关键词： 三阴性乳腺癌   伏立诺他   顺铂   POLR2A   铁死亡  

摘要： 目的:探讨伏立诺他(Vorinostat,SAHA)及其促顺铂(Cisplatin,CDDP)抗三阴性乳腺癌作用及其潜在机制。方法:用不同浓度伏立诺他、顺铂及其联合用药处理POLR2A野生型的三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231和POLR2A杂合性缺失的三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-453后,通过CCK-8实验检测细胞活力,平板克隆形成实验检测细胞增殖能力,Western blot检测细胞内POLR2A、SLC7A11及GPX4蛋白表达水平,还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和脂质过氧化物(Lipid peroxide,LPO)试剂盒检测细胞内GSH及LPO水平。利用si RNA干扰MDA-MB-231细胞内POLR2A表达后,通过CCK-8实验检测POLR2A表达下调对细胞活力的影响,Western blot检测细胞内SLC7A11及GPX4蛋白表达水平的变化,GSH和LPO试剂盒检测细胞内GSH及LPO水平的变化。在BALB/c裸鼠皮下接种MDA-MB-231及MDA-MB-453细胞以建立两种不同的三阴性乳腺癌细胞异种移植肿瘤模型,腹腔注射伏立诺他、顺铂单药或其联合用药,通过测量给药期间裸鼠体重、肿瘤体积变化以及肿瘤重量来观察药物毒性及肿瘤生长情况;通过免疫组化和免疫荧光试验分别检测肿瘤组织中POLR2A和SLC7A11表达水平。结果:CCK-8实验和平板克隆形成实验表明伏立诺他与顺铂均以剂量依赖性的方式抑制MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞的活力和增殖,而两者联合对三阴性乳腺癌细胞的抑制具有协同作用,且伏立诺他及其与顺铂联合用药对POLR2A杂合性缺失的MDA-MB-453细胞活力的抑制作用优于POLR2A野生型的MDA-MB-231细胞。Western blot、GSH及LPO试剂盒检测结果表明,伏立诺他可下调POLR2A,而顺铂对POLR2A无明显调节作用,但两者联合后POLR2A进一步下调;伏立诺他还可下调SLC7A11、GPX4、GSH水平、上调LPO水平促进三阴性乳腺癌细胞铁死亡,与顺铂联合后上述现象更加明显。si RNA转染实验表明下调POLR2A表达可抑制SLC7A11及GPX4的表达、降低细胞内GSH水平及升高LPO水平,从而诱导铁死亡,并增强伏立诺他及其与顺铂联合用药对POLR2A野生型三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231活力的抑制作用。动物实验结果表明伏立诺他、顺铂及其联合用药均可显著抑制三阴性乳腺癌细胞异种移植瘤的在体生长,且两者联合的效果优于单药;伏立诺他及其与顺铂联合用药对POLR2A杂合性缺失的三阴性乳腺癌细胞异种移植瘤的抑制作用显著优于野生型。免疫组化及免疫荧光试验结果表明伏立诺他及其与顺铂联合用药可降低移植瘤组织中POLR2A及SLC7A11的表达。结论:伏立诺他与顺铂可协同抑制三阴性乳腺癌细胞及其异种移植瘤的生长,且对POLR2A杂合性缺失的三阴性乳腺癌细胞的抑制作用优于POLR2A野生型的三阴性乳腺癌细胞,其机制与伏立诺他下调POLR2A的表达并诱导三阴性乳腺癌细胞铁死亡有关。而下调POLR2A表达可抑制铁死亡关键分子SLC7A11的表达、升高细胞内脂质过氧化物水平、增强伏立诺他及其与顺铂联合用药对POLR2A野生型的三阴性乳腺癌细胞的抑制作用。本研究为伏立诺他及其与顺铂联合抗三阴性乳腺癌的个体化精准治疗提供了实验依据。图8幅,表8个,参考文献77篇

关键词： 三阴性乳腺癌   FAK抑制剂   黏附斑   抗转移  

摘要： 开发黏附斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)抑制剂有望成为靶向治疗三阴乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)有效途径之一。然而,现有FAK抑制剂主要为激酶抑制剂,靶向高度保守的中心激酶催化域,缺乏对非酶催化功能的干预,对FAK的选择性也有待进一步提高,限制了其进一步临床应用。FAT(focal adhesion targeting)结构域位于FAK的C端,可通过多种途径调控FAK的非酶催化功能,对肿瘤细胞的粘附、存活、增殖、迁移发挥重要作用,已成为开发新型FAK抑制剂的前沿和热点。氯吡胺(chloropyramine,C4)是通过高通量筛选发现的首个靶向FAT域的FAK抑制剂,可抑制FAK-VEGFR-3的相互作用靶向FAT,进而抑制FAK的非酶催化功能。然而,C4及其现有衍生物的抗肿瘤活性仍有待进一步提高。本文基于优势片段的骨架跃迁原理,以C4为先导化合物,将其N-2位苄基取代基替换为含不同取代的天然肉桂酸片段,通过酰胺键进行偶联,设计、合成了19个C4衍生物9a-9s,旨在获得结构新颖、低毒高效且生物利用度更优的FAT域抑制剂,并考察其抗TNBC活性。生物活性研究结果表明:1.活性化合物9d对多种TNBC细胞的增殖抑制活性(IC=8.37-9.07μM)均明显优于C4。重要的是,9d对正常乳腺细胞MCF10A的毒性相对较低(IC=40.63μM),提示9d可在相对安全的剂量下有效抑制TNBC细胞增殖。2.化合物9d在体外能够剂量依赖性抑制高侵袭性TNBC细胞的侵袭和迁移。3.化合物9d有望通过插入FAT域在Y925附近的结合口袋,抑制关键位点Y925磷酸化,抑制FAK的功能。4.化合物9d可有效减少黏附斑(FAs)和应力纤维(SFs)的形成,并剂量依赖性诱导TNBC细胞凋亡。综上,以化合物9d为代表的C4衍生物为开发靶向FAT域的FAK抑制剂及其应用提供了新的思路,也为寻找与发现新型抗TNBC药物奠定了良好的基础。图18幅,表5个,参考文献52篇

关键词： 藤黄酸   地西他滨   光聚合水凝胶   三阴性乳腺癌   术后复发   伤口愈合   细胞焦亡  

摘要： 目的: 本课题以中药藤黄中的抗肿瘤活性成分藤黄酸（GA）和DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨（DEC）作为焦亡诱导药物,以聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEG-DMA）和甲基丙烯酰化丝胶蛋白（SER-MA）为载体,受中医理论指导下扶正祛邪治疗原则的启发,结合现代科学技术,采用光聚合法制备一种可以用于填充三阴性乳腺癌切除腔和防止肿瘤复发的水凝胶。并对水凝胶特性、体外抗肿瘤活性、体内外生物相容性,体内促伤口愈合能力及体内抗肿瘤药效进行评价。研究载藤黄酸-地西他滨水凝胶通过细胞焦亡途径对肿瘤复发和转移的抑制作用,为TNBC治疗中,抑制肿瘤复发和转移的药物和药物递送系统的选用和开发提供思路并奠定研究基础。 方法: （1）载药水凝胶的制备和表征。采取乳化溶剂挥发法制备藤黄酸PLGA纳米粒（GA NPs）,并对纳米粒进行基本表征。确立PEG-DMA和SER-MA混合的适宜比例,对PEG-DMA、SER-MA、PEG-DMA/SER-MA水凝胶的微观结构、光聚合前后结构变化、弹性模量、溶胀性能、硬度、孔隙率和体外药物释放等基本性质进行表征。选取亲水性荧光染料罗丹明B和疏水性荧光染料Di D分别模拟DEC和GA的体内药物释放规律。 （2）药物联合的作用机制研究。选取香豆素-6（C6）荧光探针模拟GA,考察C6和C6 NPs在细胞中的摄取情况;采用MTT法考察DEC和GA对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖活力的影响;通过q PCR实验确定DEC对4T1细胞中Gsdme基因表达的影响;测定DEC和GA药物作用后体外细胞的LDH释放率、细胞焦亡率、细胞形态、细胞迁移能力以及细胞内焦亡相关蛋白（GSDME-FL、GSDME-N、caspase-3和cleaved-caspase-3）的表达水平。 （3）水凝胶生物相容性评价。通过MTT法考察水凝胶浸提液对小鼠成纤维L929细胞增殖活力的影响;考察水凝胶浸提液的溶血活性;将水凝胶植入小鼠体内评估其体内生物相容性和体内降解;通过小鼠创面愈合模型评价水凝胶促伤口愈合的能力。 （4）载药PEG-DMA/SER-MA水凝胶的体内药效学评价和作用机制研究。通过在小鼠第四对乳腺脂肪垫注射4T1-luc细胞构建小鼠三阴性乳腺癌原位模型;将肿瘤手术切除后,原位光固化载GA NPs/DEC水凝胶填充手术空腔;通过活体动物成像系统监测肿瘤的复发和转移,记录小鼠的体重和肿瘤体积;通过免疫组化、免疫荧光和流式细胞术等实验评价GA NPs/DEC水凝胶的抗肿瘤活性以及对肺转移的抑制作用。 结果: （1）得到质地均匀,呈球形的GA NPs,粒径为216.8±5.5 nm,PDI为0.197±0.032,zeta电位为-22.31±0.46 m V,包封率为57.2±1.3%,载药量为5.2±0.2%;在4℃、室温和37℃的储存条件下,12天内纳米粒的粒径和PDI均表现出良好稳定性。通过处方优化得到的PEG-DMA/SER-MA水凝胶中两种材料的含量分别为:10%PEG-DMA（v/v）和5%SER-MA（w/v）;通过扫描电镜可以观察到PEG-DMA/SER-MA水凝胶具有更多孔的结构;激光共聚焦显示杂化水凝胶较单一水凝胶孔隙结构更完整,SER-MA水凝胶破碎点最多;FT-IR显示光交联不影响PEG-DMA和SER-MA的主要化学结构;弹性模量结果显示,PEG-DMA/SERMA水凝胶较2种单一水凝胶的模量更小,刚度更小;杂化水凝胶垂直和平行方向的压缩模量相差1.12倍;PEG-DMA、SER-MA和PEG-DMA/SER-MA水凝胶均不会明显溶胀;杂化水凝胶的硬度最小,孔隙率最高;体内外药物释放结果一致,DEC和罗丹明B可以在短时间内大量释放（分别为1 h和24 h）,GA和Di D可以在体内分别持续释放超过8天和28天。 （2）细胞摄取结果表明,C6 NPs的细胞摄取量明显多余游离C6,将药物包载于纳米粒中能够更有效促进细胞摄取,从而诱导细胞死亡;MTT结果表明GA对4T1细胞的增殖抑制呈剂量依赖性,IC50为0.12μmol/L,DEC的IC50为147μmol/L,低浓度DEC不具有抗肿瘤活性;q PCR实验表明,DEC在短时间内（12 h）能够有效提高4T1细胞中Gsdme基因的表达;流式结果显示DEC处理后的细胞提高细胞焦亡发生的可能性,与GA共同作用引起更多癌细胞的死亡;GA和DEC共同处理增加细胞中LDH的释放量;同时能够观察到细胞焦亡的典型形态,而单独药物作用的细胞不呈现明显焦亡形态;划痕实验表明,DEC和GA共同作用于4T1细胞能够有效抑制细胞迁移;WB实验中,检测到GA和DEC共同处理后的细胞中GSDME-N和cleaved-caspase-3的表达水平增加。 （3）将24 h水凝胶浸提液与L929细胞共同孵育,PEG-DMA

关键词： Z-没药甾酮   三阴性乳腺癌   网络药理学   抗肿瘤作用   转录组学  

摘要： 目的：　　本研究运用网络药理学结合转录组学，分析Z-没药甾酮干预三阴性乳腺癌（Triple-negativebreastcancer，TNBC）的关键靶点及分子机制并通过体内外实验进一步验证，为Z-没药甾酮作为天然化合物治疗三阴性乳腺癌提供药理学证据。　　方法：　　1.使用中药数据库TCMSP、TCMID收集筛选没药活性成分，利用SwissTargetPrediction数据库预测活性成分的潜在靶点，使用GeneCards数据库获取三阴性乳腺癌疾病靶点，二者取交集获得没药干预三阴性乳腺癌的潜在靶点，利用DAVID数据库进行GO和KEGG通路富集分析，利用Cytoscape3.7.1软件构建没药活性成分-潜在靶点-信号通路构建网络，并进行网络拓扑分析，筛选出没药甾酮（Guggulsterone，GS）作为没药干预三阴性乳腺癌的特征活性成分。　　2.通过CCK8细胞活性检测实验测试不同药物浓度的E/Z-GS处理TNBC细胞系MDA-MB-468和BT-549以及正常乳腺上皮细胞系MCF-10A后细胞活性的变化。Transwell实验检测不同药物浓度的GS对MDA-MB-468和BT-549细胞的迁移和侵袭能力的影响。　　3.采用RNA-seq技术分析经Z-GS处理的MDA-MB-468细胞基因水平的变化，筛选出差异基因并进行GO和KEGG富集分析。选择上调或下调排名前200的差异基因与网络药理学分析得到的差异基因取交集，获得Z-GS抗三阴性乳腺癌的核心靶点。采用KM-plot数据库评估核心靶点的临床预后价值，选择具有预后价值的靶点进行下一步分析。利用分子对接技术，将Z-GS与核心靶点进行对接，根据对接评分选择结合能力强的关键靶点作为后续研究对象。　　4.通过体内外实验验证Z-GS对三阴性乳腺癌关键靶点及信号通路的影响。　　结果：　　1.通过TCMSP、TCMID数据库筛选获得45个没药的活性成分，通过SwissTarget数据库预测活性成分的潜在靶点，筛选去重后，在24个活性化合物中预测出336个潜在靶点。通过GeneCards数据库获取三阴性乳腺癌相关疾病靶点1322个，与活性成分潜在靶点取交集得到136个交集靶点。通过DAVID数据库对交集靶点进行GO和KEGG富集分析。结果显示，没药可能通过正向调控凋亡过程、药物反应、负向调控细胞增殖、蛋白结合等作用影响三阴性乳腺癌。可能的作用通路包括癌症通路、蛋白多糖在癌症中的作用、PI3K-AKT信号通路。构建成分-靶点-通路网络，经拓扑分析后以度值评估节点在网络中的重要性。结果表明核心活性化合物是槲皮素、鞣花酸、没药甾酮、β-谷甾醇和天竺葵素。核心靶点是PGR、AR、NR3C2、CYP19A1和PTGS2。由于槲皮素、鞣花酸和β-谷甾醇在网络药理学分析中普遍存在，而没药甾酮作为没药的特征活性化合物被选择用于进一步研究。　　***8实验结果表明，E-GS对TNBC细胞系MDA-MB-468和BT-549的细胞活性无明显抑制作用。Z-GS处理TNBC细胞24小时后，对细胞活性抑制作用不显著，但在处理48和72小时后，Z-GS能够显著抑制MDA-MB-468和BT-549细胞的细胞活性，且具有浓度依赖性。同时Z-GS对正常乳腺上皮细胞MCF-10A无明显抑制作用;Transwell迁移和侵袭实验结果表明，Z-GS可以显著抑制TNBC细胞的迁移和侵袭能力。　　***-seq结果表明，MDA-MB-468细胞经Z-GS处理后有1488个上调基因以及2237个下调基因。KEGG和GO富集分析显示，Z-GS主要作用于细胞周期、p53信号通路、细胞衰老以及凋亡通路。选择上下调差异基因中排名前200的基因与网络药理学分析筛选的差异基因取交集得到14个关键靶点，经临床预后分析和分子对接评估，筛选出p53、CCNB1和PLK1为Z-GS在三阴性乳腺癌中发挥作用的关键靶点。　　4.流式细胞术结果表明，Z-GS能够将TNBC细胞周期阻滞在G2/M期并且促进细胞凋亡，差异具有统计学意义。实时荧光定量PCR和WesternBlot结果表明，Z-GS能够从mRNA和蛋白水平下调CCNB1和PLK1的表达，并且上调p53的表达。加入p53抑制剂PFT-α进行回复实验，结果证实Z-GS能够通过p53/CCNB1/PLK1轴对三阴性乳腺癌发挥抗肿瘤作用。以MDA-MB-468细胞构建裸鼠三阴性乳腺癌移植瘤模型，经Z-GS灌胃给药处理，结果表明Z-没药甾酮能够显著抑制裸鼠体内三阴性乳腺癌的增长。肿瘤组织免疫组化结果表明Z-GS下调了CCNB1和PLK1的表达水平，同时上调了p53的表达水平。　　结论：　　本研究采用网络药理学结合转录组测序分析方法，并通过体内外实验证实Z-GS可以显著抑制TNBC细胞的增殖，迁移，侵袭

关键词： 射干   活性成分   鸢尾型三萜   三阴性乳腺癌   作用机制  

摘要： 三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）是一种高度恶性肿瘤,占所有乳腺癌的15-20%。三阴性乳腺癌的孕激素受体（PR）、雌激素受体（ER）和人类表皮生长因子受体2（Her-2）均表现为阴性,具有侵袭性强、恶化程度高、预后差的特点。目前,化疗是其最重要的治疗方法,但后期化疗药物的耐药性导致临床效果不佳,所以,从天然植物资源中寻找治疗TNBC的活性成分是可行的策略。课题组前期经过高通量抗肿瘤活性筛选发现射干浸膏具有抗三阴性乳腺癌的潜力。 射干为鸢尾科射干属(Belamcanda chinensis（L.）DC)植物,其生长环境广泛,主要分布于东北亚,首次记录在公元300年的传统中医专著《神农本草经》中,其具有散结消炎、消肿止痛、解热、解毒等多种药理活性,长期应用于中医药治疗中。现代研究表明,射干中化合物具有抗宫颈癌、人骨肉瘤细胞、非小细胞肺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌等抗肿瘤作用,但尚无抗三阴性乳腺癌作用及其机制的报道,且对于其药效物质的提取分离及在生物学方面的活性机制暂不清楚。本课题旨在对射干进行药效物质基础研究的基础上,寻找结构新颖的活性化合物,并对其抗三阴性乳腺癌的作用机制阐述,从而为射干的进一步开发利用提供理论基础。 本课题通过大孔吸附树脂,硅胶,ODS,Sephadex LH-20等多种填料的柱层析和中低压、半制备液相、制备液相色谱等分离手段,并通过MS、NMR和旋光光谱等谱学数据进行结构鉴定,最后从射干中分离鉴定出22个单体化合物,包括黄酮类化合物（10个）、鸢尾型三萜（3个）、甾醇类化合物（2个）、二苯乙烯类（2个）及其他类化合物（4个）等,其中包括2个新化合物,5个从射干属中首次发现的化合物,丰富了射干结构多样性。此外,通过CCK8法实验对射干中抗三阴性乳腺癌活性成分追踪,发现鸢尾型三萜类化合物BC19、BC20具有抗三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞活性(IC50分别为15.74±1.04μM、26.97±2.68μM)。通过克隆形成实验、划痕实验和transwell实验发现BC19、BC20能显著地剂量依赖性抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞的增殖和迁移,通过细胞周期实验发现BC19、BC20能把三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞的细胞周期阻滞在G1期。通过线粒体膜电位检测、ROS实验、Annexin V-FITC/PI双染和Hoechst活细胞染色实验发现BC19、BC20能诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞凋亡从而发挥抗乳腺癌作用。 综上所述,本课题从射干根茎中分离并鉴定了22个化合物（新化合物2个、已知化合物20个）,并通过一系列细胞实验初步揭示了射干中鸢尾型三萜类化合物BC19、BC20的抗三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞的作用机制,为研究射干抗三阴性乳腺癌的先导化合物提供了重要基础。

关键词： 三阴性乳腺癌   p21蛋白激活激酶1   蛋白靶向水解嵌合体技术   细胞凋亡  

摘要： 乳腺癌是全球范围内最高发的女性恶性肿瘤之一,严重危害女性生命健康。三阴性乳腺癌（TNBC）是雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体2（HER2）基因均为阴性的乳腺癌亚型,由于缺乏有效的治疗靶标,且具有高侵袭性、易耐药的特点,临床上缺乏有效的治疗药物。寻找具有新机制的靶向治疗药物是解决三阴性乳腺癌临床治疗难题的关键。 p21蛋白激活激酶1（PAK1）是丝/苏氨酸特异性蛋白激酶,其过表达或异常激活将促进肿瘤细胞获得生长信号自主性、逃避细胞凋亡,促进侵袭和转移,是一个新型的抗肿瘤药物靶标。目前报道的PAK1抑制剂存在选择性差、生物活性弱等问题,限制了其进一步开发。蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）是一种通过细胞自身降解蛋白质途径降解靶蛋白的技术,为提高靶向药物的成药性、克服耐药提供了新思路。 本课题采用PROTAC技术,以吡啶并[2,3-d]嘧啶-7（8H）-酮为母核,选取不同长度碳链和PEG链作为连接子,分别与E3泛素连接酶（VHL、CRBN）的配体相连接,设计合成了35个PAK1-PROTAC候选小分子化合物。体外抗增殖实验和PAK1降解实验相结合发现18s具有较好的抗增殖活性(MDA-MB-231细胞,IC50=1.27μM)和PAK1降解活性（71%,2.5μM）。细胞克隆实验以及Ki-67免疫荧光实验进一步证明18s具有对MDA-MB-231细胞显著的抗增殖活性。细胞迁移和侵袭实验证明18s能够抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭。细胞内降解实验表明18s能够显著的降解细胞内PAK1的含量,进而抑制其介导的ERK1/2的激活,从而诱导MDA-MB-231细胞发生显著的凋亡。 综上,本课题基于PROTAC的策略,设计合成并发现了一个强效的PAK1-PROTAC小分子化合物,为PAK1降解剂治疗TNBC提供了候选药物和理论依据。

关键词： 细胞穿膜肽   SN38   三阴性乳腺癌   抗转移   胶束  

摘要： 三阴性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌中最具侵袭性、预后最差的一种亚型,其主要特征表现为高概率的远端转移,有20%的TNBC患者在五年内死于转移性疾病进展。研究表明,7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)对TNBC细胞有显著的杀伤能力,并且前期研究发现SN38对TNBC的转移也具备一定的抑制作用。但是SN38的溶解性极差,在体内有效递送和渗透肿瘤组织存在障碍,不能直接应用于临床。通过细胞穿膜肽修饰的两亲性胶束可以有效地改善上述问题,但需要其对肿瘤细胞具有一定的选择性蓄积能力。本研究采用亲水性的聚乙二醇(PEG)与SN38疏水端相连,合成PEG-SN38前药,并选取了细胞穿膜肽TAT修饰PEGSN38,TAT-PEG-SN38在水溶液中自组装形成胶束。TAT-PEG-SN38胶束极大地改善了SN38的水溶性,TAT的引入也增强了胶束对肿瘤细胞的选择性摄取能力和对肿瘤组织的渗透能力,有效抑制了TNBC的肿瘤活性和远端转移。作为新型、高效且安全的抗TNBC药物,具有潜在的临床应用前景,值得作进一步的深入研究。本研究主要包括以下内容:1、TAT-PEG-SN38的合成及表征利用PEG作为linker两端连接TAT和SN38以制备TAT-PEG-SN38。两亲性的TAT-PEG-SN38在水相溶液中可以自组装形成胶束,粒径约为142 nm,电位约为+8.44 m V;通过扫描电镜观察胶束形态为均匀的近球体,胶束溶解性、稳定性良好,粒径、电位适中可以满足体内外药效评价条件。2、TAT-PEG-SN38的体外抗肿瘤效果研究TAT-PEG-SN38对鼠源三阴性乳腺癌细胞系4T1细胞和人源三阴性乳腺癌BT-549具有显著的细胞毒性:对于4T1细胞系,经过TAT的修饰,PEG-SN38的细胞毒性提高了3.61倍;而对于BT-549细胞系,TAT-PEG-SN38组的细胞杀伤效果也明显高于SN38、CPT-11和PEG-SN38。TAT-PEG-SN38对肿瘤细胞的毒性增强是由于细胞穿膜肽修饰改善了PEG-SN38的细胞摄取能力,与PEGSN38相比,4T1和BT-549细胞对TAT-PEG-SN38的细胞摄取强度分别提高了4.2倍和1.7倍。引入正常乳腺上皮细胞HC-11细胞系作为参照分析TAT修饰对肿瘤细胞的选择性,发现TAT-PEG-SN38的摄取与PEG-SN38相比并未有显著增强,可能由于细胞表面电荷差异,TAT-PEG-SN38对肿瘤细胞的内化具有一定的选择性。以3D肿瘤球模型模拟TAT-PEG-SN38的肿瘤穿透能力,孵育24 h后TAT-PEG-SN38渗透进入肿瘤球内部,PEG-SN38仅存在于肿瘤球表面,并且TAT-PEG-SN38明显抑制了肿瘤球的生长。上述实验证明,TAT-PEG-SN38能选择性地被肿瘤细胞摄取,并渗透进入肿瘤内部,具有优越的体外抗肿瘤活性。3、TAT-PEG-SN38的体内抗肿瘤活性评价建立小鼠乳腺癌原位荷瘤模型,对TAT-PEG-SN38的体内抗肿瘤效果进行评价:活体成像结果表明静脉注射胶束8 h后,TAT-PEG-SN38在肿瘤部位有效蓄积,进一步证明TAT能够将药物有效递送到肿瘤区域增强摄取。与Control组相比,TAT-PEG-SN38抑制了52.42%的肿瘤增长,抑制效果是PEG-SN38的1.57倍。通过对肺组织转移情况观察,可以发现TAT-PEG-SN38组对TNBC在体内器官的转移抑制效果明显高于其余给药组。病理性切片分析验证了同样的结果,除TAT-PEG-SN38组外,肿瘤向肝脏和肺脏均出现了不同程度的转移。由此可见,TAT-PEG-SN38明显改善了4T1小鼠荷瘤模型中的器官转移情况。通过免疫组化分析发现,与其他组相比,TAT-PEG-SN38组的抗原CD31的表达量最低,说明TAT-PEG-SN38组可有效抑制肿瘤新生血管的生成。TAT修饰显著提高了PEG-SN38的体内TNBC抗肿瘤效果,抑制了TNBC远端转移。4、TAT-PEG-SN38的抗转移研究首先,在细胞水平考察TAT-PEG-SN38对4T1和BT-549两种细胞系的转移抑制能力:通过细胞划痕愈合和Transwell细胞迁移的研究可以发现,TAT-PEGSN38划痕愈合率分别仅为16.17%、22.19%;,而在Transwell细胞迁移实验中,TAT-PEG-SN38处理组的细胞几乎未发生迁移。和对照组相比,CPT-11并未显著抑制细胞的迁移,TAT-PEG-SN38显著改善了CPT-11的细胞转移抑制能力。通过蛋白质组学对小鼠肿瘤组织的蛋白表达差异分析发现,相比于对照组,TAT-PEG-SN38给药组中有15种蛋白的表达发生了上调,29种蛋白发生了下调,其中与肿瘤转移相关的蛋白中包括DSG2和LDLR、JUP蛋白,并通过

关键词： Actein   Toosendanin   构效关系   三阴性乳腺癌  

摘要： 本论文共有三章组成,第一章介绍了中药升麻中actein的结构修饰及抗三阴性乳腺癌活性研究,第二章介绍了中药川楝子中toosendanin的结构修饰及抗三阴性乳腺癌的活性研究,第三章介绍了中药单体成分抗三阴性乳腺癌的研究进展。第一章升麻中actein的结构修饰及抗三阴性乳腺癌活性Actein是从中药升麻（Cimicifuga foetida）的根状茎中分离出来的三萜皂苷,此前已被证明在乳腺癌的治疗中具有潜力,但存在活性不高的问题。在此基础上,我们设计并合成了一系列抗三阴性乳腺癌（TNBC）抑制剂actein的衍生物,并对衍生物进行体外抗三阴性乳腺癌活性评价,其中最具潜力的衍生物1-27对人TNBC细胞株HCC1806和MDA-MB-231具有显著的抑制活性,IC50值分别为2.78和9.11μM,并讨论了actein衍生物的构效关系。此外,初步机制研究发现,1-27在S期阻滞细胞周期显著抑制癌细胞增殖;Western blot结果显示,化合物1-27诱导p21呈剂量依赖性积累,并可能激活MAPK的p38通路从而诱导细胞凋亡。以上结果表明1-27具有开发作为先导化合物的潜力,具有Actein骨架的化合物是一类有前途的治疗TNBC的新型抑制剂。第二章川楝子中toosendanin的结构修饰及抗三阴性乳腺癌活性Toosendanin（TSN）是从中药川楝子（Melia toosendan Sieb et Zucc）中分离出来的抗肿瘤化合物。然而,先前的研究表明TSN治疗三阴性乳腺癌（TNBC）的效果仍不理想。在这项工作中,我们研究了TSN及其衍生物对MDA-MB-231和HCC1806细胞株的作用。结果表明,TSN及其衍生物2-11具有良好的抗肿瘤活性。初步机制研究表明,TSN和2-11均可诱导HCC1806细胞周期S期阻滞和G2/M期细胞数量减少。此外,TSN和2-11降低了p53的蛋白水平以及AKT和ERK的磷酸化,也诱导了p21和p-p38蛋白的积累。第三章中药单体成分抗三阴性乳腺癌的研究进展本章围绕中药单体成分抗三阴性乳腺癌的研究进行综述,主要从植物、动物、矿物中提取分离得到的单体化合物及其衍生物的抗TNBC活性研究;此外还对中药单体联合抗癌药物紫杉醇、顺铂、阿霉素等治疗TNBC进行阐述。希望可以为后期抗三阴性乳腺癌的药物研究提供参考。

关键词： 三阴性乳腺癌   适配体   雷公藤甲素   缩醛酯连接键   靶向治疗药物  

摘要： 三阴性乳腺癌(TNBC)是指雌激素受体、孕激素受体及人表皮生长因子受体均为阴性的乳腺癌亚型,占所有乳腺癌病理类型的15%-25%。由于TNBC具有特殊的生物学行为和临床病理特征,是侵袭性最强、预后最差的乳腺癌亚型,其常规治疗方法包括手术、放疗、化疗及免疫治疗,其中化疗仍是三阴性乳腺癌的标准治疗方式,目前尚无针对性的靶向治疗方法。研究表明,核仁素在多种肿瘤细胞中过表达,且广泛表达与TNBC细胞膜表面。核酸适配体AS1411是一种由26个碱基组成的高水溶性单链寡核苷酸,能够特异性与TNBC细胞表面过表达的核仁素以高亲和性结合。雷公藤甲素(TP)是一种广谱高效的抗癌药,具有多种抗癌机制,可诱导多种肿瘤细胞的凋亡,包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌等,抗肿瘤活性优于顺铂、阿霉素、紫杉醇等传统的抗癌药物。但由于其水溶性差和缺乏肿瘤靶向性,存在严重的毒副反应,其临床运用受到极大限制。由此,基于肿瘤的靶向治疗和药物的精准释放技术,本课题设计了合成一种p H高度敏感的核酸适配体AS1411-雷公藤甲素偶合物(AS-TP),用于靶向治疗三阴性乳腺癌。主要研究内容及结果如下: 首先,采用丁二酸酐和烯丙醇为原料,设计合成了一种新型酸敏感性连接键,并将TP与核酸适配体AS1411通过该连接键进行偶联,合成了核酸适配体AS1411-雷公藤甲素偶合物。随后,采用HPLC测定AS-TP的血清稳定性、酸敏感性性及水溶性,结果证明AS-TP可在血清中保持稳定不分解,且易在弱酸微环境下断裂释放雷公藤甲素原药,进一步的水溶性测定证明与TP相比,AS1411偶联可显著提高TP的水溶性。 随后,采用分子对接技术和生物分子相互作用分析仪测定了AS-TP与核仁素蛋白的亲和力,结果证明AS1411偶联可显著提高TP与核仁素蛋白的靶向性,细胞免疫荧光显示AS-TP与核仁素蛋白具有优异的共定位效果。进一步采用流式细胞术测定了核仁素表达量不同的细胞对羟基荧光素标记的AS-TP的摄取能力,细胞对FAM-AS-TP的摄入量与核仁素蛋白的表达量相关三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞高摄取FAM-AS-TP,AS1411可竞争性抑制MDA-MB-231对AS-TP的摄入及AS-TP有对MDA-MB-231的细胞毒性。 采用MTT实验测定了AS-TP对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用及对正常细胞的细胞毒性,结果证明AS1411偶联可显著增强TP的抗肿瘤作用并降低其对正常细胞的细胞毒性,流式细胞术分析显示AS-TP发挥与TP相似的抗肿瘤机制,其主要通过诱导MDA-MB-231细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡发挥抗TNBC作用。进一步研究表明,AS-TP主要通过降低MDA-MB-231细胞线粒体膜电位水平、促进细胞内活性氧生成及激活线粒体凋亡途径发挥抗TNBC作用。 为了进一步验证AS-TP的体内分布及体内抗肿瘤作用,本论文构建了三阴性乳腺癌荷瘤小鼠模型。小动物活体成像实验表明,AS-TP可显著蓄积于TNBC肿瘤组织并主要通过肝、肾组织代谢。体内疗效实验发现,AS-TP可发挥高效的体内抗TNBC作用,其可显著损伤肿瘤组织、诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤组织增殖。体内生物安全性表明,在有效治疗剂量条件下,AS-TP并未对小鼠正常组织结构造成病理损伤,同时血生化数据表明AS-TP并未引起小鼠肝、肾指标变化,这表明AS-TP具有较好的体内生物安全性。

关键词： 北豆根   N-去甲基蝙蝠葛碱   三阴性乳腺癌   NF-κB   3D肿瘤球体  

摘要： 三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）是一类特殊的乳腺癌亚型,患者预后差且生存率低。已有的研究表明,北豆根（Menispermum dauricum DC）及其生物碱活性化合物对多种肿瘤具有抗增殖活性。然而,北豆根生物碱是否具有TNBC增殖抑制活性目前尚不清楚。 本论文以北豆根为研究对象,对其总生物碱进行一维色谱分离制备,根据色谱峰共收集6个馏分（F1–F6）。采用CCK8法对北豆根一维馏分进行抗TNBC增殖检测,筛选出2个活性馏分F5和F6。通过细胞增殖检测、HPLC-MS/MS和核磁分析,从活性馏分中鉴定出两个具有抗TNBC增殖活性的化合物,为蝙蝠葛碱和N-去甲基蝙蝠葛碱。 进一步研究发现,蝙蝠葛碱和N-去甲基蝙蝠葛碱对4种不同分型的TNBC细胞均有良好的增殖抑制能力,其半抑制浓度IC50值介于5.01μM–13.16μM。蝙蝠葛碱与N-去甲基蝙蝠葛碱的抗TNBC增殖活性相似,但是N-去甲基蝙蝠葛碱的抗肿瘤研究较少,因此选择N-去甲基蝙蝠葛碱来研究其抗TNBC增殖作用机制。本论文通过流式细胞技术、细胞伤口愈合实验及Western blot检测研究了N-去甲基蝙蝠葛碱对TNBC细胞凋亡、细胞周期分布和细胞迁移的影响,结果表明N-去甲基蝙蝠葛碱能够通过促进DNA修复酶PARP1切割产物的增加促使TNBC细胞凋亡,通过促进G1/S-特异性周期蛋白-D1和周期蛋白依赖性激酶2的表达引起细胞周期G0/G1期阻滞,通过抑制基质金属蛋白酶9的表达抑制TNBC细胞迁移。此外,Western blot检测结果表明N-去甲基蝙蝠葛碱还可以抑制TNBC细胞中nuclear factor kappa B（NF-κB）p65蛋白的表达,表明N-去甲基蝙蝠葛碱是通过调控典型NF-κB信号通路的激活而抑制TNBC细胞的增殖。3维（3D）肿瘤球体是一种类器官模型。实验结果表明N-去甲基蝙蝠葛碱能够抑制TNBC3D肿瘤球体的生长,并有效地穿透多层细胞,导致外部细胞从3D肿瘤球体表面分离。