关键词： 三阴性乳腺癌   p21蛋白激活激酶1   蛋白靶向水解嵌合体技术   细胞凋亡  

摘要： 乳腺癌是全球范围内最高发的女性恶性肿瘤之一,严重危害女性生命健康。三阴性乳腺癌（TNBC）是雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体2（HER2）基因均为阴性的乳腺癌亚型,由于缺乏有效的治疗靶标,且具有高侵袭性、易耐药的特点,临床上缺乏有效的治疗药物。寻找具有新机制的靶向治疗药物是解决三阴性乳腺癌临床治疗难题的关键。 p21蛋白激活激酶1（PAK1）是丝/苏氨酸特异性蛋白激酶,其过表达或异常激活将促进肿瘤细胞获得生长信号自主性、逃避细胞凋亡,促进侵袭和转移,是一个新型的抗肿瘤药物靶标。目前报道的PAK1抑制剂存在选择性差、生物活性弱等问题,限制了其进一步开发。蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）是一种通过细胞自身降解蛋白质途径降解靶蛋白的技术,为提高靶向药物的成药性、克服耐药提供了新思路。 本课题采用PROTAC技术,以吡啶并[2,3-d]嘧啶-7（8H）-酮为母核,选取不同长度碳链和PEG链作为连接子,分别与E3泛素连接酶（VHL、CRBN）的配体相连接,设计合成了35个PAK1-PROTAC候选小分子化合物。体外抗增殖实验和PAK1降解实验相结合发现18s具有较好的抗增殖活性(MDA-MB-231细胞,IC50=1.27μM)和PAK1降解活性（71%,2.5μM）。细胞克隆实验以及Ki-67免疫荧光实验进一步证明18s具有对MDA-MB-231细胞显著的抗增殖活性。细胞迁移和侵袭实验证明18s能够抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭。细胞内降解实验表明18s能够显著的降解细胞内PAK1的含量,进而抑制其介导的ERK1/2的激活,从而诱导MDA-MB-231细胞发生显著的凋亡。 综上,本课题基于PROTAC的策略,设计合成并发现了一个强效的PAK1-PROTAC小分子化合物,为PAK1降解剂治疗TNBC提供了候选药物和理论依据。

关键词： 细胞穿膜肽   SN38   三阴性乳腺癌   抗转移   胶束  

摘要： 三阴性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌中最具侵袭性、预后最差的一种亚型,其主要特征表现为高概率的远端转移,有20%的TNBC患者在五年内死于转移性疾病进展。研究表明,7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)对TNBC细胞有显著的杀伤能力,并且前期研究发现SN38对TNBC的转移也具备一定的抑制作用。但是SN38的溶解性极差,在体内有效递送和渗透肿瘤组织存在障碍,不能直接应用于临床。通过细胞穿膜肽修饰的两亲性胶束可以有效地改善上述问题,但需要其对肿瘤细胞具有一定的选择性蓄积能力。本研究采用亲水性的聚乙二醇(PEG)与SN38疏水端相连,合成PEG-SN38前药,并选取了细胞穿膜肽TAT修饰PEGSN38,TAT-PEG-SN38在水溶液中自组装形成胶束。TAT-PEG-SN38胶束极大地改善了SN38的水溶性,TAT的引入也增强了胶束对肿瘤细胞的选择性摄取能力和对肿瘤组织的渗透能力,有效抑制了TNBC的肿瘤活性和远端转移。作为新型、高效且安全的抗TNBC药物,具有潜在的临床应用前景,值得作进一步的深入研究。本研究主要包括以下内容:1、TAT-PEG-SN38的合成及表征利用PEG作为linker两端连接TAT和SN38以制备TAT-PEG-SN38。两亲性的TAT-PEG-SN38在水相溶液中可以自组装形成胶束,粒径约为142 nm,电位约为+8.44 m V;通过扫描电镜观察胶束形态为均匀的近球体,胶束溶解性、稳定性良好,粒径、电位适中可以满足体内外药效评价条件。2、TAT-PEG-SN38的体外抗肿瘤效果研究TAT-PEG-SN38对鼠源三阴性乳腺癌细胞系4T1细胞和人源三阴性乳腺癌BT-549具有显著的细胞毒性:对于4T1细胞系,经过TAT的修饰,PEG-SN38的细胞毒性提高了3.61倍;而对于BT-549细胞系,TAT-PEG-SN38组的细胞杀伤效果也明显高于SN38、CPT-11和PEG-SN38。TAT-PEG-SN38对肿瘤细胞的毒性增强是由于细胞穿膜肽修饰改善了PEG-SN38的细胞摄取能力,与PEGSN38相比,4T1和BT-549细胞对TAT-PEG-SN38的细胞摄取强度分别提高了4.2倍和1.7倍。引入正常乳腺上皮细胞HC-11细胞系作为参照分析TAT修饰对肿瘤细胞的选择性,发现TAT-PEG-SN38的摄取与PEG-SN38相比并未有显著增强,可能由于细胞表面电荷差异,TAT-PEG-SN38对肿瘤细胞的内化具有一定的选择性。以3D肿瘤球模型模拟TAT-PEG-SN38的肿瘤穿透能力,孵育24 h后TAT-PEG-SN38渗透进入肿瘤球内部,PEG-SN38仅存在于肿瘤球表面,并且TAT-PEG-SN38明显抑制了肿瘤球的生长。上述实验证明,TAT-PEG-SN38能选择性地被肿瘤细胞摄取,并渗透进入肿瘤内部,具有优越的体外抗肿瘤活性。3、TAT-PEG-SN38的体内抗肿瘤活性评价建立小鼠乳腺癌原位荷瘤模型,对TAT-PEG-SN38的体内抗肿瘤效果进行评价:活体成像结果表明静脉注射胶束8 h后,TAT-PEG-SN38在肿瘤部位有效蓄积,进一步证明TAT能够将药物有效递送到肿瘤区域增强摄取。与Control组相比,TAT-PEG-SN38抑制了52.42%的肿瘤增长,抑制效果是PEG-SN38的1.57倍。通过对肺组织转移情况观察,可以发现TAT-PEG-SN38组对TNBC在体内器官的转移抑制效果明显高于其余给药组。病理性切片分析验证了同样的结果,除TAT-PEG-SN38组外,肿瘤向肝脏和肺脏均出现了不同程度的转移。由此可见,TAT-PEG-SN38明显改善了4T1小鼠荷瘤模型中的器官转移情况。通过免疫组化分析发现,与其他组相比,TAT-PEG-SN38组的抗原CD31的表达量最低,说明TAT-PEG-SN38组可有效抑制肿瘤新生血管的生成。TAT修饰显著提高了PEG-SN38的体内TNBC抗肿瘤效果,抑制了TNBC远端转移。4、TAT-PEG-SN38的抗转移研究首先,在细胞水平考察TAT-PEG-SN38对4T1和BT-549两种细胞系的转移抑制能力:通过细胞划痕愈合和Transwell细胞迁移的研究可以发现,TAT-PEGSN38划痕愈合率分别仅为16.17%、22.19%;,而在Transwell细胞迁移实验中,TAT-PEG-SN38处理组的细胞几乎未发生迁移。和对照组相比,CPT-11并未显著抑制细胞的迁移,TAT-PEG-SN38显著改善了CPT-11的细胞转移抑制能力。通过蛋白质组学对小鼠肿瘤组织的蛋白表达差异分析发现,相比于对照组,TAT-PEG-SN38给药组中有15种蛋白的表达发生了上调,29种蛋白发生了下调,其中与肿瘤转移相关的蛋白中包括DSG2和LDLR、JUP蛋白,并通过

关键词： Actein   Toosendanin   构效关系   三阴性乳腺癌  

摘要： 本论文共有三章组成,第一章介绍了中药升麻中actein的结构修饰及抗三阴性乳腺癌活性研究,第二章介绍了中药川楝子中toosendanin的结构修饰及抗三阴性乳腺癌的活性研究,第三章介绍了中药单体成分抗三阴性乳腺癌的研究进展。第一章升麻中actein的结构修饰及抗三阴性乳腺癌活性Actein是从中药升麻（Cimicifuga foetida）的根状茎中分离出来的三萜皂苷,此前已被证明在乳腺癌的治疗中具有潜力,但存在活性不高的问题。在此基础上,我们设计并合成了一系列抗三阴性乳腺癌（TNBC）抑制剂actein的衍生物,并对衍生物进行体外抗三阴性乳腺癌活性评价,其中最具潜力的衍生物1-27对人TNBC细胞株HCC1806和MDA-MB-231具有显著的抑制活性,IC值分别为2.78和9.11μM,并讨论了actein衍生物的构效关系。此外,初步机制研究发现,1-27在S期阻滞细胞周期显著抑制癌细胞增殖;Western blot结果显示,化合物1-27诱导p21呈剂量依赖性积累,并可能激活MAPK的p38通路从而诱导细胞凋亡。以上结果表明1-27具有开发作为先导化合物的潜力,具有Actein骨架的化合物是一类有前途的治疗TNBC的新型抑制剂。第二章川楝子中toosendanin的结构修饰及抗三阴性乳腺癌活性Toosendanin（TSN）是从中药川楝子（Melia toosendan Sieb et Zucc）中分离出来的抗肿瘤化合物。然而,先前的研究表明TSN治疗三阴性乳腺癌（TNBC）的效果仍不理想。在这项工作中,我们研究了TSN及其衍生物对MDA-MB-231和HCC1806细胞株的作用。结果表明,TSN及其衍生物2-11具有良好的抗肿瘤活性。初步机制研究表明,TSN和2-11均可诱导HCC1806细胞周期S期阻滞和G2/M期细胞数量减少。此外,TSN和2-11降低了p53的蛋白水平以及AKT和ERK的磷酸化,也诱导了p21和p-p38蛋白的积累。第三章中药单体成分抗三阴性乳腺癌的研究进展本章围绕中药单体成分抗三阴性乳腺癌的研究进行综述,主要从植物、动物、矿物中提取分离得到的单体化合物及其衍生物的抗TNBC活性研究;此外还对中药单体联合抗癌药物紫杉醇、顺铂、阿霉素等治疗TNBC进行阐述。希望可以为后期抗三阴性乳腺癌的药物研究提供参考。

关键词： 三阴性乳腺癌   PAK1   HDAC6   靶向药物   抗增殖  

摘要： 三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）是乳腺癌中恶性程度最高的亚型,其特点是雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）阴性的同时缺乏原癌基因HER-2的过表达,因异质性高、侵袭性强、远端转移等特点,三阴性乳腺癌的临床治疗已成为乳腺癌研究领域的难点,临床上尚未有有效的治疗方法,常规化疗仍是该亚型临床最主要的治疗手段。鉴于三阴性乳腺癌的高度异质性,常规单靶向药物大多以失败告终,寻找新的双靶治疗靶标并设计合成全新的双靶向小分子已成为三阴性乳腺癌药物研究的热点。 PAK1在肿瘤的整个进程中发挥着重要作用,其几乎参与了肿瘤调控的每一个阶段,包括肿瘤的发生发展、转移、凋亡及耐药等。PAK1的异常过表达与肿瘤患者的生存期呈负相关。HDAC6是组蛋白去乙酰化酶的重要成员之一,HDAC6通过调控组蛋白乙酰化水平来影响肿瘤的发生和增殖、致癌基因和抑癌基因的平衡,当其修饰紊乱时会导致基因表达异常,影响细胞重要的生理功能,进而导致肿瘤的形成。 在本研究中,鉴于PAK1在调节能量代谢和HDAC6在表观遗传修饰方面的重要作用,我们认为双靶向PAK1和HDAC6可能是治疗TNBC的一种有效新策略。本论文基于结构虚拟筛选和协同药效团融合的策略,设计合成了45个以吡啶[2,3d]嘧啶-7（8H）为母核的新型PAK1/HDAC6双靶抑制剂。体外酶活性测试和抗乳腺癌细胞增殖实验结果表明22l是一个新型的强效的PAK1/HDAC6双靶抑制剂,其IC50分别为38.23 n M和13.62 n M,对MDA-MB-231细胞显示出强效的抗增殖作用,IC50为0.9μM。通过分子对接和动力学模拟阐明了化合物22l与PAK1和HDAC6的结合模式及结合自由能。在酶亚型选择性实验中,化合物22l对HDACs和PAKs家族蛋白中的HDAC6和PAK1亚型蛋白具有一定的选择性。化合物22l也能够在MDA-MB-231细胞水平上同时抑制PAK1和HDAC6的活性。SPR和CETSA实验进一步证实了化合物22l对PAK1/HDAC6的靶向性。在TNBC异种移植瘤裸鼠模型中,化合物22l显示出良好的抗肿瘤作用。 综上所述,本论文设计合成了一系列新型的PAK1/HDAC6双靶抑制剂,其中化合物22l是一个选择性的强效的PAK1/HDAC6双靶抑制剂,在体内外均对三阴性乳腺癌显示出治疗活性,这为PAK1/HDAC6双靶抑制剂治疗三阴性乳腺癌提供了候选药物和理论依据。

关键词： 三阴性乳腺癌   适配体   雷公藤甲素   缩醛酯连接键   靶向治疗药物  

摘要： 三阴性乳腺癌(TNBC)是指雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体均为阴性的乳腺癌亚型,占所有乳腺癌病理类型的15%-25%。由于TNBC具有特殊的生物学行为和临床病理特征,是侵袭性最强、预后最差的乳腺癌亚型,其常规治疗方法包括手术、放疗、化疗及免疫治疗,其中化疗仍是三阴性乳腺癌的标准治疗方式,目前尚无针对性的靶向治疗方法。研究表明,核仁素在多种肿瘤细胞中过表达,且广泛表达与TNBC细胞膜表面。核酸适配体AS1411是一种由26个碱基组成的高水溶性单链寡核苷酸,能够特异性与TNBC细胞表面过表达的核仁素以高亲和性结合。雷公藤甲素(TP)是一种广谱高效的抗癌药,具有多种抗癌机制,可诱导多种肿瘤细胞的凋亡,包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌等,抗肿瘤活性优于顺铂、阿霉素、紫杉醇等传统的抗癌药物。但由于其水溶性差和缺乏肿瘤靶向性,存在严重的毒副反应,其临床运用受到极大限制。由此,基于肿瘤的靶向治疗和药物的精准释放技术,本课题设计了合成一种p H高度敏感的核酸适配体AS1411-雷公藤甲素偶合物(AS-TP),用于靶向治疗三阴性乳腺癌。主要研究内容及结果如下:首先,采用丁二酸酐和烯丙醇为原料,设计合成了一种新型酸敏感性连接键,并将TP与核酸适配体AS1411通过该连接键进行偶联,合成了核酸适配体AS1411-雷公藤甲素偶合物。随后,采用HPLC测定AS-TP的血清稳定性、酸敏感性性及水溶性,结果证明AS-TP可在血清中保持稳定不分解,且易在弱酸微环境下断裂释放雷公藤甲素原药,进一步的水溶性测定证明与TP相比,AS1411偶联可显著提高TP的水溶性。随后,采用分子对接技术和生物分子相互作用分析仪测定了AS-TP与核仁素蛋白的亲和力,结果证明AS1411偶联可显著提高TP与核仁素蛋白的靶向性,细胞免疫荧光显示AS-TP与核仁素蛋白具有优异的共定位效果。进一步采用流式细胞术测定了核仁素表达量不同的细胞对羟基荧光素标记的AS-TP的摄取能力,细胞对FAM-AS-TP的摄入量与核仁素蛋白的表达量相关三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞高摄取FAM-AS-TP,AS1411可竞争性抑制MDA-MB-231对AS-TP的摄入及AS-TP有对MDA-MB-231的细胞毒性。采用MTT实验测定了AS-TP对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用及对正常细胞的细胞毒性,结果证明AS1411偶联可显著增强TP的抗肿瘤作用并降低其对正常细胞的细胞毒性,流式细胞术分析显示AS-TP发挥与TP相似的抗肿瘤机制,其主要通过诱导MDA-MB-231细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡发挥抗TNBC作用。进一步研究表明,AS-TP主要通过降低MDA-MB-231细胞线粒体膜电位水平、促进细胞内活性氧生成及激活线粒体凋亡途径发挥抗TNBC作用。为了进一步验证AS-TP的体内分布及体内抗肿瘤作用,本论文构建了三阴性乳腺癌荷瘤小鼠模型。小动物活体成像实验表明,AS-TP可显著蓄积于TNBC肿瘤组织并主要通过肝、肾组织代谢。体内疗效实验发现,AS-TP可发挥高效的体内抗TNBC作用,其可显著损伤肿瘤组织、诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤组织增殖。体内生物安全性表明,在有效治疗剂量条件下,AS-TP并未对小鼠正常组织结构造成病理损伤,同时血生化数据表明AS-TP并未引起小鼠肝、肾指标变化,这表明AS-TP具有较好的体内生物安全性。

关键词： 三阴性乳腺癌   细胞周期依赖性激酶7   RNA聚合酶Ⅱ   THZ1   ZJC-11  

摘要： 研究目的 三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）是一种侵袭性乳腺癌,没有雌激素受体（Estrogen receptor,ER）,孕激素受体（progesterone receptor,PR）和人表皮生长因子受体-2（Human epidermal growth factor receptor-2,HER2）的表达。它是一种高度转移的异质性疾病,占乳腺癌总病例的10-15%,与非TNBC病例相比,治疗后五年内预后较差,复发率高。TNBC肿瘤的诊断和亚型对于确定治疗方案并为每个TNBC个体建立个性化,有针对性的药物至关重要。CDK7是细胞周期蛋白家族（Cyclin-dependent kinase,CDK）的重要成员之一,其参与调节多种生物过程,如细胞周期、基因转录和DNA修复。研究显示CDK7在TNBC中显著高表达,与TNBC临床预后显著相关,并形成肿瘤发生的驱动力,因此靶向CDK7可能成为治疗TNBC发生发展有效手段之一。本课题组前期合成并筛选了CDK7抑制剂THZ1的结构改造物——ZJC-11,发现其可能具有抗TNBC作用。因此本研究探究了ZJC-11药物代谢与动力学特征,阐述了ZJC-11对TNBC细胞周期、转录以及DNA修复的影响机制,提供了靶向CDK7可作为抗TNBC的可行性证据,进一步为临床开发更多高效的CDK7抑制剂提供参考。 研究方法 一、CDK7抑制剂ZJC-11的药代动力学及抗TNBC药效学研究 1.通过MTT实验筛选15个THZ1结构改造化合物的抗TNBC细胞活性,得到化合物ZJC-11; 2.通过药代动力学研究ZJC-11的药代动力学特征,KM小鼠单次尾静脉给予10mg/kg ZJC-11和10mg/kg THZ1,在给药后5min、10min、15min、30min、1h、2h取眼眶静脉血,分离得到含药血浆,样品经前处理后采用HPLC/MS检测样品血药浓度,再用DAS 3.0软件计算主要药代动力学参数(如t1/2、AUC、CL等),并拟合药时曲线。 3.通过MTT检测ZJC-11对TNBC细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-468）与ER/PR+细胞系（ZR-75-1）细胞活力的影响; 4.通过细胞克隆和明场下观察ZJC-11对TNBC细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-468）与ER/PR+细胞系（ZR-75-1）细胞增殖和细胞形态的影响; 5.通过流式细胞术和荧光检测ZJC-11对TNBC细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-468）与ER/PR+细胞系（ZR-75-1）细胞死亡的诱导作用; 6.通过流式细胞术检测ZJC-11对TNBC细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-468）与ER/PR+细胞系（ZR-75-1）细胞周期和细胞活性的影响; 7.通过Western Blot检测ZJC-11对TNBC细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-468）、ER/PR+细胞系（ZR-75-1）以及肿瘤组织中CDK7和RNAPII的磷酸化蛋白水平的影响; 8.通过建立BALB/c裸鼠体内MDA-MB-231细胞原位移植瘤模型,腹腔注射给予4mg/kg和8mg/kg ZJC-11,观察ZJC-11对裸鼠肿瘤生长及体重的影响; 9.通过免疫组化检测ZJC-11对细胞增殖标志物Ki67的影响。 二、CDK7抑制剂ZJC-11抗TNBC的机制研究 1.通过体外激酶活性实验检测ZJC-11对CDK2、CDK7以及CDK9的选择性抑制作用; 2.通过分子对接模型验证ZJC-11与CDK7的结合作用; 3.通过转录组学分析ZJC-11对TNBC细胞系（MDA-MB-231）基因转录的影响; 4.通过Reactome富集分析探究ZJC-11诱导细胞衰老的作用。 研究结果 一、CDK7抑制剂ZJC-11的药代动力学及抗TNBC药效学研究 1.通过对15个化合物的抗TNBC活性筛选发现,ZJC-11能够抑制MDA-MB-231细胞活力,且IC50均高于其余化合物; 2.药代动力学实验结果显示,与THZ1相比,ZJC-11的AUC、C0、Cmax明显较高,而Tmax较低,这表明ZJC-11在血浆中暴露量比THZ1大。相反,ZJC-11的Vd和CL更低,这表明了ZJC-11的清除率更高,并且其在体内的分布更窄。 ***实验结果表明,相比ER/PR+乳腺癌细胞ZR-75-1,ZJC-11分别处理TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468 48h和72h后能显著降低细胞活力,并且具有较好的时间依赖性和剂量依赖性; 4.细胞克隆实验及明场观察细胞结果表明,相比ER/PR+乳腺癌细胞ZR-75-1,ZJC-11能显著改变TNBC细胞MDA-MB-

关键词： 三阴性乳腺癌   细胞周期蛋白依赖性激酶7   N76-1   细胞周期,凋亡  

摘要： 1背景:目前,乳腺癌的治疗手段主要包括手术治疗、化疗、放疗、内分泌治疗和靶向治疗。然而,三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)因缺乏雌激素受体(Estrogen receptor,ER)、孕激素受体(Progesterone receptor,PR)、人表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2)的表达,对靶向治疗或内分泌治疗几乎无效,除化疗外尚无其他有效的全身治疗措施。但是,遗传高度特异性的TNBC具有相对统一的转录程序,该程序异常依赖于细胞周期蛋白依赖性激酶7(Cyclin dependent kinases 7,CDK7)。因此CDK7被认为是TNBC有潜力的治疗靶点,CDK7抑制剂的开发对TNBC有效治疗策略的研发具有重要意义。在这项研究中,我们通过将共价CDK7抑制剂THZ1的侧链连接到ALK抑制剂色瑞替尼的母核,获得了新型CDK7的抑制剂N76-1。本研究旨在阐明N76-1抗TNBC的作用和潜在机制,以期为TNBC新药开发提供新的策略和研究基础。方法:一、CDK7抑制剂N76-1抗TNBC作用研究1.以TNBC乳腺癌细胞系MDA-MB-231、CAL-148、MFM-223细胞和ER+乳腺癌细胞系ZR-75-1为研究对象,采用MTT实验以及平板克隆实验检测N76-1对TNBC细胞活力和增殖的影响;2.高内涵细胞成像系统分析N76-1对TNBC细胞迁移的影响;3.采用流式细胞术检测N76-1对MDA-MB-231、CAL-148和MFM-223细胞周期的影响;Western blot检测N76-1对细胞周期相关蛋白:细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(Cyclin-dependent kinase 1,CDK1)及磷酸化CDK1(p-CDK1)表达的影响;4.采用流式细胞术检测N76-1对MDA-MB-231、CAL-148和MFM-223细胞凋亡的影响;Western blot检测N76-1对细胞凋亡相关蛋白:多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(Poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)、Cleaved-PARP、胱天蛋白酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase3,Caspase3)、Cleaved-Caspase3表达的影响;5.4周龄KM小鼠,尾静脉注射N76-1(3mg/kg)和THZ1(3mg/kg)后,不同时间点取血,并分离淡黄色含药血浆,使用液质联用色谱检测血药浓度,分析N76-1和THZ1在小鼠体内的代谢情况。6.建立MDA-MB-231细胞株裸鼠原位移植瘤模型,以每天两次的频率腹腔注射阳性对照THZ1(10mg/kg)以及N76-1(4 mg/kg和2mg/kg)共21天,评估N76-1体内抗肿瘤作用;7.苏木精—伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)检测N76-1对裸鼠脏器生理结构的影响;免疫组织化学染色(Immunohistochemistry staining,IHC)检测N76-1对裸鼠原位移植瘤Ki67表达水平的影响。二、N76-1抗TNBC作用机制研究1.蛋白激酶实验检测N76-1对细胞周期蛋白依赖性激酶1(Cyclin-dependent kinase 1,CDK1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(Cyclin-dependent kinase 2,CDK2)、CDK7细胞周期蛋白依赖性激酶9(Cyclin-dependent kinase 9,CDK9)和细胞周期蛋白依赖性激酶12(Cyclin-dependent kinase 12,CDK12)5个激酶的半抑制浓度,初步评估N76-1的靶点选择性;Western blot检测N76-1对CDK7蛋白表达水平和CDK7下游蛋白RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase II,RNAPⅡ)的表达水平及其磷酸化水平的影响;2.使用分子对接预测N76-1与CDK7的结合位点以及结合能;细胞热转移分析(Cellular Thermal Shift Assay,CETSA)实验检测N76-1与CDK7结合作用;3.使用si RNA敲低CDK7,流式细胞术检测CDK7和N76-1对TNBC细胞细胞活力、周期和凋亡的影响;4.N76-1处理三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞48 h,收集细胞,提取RNA,经转录组学测序,分析N76-1对MDA-MB-231细胞全基因组转录水平的影响;Reactome富集分析、GO富集分析和GSEA富集分析N76-1调控的三阴性乳腺癌的可能作用机制并检测关键基因转录水平和蛋白表达水平;

关键词： 三阴性乳腺癌   丹参酮ⅡA   G蛋白偶联雌激素受体   细胞迁移   基质金属蛋白酶9  

摘要： 目的:基于体外细胞实验,探索丹参酮ⅡA对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移的抑制作用及其分子机制。方法:选取三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,利用细胞增殖实验检测丹参酮ⅡA对MDA-MB-231细胞增殖的作用,并筛选适宜的药物浓度;应用划痕实验检测丹参酮ⅡA对MDA-MB-231细胞迁移率的影响;Western Blot法检测丹参酮ⅡA对G蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor,GPER)及基质金属蛋白酶9(Matrix metalloprotein-9,MMP-9)表达的影响。结果:细胞增殖实验结果显示,丹参酮ⅡA可以抑制MDA-MB-231细胞增殖,且呈剂量依赖性(P<0.05);划痕实验结果显示,丹参酮ⅡA可以抑制MDA-MB-231细胞迁移,且呈剂量依赖性(P<0.01),加入GPER特异性抑制剂G15后迁移率有所上升(P<0.01)。Western Blot结果显示,丹参酮ⅡA可以显著下调GPER和MMP-9蛋白的表达水平并呈剂量依赖性(P<0.05),加入GPER特异性抑制剂G15后,MMP-9表达有所上升(P<0.01)。结论:丹参酮ⅡA可以抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移,其机制可能与抑制GPER介导的MMP-9表达相关。

关键词： 三阴性乳腺癌   Pin1-YAP/TAZ信号通路   华蟾素注射液  

摘要： 三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌中最具侵袭性的分子亚型。其特征是孕激素受体(progesterone receptor,PR)、雌激素受体(estrogen receptor,ER)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)不表达。国内外目前主要采用放、化疗的方式进行治疗,但毒副作用明显,而且化疗药物容易产生耐药性。因此,迫切需要使用更有效、毒性更小的药物来治疗TNBC。中药在肿瘤的预防和治疗方面具有独特的优势,中药复方中蕴含多种活性成分,可通过多个靶点、多种途径发挥增效作用,且作用温和。华蟾素注射液(cinobufacini injection,CI)是由中华大蟾蜍皮加工制成的,微黄色或淡黄色的水溶性制剂,具有抗癌谱广、高效低毒的特点。临床上用于包括TNBC在内的多种肿瘤的治疗,但其分子机制及作用靶点尚不明确。Pin1-YAP/TAZ是近年来研发抗肿瘤药物的热点信号通路。其中,肽基脯氨酰顺反异构酶NIMA相互作用蛋白1(peptidylprolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1,Pin1)被认为是一种新的诊断TNBC的生物标志物,Yes相关蛋白(Yes-Associated Protein,YAP)/PDZ结合域的转录共刺激因子(transcriptional co-activator with PDZbinding motif,TAZ),作为Hippo通路的两个核心成分在肿瘤发生和耐药性中起关键作用。有研究发现,在TNBC中Pin1可以与YAP/TAZ相互作用,提示靶向Pin1-YAP/TAZ信号通路的药物,可能有助于TNBC的临床治疗。首先,研究华蟾素注射液在体内外对TNBC的影响。动物实验表明,华蟾素注射液对荷瘤小鼠肿瘤起到抑制生长的作用,与阿霉素相比,华蟾素注射液对小鼠的体重、脏器没有影响,提示药物的毒副作用小;TNBC细胞的CCK8、克隆形成实验表明,华蟾素注射液可以抑制人源的MDA-MB-231细胞和鼠源的4T1细胞的增殖,且具有一定的时间、剂量依赖性;通过流式细胞分析术进行细胞凋亡、周期检测,结果表明华蟾素注射液可以诱导TNBC细胞周期阻滞,使MDA-MB-231细胞在G2/M期受到阻滞,4T1细胞在S期受到阻滞,最终诱导TNBC细胞发生凋亡;western blot的结果证实,华蟾素注射液通过下调CDK1、CDK2和Bcl-2/Bax蛋白水平,诱导细胞发生周期阻滞和凋亡。其次,基于癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库进行临床数据挖掘,结果表明,与正常组织相比,Pin1和TAZ在乳腺癌中过表达;与其他乳腺癌相比,晚期乳腺癌中Pin1和TAZ的表达水平升高,在第4期最为显著;与正常组织以及其他乳腺癌亚型的组织相比,Pin1和TAZ在TNBC中表达更高,表达水平与生存率负相关。尽管YAP的表达在TNBC患者中不是最高的,但在TNBC患者中,YAP表达越高,患者生存率也越低。利用免疫组织化学法将虚拟数据与现实世界的真实病例对接,结果显示,TNBC组织中Pin1、YAP和TAZ的阳性表达率分别为60%、56%和56%,与癌旁组织相比,在TNBC组织中Pin1和TAZ阳性表达率显著升高(P<0.05),YAP升高,但无显著差异(P>0.05),Pin1、YAP、TAZ的表达与一些临床病理特征无关,如肿瘤分期、有无淋巴转移等(P>0.05)。相关性分析表明,TNBC患者组织中Pin1与YAP(r=0.577,P<0.05)、TAZ(r=0.645,P<0.05)的表达均呈显著正相关关系。为了进一步明确Pin1与YAP、TAZ的相关性,在TNBC细胞采用si RNA的方法敲减Pin1后,YAP、TAZ的表达明显下调。上述实验结果提示,Pin1-YAP/TAZ是TNBC的核心信号通路之一。最后,研究华蟾素注射液抗TNBC的分子机制。RNA-seq结果表明,华蟾素注射液可以影响TNBC中的多种信号通路,其抗TNBC的作用机制可能与调控Pin1-YAP/TAZ信号通路相关。Western blot结果显示华蟾素注射液不仅能够下调TNBC细胞系MDA-MB-231和4T1细胞中Pin1、YAP、TAZ的表达,还可以下调TNBC肿瘤中Pin1、YAP、TAZ的表达,这些结果表明华蟾素注射液通过抑制Pin1-YAP/TAZ信号通路,发挥抗TNBC的作用。综上所述,我们采用体内、外实验,明确了华蟾素注射液通过诱导细胞周期阻滞和凋亡发挥抗TNBC的药效;综合运用TCGA数据库和转录组学技术,探讨了其潜在的分子机制;本研