5 在 40μM 浓度以下不抑制正常细胞株NIH/3T3、HUVECs和MCF-10A的增殖。溶血试验表明Pep19-2.5在160μM浓度以下的溶血率极低。采用生信分析软件和圆二色谱对Pep19-2.5的理化性质、二级结构、亲疏水性、信号肽等进行分析，结果表明Pep19-2.5是一个双亲性多肽，结构上显示出少量β折叠。对抗菌肽Pep19-2.5序列中碱性氨基酸聚集的部分进行改构，CCK8结果表明，抗菌肽Pep19-2.5抑制MDA-MB-231细胞增殖的作用可能与氨基酸序列中的赖氨酸和精氨酸有关。　　综上所述，本文研究结果表明抗菌肽Pep19-2.5通过

关键词： 纳米材料   制备工艺   肿瘤靶向性   线粒体靶向性   氯尼达明   药物递送   三阴性乳腺癌   抗肿瘤效果  

摘要： 乳腺癌是一个全球关注的问题，世界卫生组织报道，每年约210万女性被检出患有乳腺癌。三阴性乳腺癌(TNBC)是一类具有早期转移性、高侵袭性、高复发率和低预后性的乳腺癌。临床传统治疗手段(手术、放疗和化疗)存在较大的毒副作用且治疗效果有限。氯尼达明属于广谱抗肿瘤药，可用于乳腺癌的治疗，由于其主要的抗癌机制是靶向肿瘤细胞线粒体代谢干扰肿瘤细胞能量产生，因此对正常细胞的杀伤作用小,然而其水溶性较差,不能较大程度地靶向肿瘤线粒体，为了将氯尼达明载入肿瘤细胞线粒体，将氯尼达明与合适的纳米生物材料结合，制备能够精准靶向肿瘤细胞线粒体的纳米粒具有重要意义。研究发现，快速增殖的肿瘤细胞表面会高表达整合素αVβ3，而在成熟血管内皮细胞和正常组织中表达较少，同时，整合素αVβ3可以特异性识别短肽RGD(Arg-Gly-Asp,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)结构并与之发生特异性结合，从而抑制肿瘤细胞的粘附，对肿瘤细胞的增殖起抑制作用。因此，RGD及其衍生物被广泛用作肿瘤细胞表面高表达整合素的配体来提高抗肿瘤药物的靶向能力。线粒体是细胞中重要的细胞器,对细胞代谢及生物能量合成起关键作用，扰乱线粒体功能对肿瘤细胞的正常生命活动有重要影响。基于肿瘤线粒体较正常线粒体具有更高的膜电位，研究发现，亲脂性阳离子可以很好地选择性聚集到肿瘤细胞线粒体内，其中研究较多的线粒体靶向阳离子主要是三苯基膦。　　本研究课题以氯尼达明(Lonidamine,LND)作为抗肿瘤药物，设计合成两种主要纳米材料，包括肿瘤靶向材料DSPE-S-S-PEG-R6RGD(DSSR)和线粒体靶向材料TPP-TPGS(TPS),通过水包油乳化溶剂挥发法制备纳米粒LND-PLGA/TPS/DSSR NPs包裹氯尼达明，纳米粒负载氯尼达明程序性靶向三阴性乳腺癌细胞的线粒体，起到增效减毒的作用。通过红外光谱、核磁共振、飞行质谱等仪器对纳米材料进行表征，并验证了纳米粒的稳定性和体外释药性能，通过体外细胞实验验证其细胞摄取、线粒体定位和线粒体凋亡机制。通过三阴性乳腺癌荷瘤鼠体内药效实验阐明其抗肿瘤活性和体内安全性。透射电镜结果显示负载LND后纳米颗粒呈均匀球形，具有光滑的表面形态，其粒径在200-350 nm均匀分布。LND-PLGA/TPS/DSSR NPs 的平均直径为 319.93±16.66 nm,大于LND-PLGA/TPS NPs 和 LND-PLGA/DSSR NPs,这可能是由于 DSSR 和 TPS 的共包裹效应。多分散系数(PDI)约为0.3,表明纳米粒子具有良好的分散性。LND-PLGA/TPS NPs 电位为正值，而 LND-PLGA/DSSR NPs 和LND-PLGA/TPS/DSSR NPs均为负值。带正电的纳米粒与带负电的血管表面结合,容易被快速清除，而负电荷可以保护纳米粒避免在血液循环中被快速清除。通过紫外分析，LND-PLGA/TPS/DSSR NPs的包封率和载药率值分别为87.51％和18.82％。粒径和分散度分析表明，纳米粒在一周内具有较高的稳定性。以pH 8.0和10 mM GSH模拟肿瘤线粒体微环境，采用透析法不同时间点取样，发现24小时后其累积释放量可达到100％,几乎完全释放。在纳米粒成功制备的基础上进行体外活性和体内药效研究，激光共聚焦结果表明RGD修饰有助于纳米粒LND-PLGA/TPS/DSSR NPs更好的靶向整合素αVβ3阳性的MDA-MB-231细胞，同时其细胞摄取与能量产生相关。采用CCK-8检测试剂分析载药纳米粒对MDA-MB-231细胞的细胞毒性，发现其抗增殖效果是与LND浓度相关的，与氯尼达明相比，纳米粒可以明显增强其对肿瘤细胞毒性。动物体内药效和病理组织染色实验结果显示，与LND和其他组纳米粒相比，LND-PLGA/TPS/DSSR NPs能够更好的抑制肿瘤的发展，且对正常组织没有明显毒副作用。在此基础上进一步探索线粒体作用机制，通过JC-1试剂盒和透射电镜结果可以看出，LND-PLGA/TPS/DSSR NPs能够明显增加氯尼达明对线粒体的损伤效果。Western blot和流式细胞术实验结果表明，纳米粒主要诱导肿瘤细胞的早期和晚期凋亡发生，且与线粒体凋亡相关的凋亡蛋白caspase-9和caspase-3的表达水平相应提高。线粒体呼吸链抑制作用实验表明，LND-PLGA/TPS/DSSR NPs比游离的LND更明显的降低了基础呼吸值、ATP合成量、最大呼吸值和备用呼吸值，证明了被靶向纳米材料包裹后的氯尼达明能够更好的靶向线粒体，使其更好的发挥抗肿瘤效果。因此，这种线粒体靶向递送系统可被临床上开发为TNBC的潜在治疗方法。

关键词： 三阴性乳腺癌   伏立诺他   顺铂   POLR2A   铁死亡  

摘要： 目的:探讨伏立诺他(Vorinostat,SAHA)及其促顺铂(Cisplatin,CDDP)抗三阴性乳腺癌作用及其潜在机制。方法:用不同浓度伏立诺他、顺铂及其联合用药处理POLR2A野生型的三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231和POLR2A杂合性缺失的三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-453后,通过CCK-8实验检测细胞活力,平板克隆形成实验检测细胞增殖能力,Western blot检测细胞内POLR2A、SLC7A11及GPX4蛋白表达水平,还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和脂质过氧化物(Lipid peroxide,LPO)试剂盒检测细胞内GSH及LPO水平。利用si RNA干扰MDA-MB-231细胞内POLR2A表达后,通过CCK-8实验检测POLR2A表达下调对细胞活力的影响,Western blot检测细胞内SLC7A11及GPX4蛋白表达水平的变化,GSH和LPO试剂盒检测细胞内GSH及LPO水平的变化。在BALB/c裸鼠皮下接种MDA-MB-231及MDA-MB-453细胞以建立两种不同的三阴性乳腺癌细胞异种移植肿瘤模型,腹腔注射伏立诺他、顺铂单药或其联合用药,通过测量给药期间裸鼠体重、肿瘤体积变化以及肿瘤重量来观察药物毒性及肿瘤生长情况;通过免疫组化和免疫荧光试验分别检测肿瘤组织中POLR2A和SLC7A11表达水平。结果:CCK-8实验和平板克隆形成实验表明伏立诺他与顺铂均以剂量依赖性的方式抑制MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞的活力和增殖,而两者联合对三阴性乳腺癌细胞的抑制具有协同作用,且伏立诺他及其与顺铂联合用药对POLR2A杂合性缺失的MDA-MB-453细胞活力的抑制作用优于POLR2A野生型的MDA-MB-231细胞。Western blot、GSH及LPO试剂盒检测结果表明,伏立诺他可下调POLR2A,而顺铂对POLR2A无明显调节作用,但两者联合后POLR2A进一步下调;伏立诺他还可下调SLC7A11、GPX4、GSH水平、上调LPO水平促进三阴性乳腺癌细胞铁死亡,与顺铂联合后上述现象更加明显。si RNA转染实验表明下调POLR2A表达可抑制SLC7A11及GPX4的表达、降低细胞内GSH水平及升高LPO水平,从而诱导铁死亡,并增强伏立诺他及其与顺铂联合用药对POLR2A野生型三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231活力的抑制作用。动物实验结果表明伏立诺他、顺铂及其联合用药均可显著抑制三阴性乳腺癌细胞异种移植瘤的在体生长,且两者联合的效果优于单药;伏立诺他及其与顺铂联合用药对POLR2A杂合性缺失的三阴性乳腺癌细胞异种移植瘤的抑制作用显著优于野生型。免疫组化及免疫荧光试验结果表明伏立诺他及其与顺铂联合用药可降低移植瘤组织中POLR2A及SLC7A11的表达。结论:伏立诺他与顺铂可协同抑制三阴性乳腺癌细胞及其异种移植瘤的生长,且对POLR2A杂合性缺失的三阴性乳腺癌细胞的抑制作用优于POLR2A野生型的三阴性乳腺癌细胞,其机制与伏立诺他下调POLR2A的表达并诱导三阴性乳腺癌细胞铁死亡有关。而下调POLR2A表达可抑制铁死亡关键分子SLC7A11的表达、升高细胞内脂质过氧化物水平、增强伏立诺他及其与顺铂联合用药对POLR2A野生型的三阴性乳腺癌细胞的抑制作用。本研究为伏立诺他及其与顺铂联合抗三阴性乳腺癌的个体化精准治疗提供了实验依据。图8幅,表8个,参考文献77篇

关键词： 三阴性乳腺癌   FAK抑制剂   黏附斑   抗转移  

摘要： 开发黏附斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)抑制剂有望成为靶向治疗三阴乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)有效途径之一。然而,现有FAK抑制剂主要为激酶抑制剂,靶向高度保守的中心激酶催化域,缺乏对非酶催化功能的干预,对FAK的选择性也有待进一步提高,限制了其进一步临床应用。FAT(focal adhesion targeting)结构域位于FAK的C端,可通过多种途径调控FAK的非酶催化功能,对肿瘤细胞的粘附、存活、增殖、迁移发挥重要作用,已成为开发新型FAK抑制剂的前沿和热点。氯吡胺(chloropyramine,C4)是通过高通量筛选发现的首个靶向FAT域的FAK抑制剂,可抑制FAK-VEGFR-3的相互作用靶向FAT,进而抑制FAK的非酶催化功能。然而,C4及其现有衍生物的抗肿瘤活性仍有待进一步提高。本文基于优势片段的骨架跃迁原理,以C4为先导化合物,将其N-2位苄基取代基替换为含不同取代的天然肉桂酸片段,通过酰胺键进行偶联,设计、合成了19个C4衍生物9a-9s,旨在获得结构新颖、低毒高效且生物利用度更优的FAT域抑制剂,并考察其抗TNBC活性。生物活性研究结果表明:1.活性化合物9d对多种TNBC细胞的增殖抑制活性(IC=8.37-9.07μM)均明显优于C4。重要的是,9d对正常乳腺细胞MCF10A的毒性相对较低(IC=40.63μM),提示9d可在相对安全的剂量下有效抑制TNBC细胞增殖。2.化合物9d在体外能够剂量依赖性抑制高侵袭性TNBC细胞的侵袭和迁移。3.化合物9d有望通过插入FAT域在Y925附近的结合口袋,抑制关键位点Y925磷酸化,抑制FAK的功能。4.化合物9d可有效减少黏附斑(FAs)和应力纤维(SFs)的形成,并剂量依赖性诱导TNBC细胞凋亡。综上,以化合物9d为代表的C4衍生物为开发靶向FAT域的FAK抑制剂及其应用提供了新的思路,也为寻找与发现新型抗TNBC药物奠定了良好的基础。图18幅,表5个,参考文献52篇

关键词： 藤黄酸   地西他滨   光聚合水凝胶   三阴性乳腺癌   术后复发   伤口愈合   细胞焦亡  

摘要： 目的: 本课题以中药藤黄中的抗肿瘤活性成分藤黄酸（GA）和DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨（DEC）作为焦亡诱导药物,以聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEG-DMA）和甲基丙烯酰化丝胶蛋白（SER-MA）为载体,受中医理论指导下扶正祛邪治疗原则的启发,结合现代科学技术,采用光聚合法制备一种可以用于填充三阴性乳腺癌切除腔和防止肿瘤复发的水凝胶。并对水凝胶特性、体外抗肿瘤活性、体内外生物相容性,体内促伤口愈合能力及体内抗肿瘤药效进行评价。研究载藤黄酸-地西他滨水凝胶通过细胞焦亡途径对肿瘤复发和转移的抑制作用,为TNBC治疗中,抑制肿瘤复发和转移的药物和药物递送系统的选用和开发提供思路并奠定研究基础。 方法: （1）载药水凝胶的制备和表征。采取乳化溶剂挥发法制备藤黄酸PLGA纳米粒（GA NPs）,并对纳米粒进行基本表征。确立PEG-DMA和SER-MA混合的适宜比例,对PEG-DMA、SER-MA、PEG-DMA/SER-MA水凝胶的微观结构、光聚合前后结构变化、弹性模量、溶胀性能、硬度、孔隙率和体外药物释放等基本性质进行表征。选取亲水性荧光染料罗丹明B和疏水性荧光染料Di D分别模拟DEC和GA的体内药物释放规律。 （2）药物联合的作用机制研究。选取香豆素-6（C6）荧光探针模拟GA,考察C6和C6 NPs在细胞中的摄取情况;采用MTT法考察DEC和GA对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖活力的影响;通过q PCR实验确定DEC对4T1细胞中Gsdme基因表达的影响;测定DEC和GA药物作用后体外细胞的LDH释放率、细胞焦亡率、细胞形态、细胞迁移能力以及细胞内焦亡相关蛋白（GSDME-FL、GSDME-N、caspase-3和cleaved-caspase-3）的表达水平。 （3）水凝胶生物相容性评价。通过MTT法考察水凝胶浸提液对小鼠成纤维L929细胞增殖活力的影响;考察水凝胶浸提液的溶血活性;将水凝胶植入小鼠体内评估其体内生物相容性和体内降解;通过小鼠创面愈合模型评价水凝胶促伤口愈合的能力。 （4）载药PEG-DMA/SER-MA水凝胶的体内药效学评价和作用机制研究。通过在小鼠第四对乳腺脂肪垫注射4T1-luc细胞构建小鼠三阴性乳腺癌原位模型;将肿瘤手术切除后,原位光固化载GA NPs/DEC水凝胶填充手术空腔;通过活体动物成像系统监测肿瘤的复发和转移,记录小鼠的体重和肿瘤体积;通过免疫组化、免疫荧光和流式细胞术等实验评价GA NPs/DEC水凝胶的抗肿瘤活性以及对肺转移的抑制作用。 结果: （1）得到质地均匀,呈球形的GA NPs,粒径为216.8±5.5 nm,PDI为0.197±0.032,zeta电位为-22.31±0.46 m V,包封率为57.2±1.3%,载药量为5.2±0.2%;在4℃、室温和37℃的储存条件下,12天内纳米粒的粒径和PDI均表现出良好稳定性。通过处方优化得到的PEG-DMA/SER-MA水凝胶中两种材料的含量分别为:10%PEG-DMA（v/v）和5%SER-MA（w/v）;通过扫描电镜可以观察到PEG-DMA/SER-MA水凝胶具有更多孔的结构;激光共聚焦显示杂化水凝胶较单一水凝胶孔隙结构更完整,SER-MA水凝胶破碎点最多;FT-IR显示光交联不影响PEG-DMA和SER-MA的主要化学结构;弹性模量结果显示,PEG-DMA/SERMA水凝胶较2种单一水凝胶的模量更小,刚度更小;杂化水凝胶垂直和平行方向的压缩模量相差1.12倍;PEG-DMA、SER-MA和PEG-DMA/SER-MA水凝胶均不会明显溶胀;杂化水凝胶的硬度最小,孔隙率最高;体内外药物释放结果一致,DEC和罗丹明B可以在短时间内大量释放（分别为1 h和24 h）,GA和Di D可以在体内分别持续释放超过8天和28天。 （2）细胞摄取结果表明,C6 NPs的细胞摄取量明显多余游离C6,将药物包载于纳米粒中能够更有效促进细胞摄取,从而诱导细胞死亡;MTT结果表明GA对4T1细胞的增殖抑制呈剂量依赖性,IC50为0.12μmol/L,DEC的IC50为147μmol/L,低浓度DEC不具有抗肿瘤活性;q PCR实验表明,DEC在短时间内（12 h）能够有效提高4T1细胞中Gsdme基因的表达;流式结果显示DEC处理后的细胞提高细胞焦亡发生的可能性,与GA共同作用引起更多癌细胞的死亡;GA和DEC共同处理增加细胞中LDH的释放量;同时能够观察到细胞焦亡的典型形态,而单独药物作用的细胞不呈现明显焦亡形态;划痕实验表明,DEC和GA共同作用于4T1细胞能够有效抑制细胞迁移;WB实验中,检测到GA和DEC共同处理后的细胞中GSDME-N和cleaved-caspase-3的表达水平增加。 （3）将24 h水凝胶浸提液与L929细胞共同孵育,PEG-DMA

关键词： Z-没药甾酮   三阴性乳腺癌   网络药理学   抗肿瘤作用   转录组学  

摘要： 目的：　　本研究运用网络药理学结合转录组学，分析Z-没药甾酮干预三阴性乳腺癌（Triple-negativebreastcancer，TNBC）的关键靶点及分子机制并通过体内外实验进一步验证，为Z-没药甾酮作为天然化合物治疗三阴性乳腺癌提供药理学证据。　　方法：　　1.使用中药数据库TCMSP、TCMID收集筛选没药活性成分，利用SwissTargetPrediction数据库预测活性成分的潜在靶点，使用GeneCards数据库获取三阴性乳腺癌疾病靶点，二者取交集获得没药干预三阴性乳腺癌的潜在靶点，利用DAVID数据库进行GO和KEGG通路富集分析，利用Cytoscape3.7.1软件构建没药活性成分-潜在靶点-信号通路构建网络，并进行网络拓扑分析，筛选出没药甾酮（Guggulsterone，GS）作为没药干预三阴性乳腺癌的特征活性成分。　　2.通过CCK8细胞活性检测实验测试不同药物浓度的E/Z-GS处理TNBC细胞系MDA-MB-468和BT-549以及正常乳腺上皮细胞系MCF-10A后细胞活性的变化。Transwell实验检测不同药物浓度的GS对MDA-MB-468和BT-549细胞的迁移和侵袭能力的影响。　　3.采用RNA-seq技术分析经Z-GS处理的MDA-MB-468细胞基因水平的变化，筛选出差异基因并进行GO和KEGG富集分析。选择上调或下调排名前200的差异基因与网络药理学分析得到的差异基因取交集，获得Z-GS抗三阴性乳腺癌的核心靶点。采用KM-plot数据库评估核心靶点的临床预后价值，选择具有预后价值的靶点进行下一步分析。利用分子对接技术，将Z-GS与核心靶点进行对接，根据对接评分选择结合能力强的关键靶点作为后续研究对象。　　4.通过体内外实验验证Z-GS对三阴性乳腺癌关键靶点及信号通路的影响。　　结果：　　1.通过TCMSP、TCMID数据库筛选获得45个没药的活性成分，通过SwissTarget数据库预测活性成分的潜在靶点，筛选去重后，在24个活性化合物中预测出336个潜在靶点。通过GeneCards数据库获取三阴性乳腺癌相关疾病靶点1322个，与活性成分潜在靶点取交集得到136个交集靶点。通过DAVID数据库对交集靶点进行GO和KEGG富集分析。结果显示，没药可能通过正向调控凋亡过程、药物反应、负向调控细胞增殖、蛋白结合等作用影响三阴性乳腺癌。可能的作用通路包括癌症通路、蛋白多糖在癌症中的作用、PI3K-AKT信号通路。构建成分-靶点-通路网络，经拓扑分析后以度值评估节点在网络中的重要性。结果表明核心活性化合物是槲皮素、鞣花酸、没药甾酮、β-谷甾醇和天竺葵素。核心靶点是PGR、AR、NR3C2、CYP19A1和PTGS2。由于槲皮素、鞣花酸和β-谷甾醇在网络药理学分析中普遍存在，而没药甾酮作为没药的特征活性化合物被选择用于进一步研究。　　***8实验结果表明，E-GS对TNBC细胞系MDA-MB-468和BT-549的细胞活性无明显抑制作用。Z-GS处理TNBC细胞24小时后，对细胞活性抑制作用不显著，但在处理48和72小时后，Z-GS能够显著抑制MDA-MB-468和BT-549细胞的细胞活性，且具有浓度依赖性。同时Z-GS对正常乳腺上皮细胞MCF-10A无明显抑制作用;Transwell迁移和侵袭实验结果表明，Z-GS可以显著抑制TNBC细胞的迁移和侵袭能力。　　***-seq结果表明，MDA-MB-468细胞经Z-GS处理后有1488个上调基因以及2237个下调基因。KEGG和GO富集分析显示，Z-GS主要作用于细胞周期、p53信号通路、细胞衰老以及凋亡通路。选择上下调差异基因中排名前200的基因与网络药理学分析筛选的差异基因取交集得到14个关键靶点，经临床预后分析和分子对接评估，筛选出p53、CCNB1和PLK1为Z-GS在三阴性乳腺癌中发挥作用的关键靶点。　　4.流式细胞术结果表明，Z-GS能够将TNBC细胞周期阻滞在G2/M期并且促进细胞凋亡，差异具有统计学意义。实时荧光定量PCR和WesternBlot结果表明，Z-GS能够从mRNA和蛋白水平下调CCNB1和PLK1的表达，并且上调p53的表达。加入p53抑制剂PFT-α进行回复实验，结果证实Z-GS能够通过p53/CCNB1/PLK1轴对三阴性乳腺癌发挥抗肿瘤作用。以MDA-MB-468细胞构建裸鼠三阴性乳腺癌移植瘤模型，经Z-GS灌胃给药处理，结果表明Z-没药甾酮能够显著抑制裸鼠体内三阴性乳腺癌的增长。肿瘤组织免疫组化结果表明Z-GS下调了CCNB1和PLK1的表达水平，同时上调了p53的表达水平。　　结论：　　本研究采用网络药理学结合转录组测序分析方法，并通过体内外实验证实Z-GS可以显著抑制TNBC细胞的增殖，迁移，侵袭

关键词： 射干   活性成分   鸢尾型三萜   三阴性乳腺癌   作用机制  

摘要： 三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）是一种高度恶性肿瘤,占所有乳腺癌的15-20%。三阴性乳腺癌的孕激素受体（PR）、雌激素受体（ER）和人类表皮生长因子受体2（Her-2）均表现为阴性,具有侵袭性强、恶化程度高、预后差的特点。目前,化疗是其最重要的治疗方法,但后期化疗药物的耐药性导致临床效果不佳,所以,从天然植物资源中寻找治疗TNBC的活性成分是可行的策略。课题组前期经过高通量抗肿瘤活性筛选发现射干浸膏具有抗三阴性乳腺癌的潜力。 射干为鸢尾科射干属(Belamcanda chinensis（L.）DC)植物,其生长环境广泛,主要分布于东北亚,首次记录在公元300年的传统中医专著《神农本草经》中,其具有散结消炎、消肿止痛、解热、解毒等多种药理活性,长期应用于中医药治疗中。现代研究表明,射干中化合物具有抗宫颈癌、人骨肉瘤细胞、非小细胞肺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌等抗肿瘤作用,但尚无抗三阴性乳腺癌作用及其机制的报道,且对于其药效物质的提取分离及在生物学方面的活性机制暂不清楚。本课题旨在对射干进行药效物质基础研究的基础上,寻找结构新颖的活性化合物,并对其抗三阴性乳腺癌的作用机制阐述,从而为射干的进一步开发利用提供理论基础。 本课题通过大孔吸附树脂,硅胶,ODS,Sephadex LH-20等多种填料的柱层析和中低压、半制备液相、制备液相色谱等分离手段,并通过MS、NMR和旋光光谱等谱学数据进行结构鉴定,最后从射干中分离鉴定出22个单体化合物,包括黄酮类化合物（10个）、鸢尾型三萜（3个）、甾醇类化合物（2个）、二苯乙烯类（2个）及其他类化合物（4个）等,其中包括2个新化合物,5个从射干属中首次发现的化合物,丰富了射干结构多样性。此外,通过CCK8法实验对射干中抗三阴性乳腺癌活性成分追踪,发现鸢尾型三萜类化合物BC19、BC20具有抗三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞活性(IC50分别为15.74±1.04μM、26.97±2.68μM)。通过克隆形成实验、划痕实验和transwell实验发现BC19、BC20能显著地剂量依赖性抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞的增殖和迁移,通过细胞周期实验发现BC19、BC20能把三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞的细胞周期阻滞在G1期。通过线粒体膜电位检测、ROS实验、Annexin V-FITC/PI双染和Hoechst活细胞染色实验发现BC19、BC20能诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞凋亡从而发挥抗乳腺癌作用。 综上所述,本课题从射干根茎中分离并鉴定了22个化合物（新化合物2个、已知化合物20个）,并通过一系列细胞实验初步揭示了射干中鸢尾型三萜类化合物BC19、BC20的抗三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞的作用机制,为研究射干抗三阴性乳腺癌的先导化合物提供了重要基础。

关键词： 三阴性乳腺癌   p21蛋白激活激酶1   蛋白靶向水解嵌合体技术   细胞凋亡  

摘要： 乳腺癌是全球范围内最高发的女性恶性肿瘤之一,严重危害女性生命健康。三阴性乳腺癌（TNBC）是雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体2（HER2）基因均为阴性的乳腺癌亚型,由于缺乏有效的治疗靶标,且具有高侵袭性、易耐药的特点,临床上缺乏有效的治疗药物。寻找具有新机制的靶向治疗药物是解决三阴性乳腺癌临床治疗难题的关键。 p21蛋白激活激酶1（PAK1）是丝/苏氨酸特异性蛋白激酶,其过表达或异常激活将促进肿瘤细胞获得生长信号自主性、逃避细胞凋亡,促进侵袭和转移,是一个新型的抗肿瘤药物靶标。目前报道的PAK1抑制剂存在选择性差、生物活性弱等问题,限制了其进一步开发。蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）是一种通过细胞自身降解蛋白质途径降解靶蛋白的技术,为提高靶向药物的成药性、克服耐药提供了新思路。 本课题采用PROTAC技术,以吡啶并[2,3-d]嘧啶-7（8H）-酮为母核,选取不同长度碳链和PEG链作为连接子,分别与E3泛素连接酶（VHL、CRBN）的配体相连接,设计合成了35个PAK1-PROTAC候选小分子化合物。体外抗增殖实验和PAK1降解实验相结合发现18s具有较好的抗增殖活性(MDA-MB-231细胞,IC50=1.27μM)和PAK1降解活性（71%,2.5μM）。细胞克隆实验以及Ki-67免疫荧光实验进一步证明18s具有对MDA-MB-231细胞显著的抗增殖活性。细胞迁移和侵袭实验证明18s能够抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭。细胞内降解实验表明18s能够显著的降解细胞内PAK1的含量,进而抑制其介导的ERK1/2的激活,从而诱导MDA-MB-231细胞发生显著的凋亡。 综上,本课题基于PROTAC的策略,设计合成并发现了一个强效的PAK1-PROTAC小分子化合物,为PAK1降解剂治疗TNBC提供了候选药物和理论依据。