关键词： 三阴性乳腺癌   穿心莲内脂   YAP蛋白   上皮间质转化  

摘要： 目的通过体内外实验,探讨穿心莲内酯(andrographolide,Andro)对三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移、干细胞特性和上皮间质转化进程的影响及可能作用机制。方法利用磺酰罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)比色法检测细胞活性;采用细胞划痕实验、流式技术和干细胞成球实验检测细胞迁移能力、干细胞增殖能力及CD44^(+)/CD24^(-/low)的比例;Western Blot实验检测NESTIN、NANOG、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Fibronectin、p-YAP、YAP、ANKRD1蛋白的表达。采用小鼠移植瘤实验检测Andro对乳腺癌细胞体内增殖和小鼠致瘤性的作用。利用免疫组化实验检测各组肿瘤组织中YAP和ANKRD1的表达。结果体外实验结果表明:Andro可剂量依赖性降低MDA-MB-231和4T1细胞活性;与对照组比较,经Andro干预后的MDA-MB-231和4T1细胞的划痕愈合率降低,CD44^(+)/CD24^(-/low)比例下降,干细胞微球的体积减小和数量降低(P<0.05),NESTIN、NANOG、Vimentin、N-cadherin、Fibronectin、YAP和ANKRD1蛋白表达下降,而E-cadherin和p-YAP的表达上升。体内实验结果表明:与对照组相比,经Andro干预的小鼠肿瘤体积和肿瘤质量减小,肿瘤组织中YAP和ANKRD1的表达下降(P<0.01)。结论Andro可通过调控Hippo/YAP信号通路发挥抗三阴性乳腺癌的作用。

关键词： 网络药理学   山茱萸-虎杖   三阴性乳腺癌   分子对接  

摘要： 目的利用网络药理学方法结合分子对接探究山茱萸-虎杖药对治疗三阴性乳腺癌的作用机制。方法采用TCMSP数据库获取药物的化学成分及其相关靶点;选择Gene Cards和OMIM数据库收集疾病的相关靶点,筛选出二者的共同靶点后可绘制蛋白质互作(PPI)网络;对关键靶点进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因组与基因组百科全书通路(KEGG)通路富集分析,最后进行分子对接验证。结果筛选得到药物有效成分共20个;疾病相关靶点1512个,与药物共同靶点47个。通过PPI网络得出ESR1、EGFR和PTGS2为关键靶点。GO通路和KEGG富集分析显示,山茱萸-虎杖药对通过参与多种生物学过程抗三阴性乳腺癌;通过PI3K-Akt等信号通路调控病理进程。分子对接显示活性成分与核心靶点之间有较好的结合力。结论山茱萸-虎杖可以通过多成分、多靶点、多途径发挥抗三阴性乳腺癌的作用,从而为其临床应用及相关机制的研究提供理论依据。

关键词： 余甘子   三阴性乳腺癌   网络   药理学  

摘要： 目的借助网络药理学方法和实验验证方法探究余甘子抗三阴性乳腺癌(TNBC)的作用机制。方法1.网络药理学方法:1)通过TCMSP数据库分析余甘子活性成分,2)借助Pharm Mapp数据库进行作用靶点垂钓,3)利用生物信息学方法筛选TNBC差异表达基因,4)进行GO生物功能和KEGG通路富集分析,5)运用STRING数据库进行蛋白质互作网络的构建,6)使用Kaplan-Meier Plotter工具对相关靶点作生存分析,2.实验验证方法:1)用CCK-8法探究余甘子粗提物对MDA-MB-231细胞生长的影响,2)以划痕实验探究余甘子粗提物对三阴性乳腺癌细胞迁移能力的影响。结果1.网络药理学方法结果:1)通过TCMSP数据库获得余甘子有效活性成分21个,2)通过靶点垂钓分析得到作用靶点115个,3)通过TNBC差异基因分析发现2876个基因表达发生显著变化,4)余甘子有29个主要作用靶点影响孕酮受体、激素调节信号传导、乳腺细胞分化和中心体分离等通路,5)确定关键靶点为AURKA、PGR、AR、CCNA2、PPARG,6)AURKA、CCNA2的低表达与PGR、AR、PPARG的高表达与患者生存预后呈正相关关系;2.实验验证方法结果:1)确定了余甘子粗提物IC_(50)=6.1μg·mL^(-1),2)余甘子粗提物显著抑制MDA-MB-231细胞迁移。结论1.网络药理学结论:1)确定了余甘子抗TNBC的21种主要活性成分,2)预测其关键靶点为AURKA、PGR、AR、CCNA2、PPARG;2.实验验证结论:余甘子粗提物能够明显抑制MDA-MB-231细胞的生长和迁移。

关键词： 半枝莲   网络药理学   三阴性乳腺癌   靶基因   信号通路  

摘要： 目的利用网络药理学探讨半枝莲治疗三阴性乳腺癌的作用机制。方法本研究采用网络药理学方法,主要包括靶点预测、网络构建和功能富集。从中药系统药理学数据库与分析平台中获取“半枝莲”所有化合物靶点,并与其活化物进行匹配,发现木犀草素和汉黄芩素为主要相关化合物。构建蛋白-蛋白相互作用网络获得相关靶点信息,构建半枝莲与三阴性乳腺癌相关靶点网络,分析半枝莲抗三阴性乳腺癌的关键信号通路。结果共获得15个活性化合物的104个靶点。网络分析得出10个半枝莲治疗三阴性乳腺癌的关键靶点。功能富集分析表明,半枝莲可能通过协同调节多种生物学相关信号通路,对三阴性乳腺癌产生治疗作用。结论半枝莲治疗三阴性乳腺癌的药理机制可能与其协同调节细胞凋亡、细胞周期、分化、增殖、迁移、侵袭和血管生成密切相关。

关键词： 山慈菇   三阴性乳腺癌   网络药理学   分子对接  

摘要： 本研究基于网络药理学与分子对接的方法探讨山慈菇治疗三阴性乳腺癌的作用机制。利用TCMSP数据库和文献中获得山慈菇化学成分,在Swiss Target Prediction平台上搜索活性成分靶点;采用OMIM、GeneCards数据库检索三阴性乳腺癌靶点,并通过String构建蛋白质互作网络,使用DAVID数据库对核心靶点进行GO分析和KEGG通路富集分析;另外选取部分化合物和靶点使用Autodock软件进行分子对接验证;运用Western blot法检测相关调控靶点蛋白的表达。结果显示,共筛选出12个山慈菇活性成分,97个关键靶点,分子对接发现主要靶点HSP90AA1、EGFR、MAPK1、JUN和PIK3CA均与活性成分对接较好。山慈菇的作用靶点富集于PI3K-AKT信号通路,山慈菇通过降低p-AKT和p-PI3K的表达水平进行调控乳腺癌细胞的增殖、凋亡和迁移。本研究初步预测了山慈菇的有效活性成分、关键靶点和作用机制,可为山慈菇治疗三阴性乳腺癌的临床应用提供依据。

关键词： 喜树   喜树碱   铁死亡   光热治疗   化疗耐药   三阴性乳腺癌   肿瘤主动靶向   递药系统  

摘要： 研究背景:喜树碱是从喜树中提取分离得到的生物碱,主要通过作用于细胞内的拓扑异构酶I抑制DNA合成以达到抗肿瘤的作用。喜树碱完整的内酯环是抑制拓扑异构酶I的药效基团。喜树碱通过诱导细胞凋亡的形式杀死肿瘤细胞,极易发生多药耐药导致化疗失败。因此,将喜树碱以内酯环形式递送至肿瘤细胞,并能克服肿瘤对喜树碱的耐药,具有重要的研究价值。铁死亡是不同于细胞凋亡的一种程序性细胞死亡形式,在肿瘤治疗中发挥重要作用。铁死亡的本质是细胞内过量的游离铁催化过氧化氢,产生大量的ROS,进而氧化细胞膜上的脂质,形成大量的脂质氢过氧化物。因此,向肿瘤细胞内递送铁离子,有望通过铁死亡途径杀死耐药肿瘤细胞,从而克服肿瘤耐药。多巴胺可以与金属离子配位,在碱性环境下能够进行氧化自聚合反应,形成具有超强细胞黏附特性的聚多巴胺（Polydopamine,PDA）纳米粒。聚多巴胺纳米粒具有优异的光热转化能力和p H响应性的释放特性。聚多巴胺的网状结构也可以高效负载药物,另外,多巴胺结构上的氨基利于结构修饰,将肿瘤靶向基团叶酸连接在多巴胺上,还能够增强聚多巴胺纳米粒的肿瘤主动靶向特性。三阴性乳腺癌由于难以采用抗体和免疫治疗,化学治疗成为治疗三阴性乳腺癌的主要方法。而传统化疗由于易产生耐药性,协同治疗成为治疗三阴性乳腺癌并克服耐药的有前景的方法。研究目的:选用多巴胺和叶酸修饰的多巴胺为载体材料,通过氧化自聚合反应,制备共同负载CPT和Fe3+的肿瘤主动靶向纳米粒CPT/Fe@PDA-FA。将纳米粒靶向递送至肿瘤部位,实现纳米粒的高效入胞,并在细胞内p H响应刺激下释放CPT和Fe3+,利用PDA纳米粒的光热特性,实现基于喜树碱的凋亡、铁死亡与光热三联合肿瘤靶向治疗作用,多途径协同杀死耐药肿瘤细胞。研究方法:1.采用多巴胺与叶酸为原料,通过酰胺化反应,合成叶酸修饰的多巴胺肿瘤靶向材料,经过核磁共振波谱及红外光谱对目标化合物进行表征确证。2.以多巴胺及不同比例的叶酸修饰的多巴胺为原料,通过氧化自聚合反应,并利用多巴胺结构中的酚羟基与Fe3+的配位作用以及聚多巴胺网格结构与喜树碱平面结构的π-π堆积实现Fe3+和CPT的高负载,得到共同负载Fe3+和CPT的肿瘤主动靶向纳米粒CPT/Fe@PDA-FA;采用动态光散射激光粒度仪、高效液相色谱仪、紫外分光光度计、扫描电子显微镜与透射电子显微镜对纳米粒的粒径、多分散指数（PDI）、zeta电位、载CPT量、载铁量、稳定性、形态学及元素分布进行评价。***/Fe@PDA、CPT/Fe@PDA-FA5、CPT/Fe@PDA-FA10及CPT/Fe@PDA-FA20分别与4T1-Luc细胞共孵育后,通过激光共聚焦显微镜观察纳米粒的摄取量,筛选最优纳米粒。采用红外热成像仪考察CPT/Fe@PDA-FA10纳米粒的光热转化性能;考察CPT/Fe@PDA-FA10纳米粒的p H响应性释药特性、体外药物释放动力学及溶血作用。4.采用MTT实验、细胞克隆形成实验及活死细胞染色实验,考察CPT/Fe@PDA-FA10的体外抑制耐药三阴性乳腺癌细胞的增殖活性。5.采用MTT实验、ROS及LPO染色后激光共聚焦实验、GSH及MDA含量测定实验、生物透射电镜及Western blot等实验,观察细胞增殖活性、检测ROS、LPO、GSH及MDA含量、观察线粒体形态及观察铁死亡相关蛋白（GPX4和SLC7A11）的表达等,考察CPT/Fe@PDA-FA10的体外抑制耐药三阴性乳腺癌细胞的铁死亡活性。6.采用凋亡染色流式实验及Western blot实验,考察CPT/Fe@PDA-FA10的体外抑制耐药三阴性乳腺癌细胞的凋亡活性。7.采用MTT竞争性生长抑制实验及激光共聚焦竞争性摄取实验,考察CPT/Fe@PDA-FA10的肿瘤主动靶向作用及细胞摄取机制。8.通过原位注射4T1-Luc/CPT耐药细胞至乳腺,构建原位耐药三阴性乳腺癌裸鼠模型;通过红外热成像仪观察CPT/Fe@PDA-FA10在荷瘤裸鼠体内的光热转化性能。9.通过游标卡尺测量原位耐药三阴性乳腺癌的体积,小动物活体成像系统拍摄裸鼠肿瘤的荧光强度,考察CPT/Fe@PDA-FA10对裸鼠原位耐药三阴性乳腺癌生长的抑制作用。10.通过肿瘤组织的H&E染色、TUNEL染色、ROS染色、LPO染色、Ki67染色、Western blot实验、MDA和GSH的含量检测及Caspase 3、Bcl-2、GPX4和SLC7A11免疫荧光染色实验,考察CPT/Fe@PDA-FA10抗原位耐药三阴性乳腺癌的机制。11.通过称量荷瘤裸鼠体质量,检测裸鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的活性,以及血清尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）的含量,裸鼠的心、肝、脾、肺及肾组织的H&E染色,考察CPT/Fe@P

关键词： 姬松茸   活性成分   抗三阴性乳腺癌   生物活性   作用机制  

摘要： 三阴性乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer,TNBC)是一种不表达雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)或人表皮生长因子受体2(HER-2)的特定乳腺癌亚型,具有高侵袭性、高转移性、易复发和预后不良等多种临床特征,目前,化疗是最重要的治疗方法,但后期化疗药物的耐药性导致临床效果不佳。因此从天然产物中寻找高效抗三阴性乳腺癌的先导化合物迫在眉睫,具有极大的价值和意义。 姬松茸(Agaricus Blazei Murill,ABM)又名巴西蘑菇,是一种珍贵的药、食两用真菌,具有丰富的食用和药用价值,且安全性高,具有多样化的生物活性,如抗肿瘤、抗病毒,抗氧化、降血糖、免疫调节等。目前在多种疾病已得到广泛运用,如肝炎、糖尿病、增强机体免疫功能以及辅助癌症治疗等,但姬松茸的抗肿瘤活性研究集中于含量较多的多糖成分,在此基础上本课题组前期通过抗肿瘤活性筛选发现其非多糖成分亦具有很强的抗三阴性乳腺癌作用,但目前对姬松茸中非多糖成分抗三阴性乳腺癌的物质基础以及作用机制未见任何报道。所以,本课题研究旨在对姬松茸子实体中非多糖部分的化学成分开展一系列的抗三阴性乳腺癌活性与分子作用机制研究,为寻找高效的抗三阴性乳腺癌的先导化合物,以及阐明姬松茸的有效物质基础提供重要依据。 本课题通过硅胶柱层析、开放ODS柱层析、Biotage中低压、半制备型HPLC等多种分离方法,首次从姬松茸子实体中提取分离得到35个单体化合物,经1D-NMR,2D-NMR,MS、旋光等多种波谱学结构鉴定,包括已知化合物26个,新化合物9个,全部为首次从姬松茸中分离得到。结构类型包括甾醇类,萜类,脂链状脂肪酸类、生物碱类、芳香环类等。通过细胞划痕实验、克隆形成实验、transwell实验和细胞凋亡实验等,发现甾醇类化合物BXG-1(新化合物)与8能显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖和迁移,并能够诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡。 综上,本课题首次从姬松茸子实体中分离鉴定了35个化合物(新化合物9个、已知化合物26个),并通过一系列细胞实验发现姬松茸子实体中BXG-1和BXG-8的抗MDA-MB-231细胞的增殖和迁移活性,并诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡的作用,为研究姬松茸抗三阴性乳腺癌的先导化合物提供了重要基础。

关键词： 三阴性乳腺癌   紫草素   靶向纳米药物   肿瘤转移   联合治疗  

摘要： 目的:三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）是一种化疗、免疫治疗敏感性低,临床预后差,且易复发转移的恶性肿瘤。目前临床常用药物多柔比星、紫杉醇等由于毒副作用难以满足TNBC的治疗,因此亟需探索新型有效的治疗药物。近年来,传统中药来源的天然活性成分已经成为新型抗癌药物研发的重要来源。紫草素（Shikonin,SHK）,传统中药紫草的重要天然活性成分,前期研究表明其具有较好的广谱抗肿瘤活性且安全性良好,有望成为临床治疗TNBC的潜在药物。然而,其极低的生物利用度极大地限制了临床推广应用,故亟待紫草素类药物的剂型改良。目前已有采用纳米技术对SHK进行剂型改造用于TNBC治疗的相关研究,虽取得了一定的治疗效果,但仍存在靶向性不佳,生物利用度有限等问题,未能最大限度地增敏SHK对肿瘤治疗的疗效。基于上述问题,本论文提出了两种靶向递送SHK的新策略用于TNBC精准治疗:（1）杂化细胞膜伪装的普鲁士蓝纳米颗粒负载SHK（Hybrid membrane@ICG/PEI@HPB@SHK,HMGPHS NPs）联合光热治疗TNBC的研究;（2）SHK和银的纳米复合物（MUC1@Chi-Ag@CPB@SHK,MUC1@ACS NPs）通过诱导坏死性凋亡增强免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death,ICD）治疗转移性TNBC的研究。 方法:（1）杂化细胞膜伪装的普鲁士蓝纳米颗粒负载SHK联合光热治疗TNBC的研究:通过搅拌法和静电吸附法制备了HMGPHS NPs;通过粒径、电位、透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）、X射线衍射（X-ray diffraction,XRD）、傅里叶变换红外（Fourier Transform Infrared,FTIR）和Western blotting表征HMGPHS NPs;通过808 nm激光照射后考察HMGPHS NPs光热性能、光热稳定性、光热转换效率;通过调节p H考察HMGPHS NPs释放SHK的效率;通过巨噬细胞、BGC-823细胞、VSMC细胞、4T1细胞和3D肿瘤球考察HMGPHS NPs的免疫逃逸、摄取、靶向和渗透能力;通过荷瘤小鼠和小动物成像考察HMGPHS NPs的体内靶向和半衰期;通过MTT、活死细胞染色、流式细胞术、Western blotting、伤口愈合实验、Transewell侵袭和转移实验考察HMGPHS NPs的体外抗肿瘤活性;通过荷瘤小鼠、H&E、TUNEL、免疫组化和免疫荧光考察HMGPHS NPs的体内抗肿瘤作用。 （2）SHK和银的纳米复合物通过诱导坏死性凋亡增强免疫原性细胞死亡（Immunogenic cell death,ICD）治疗转移性TNBC的研究:通过MTT和Synergy Finder软件考察SHK和壳聚糖银纳米（Chitosan-silver nanoparticles,Chi-Ag NPs）的协同效果;通过活死细胞染色、流式细胞术、Western blotting、ROS、LDH和ATP实验考察SHK与Chi-Ag NPs联用的作用机制;通过搅拌法、静电吸附法和化学键修饰法制备了MUC1@ACS NPs;通过粒径、电位和TEM表征MUC1@ACS NPs;通过调节p H考察MUC1@ACS NPs释放SHK的效率;通过4T1、MCF-10A、HUVEC、Hep G2细胞和3D肿瘤球考察MUC1@ACS NPs的摄取、靶向和渗透能力;通过荷瘤小鼠、小动物成像和免疫荧光考察MUC1@ACS NPs的体内靶向、渗透和半衰期;通过MTT和3D肿瘤球模型考察MUC1@ACS NPs的体外药效;通过荷瘤小鼠、H&E、TUNEL、免疫组化和免疫荧光考察MUC1@ACS NPs的体内抗肿瘤作用;通过流式分析肿瘤组织CD8+T、CD4+T和Treg细胞含量以及淋巴结中DCs成熟含量考察MUC1@ACS NPs的体内抗肿瘤免疫作用;通过远端肿瘤模型考察MUC1@ACS NPs的体内远端肿瘤和转移抑制。 结果:杂化细胞膜伪装的普鲁士蓝纳米颗粒负载SHK联合光热治疗TNBC的研究:（1）通过搅拌法和静电吸附法制备了HMGPHS NPs,表征结果显示HMGPHS NPs呈立方体形状,表面有膜涂层,粒径大小为124.3±3.5 nm,电位大小为-12.9m V,且合成过程中杂化膜的膜蛋白成功保留;XPS、FTIR和XRD确认了HMGPHS NPs的成分和结构特征;光热性能结果显示HMGPHS NPs的温度升高与激光功率和NPs浓度呈正相关,多个周期照射后具有较好的光热稳定性,光热转换效率为31.6%;体外释放结果显示HMGPHS NPs释放行为呈p H和

关键词： 三阴性乳腺癌   抗菌肽   自噬抑制   癌细胞   细胞凋亡  

摘要： 乳腺癌在全球发病率和死亡率居女性癌症首位，三阴性乳腺癌约占其中的15%-20%。三阴性乳腺癌缺乏其他类型乳腺癌的治疗靶点（如雌激素、孕激素受体和人表皮生长因子受体）的表达，是一种侵袭性较强且治疗难度较大的乳腺癌亚型。目前临床治疗常用手术联合化疗药物治疗，但传统化疗药物存在选择性差、毒副作用大和耐药性等弊端，亟需开发新型抗三阴性乳腺癌药物。抗菌肽是一类固有免疫系统的小分子肽，具有抗菌、抗病毒和抗真菌等活性。研究发现部分抗菌肽在肿瘤治疗领域具有潜力，这类抗菌肽不仅低毒性、对肿瘤细胞选择性高，并且对休眠期和生长缓慢的肿瘤细胞也具有抗癌活性。抗菌肽Pep19-2.5是一种正在开发的抗感染和中和内毒素的合成多肽，安全性高，目前尚无其抗肿瘤活性的报道。本课题组通过筛选发现抗菌肽Pep19-2.5可在体外显著抑制三阴性乳腺癌细胞增殖，但分子机制不明。最近研究表明，三阴性乳腺癌的治疗效果可能受细胞自噬的影响，自噬是一种细胞内的降解和回收过程，涉及细胞内蛋白质、细胞器和其他大分子物质的降解。因此，本课题拟通过体内外系统实验，围绕自噬流、自噬-溶酶体途径研究抗菌肽Pep19-2.5的抗三阴性乳腺癌作用及其分子机制。本文主要研究方法和结果如下：　　1. 抗菌肽Pep19-2.5调节自噬能力的检测：选取课题组前期筛选抑制三阴性乳腺癌细胞株 MDA-MB-231 增殖活性效果较好的Pep19-2.5、Tiger17、AH90、DRGN-1、SHAP1五种抗菌肽，采用稳定表达GFP-LC3B的三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231检测它们调节自噬的能力，发现只有Pep19-2.5具有自噬调节作用。Western blot、RT-PCR和透射电子显微镜结果显示，抗菌肽Pep19-2.5提高了自噬分子LC3B、SQSTM1/p62蛋白表达水平、增加了自噬小体数量，说明Pep19-2.5是一种有效的自噬调节剂。进一步联用Pep19-2.5和自噬早期/晚期抑制剂进行分析，Western blot结果表明Pep19-2.5抑制自噬晚期。　　2. 抗菌肽Pep19-2.5抑制自噬流抗三阴性乳腺癌的体外作用研究：CCK8和细胞克隆形成实验表明，抗菌肽Pep19-2.5显著抑制三阴性乳腺癌细胞增殖，并增强了肿瘤细胞对化疗药顺铂的敏感性。流式细胞术、Tunel和Western blot结果显示，抗菌肽Pep19-2.5诱导肿瘤细胞凋亡。敲除ATG5（自噬小体形成的必需基因）的细胞株不具备形成自噬流的能力。CCK8检测抗菌肽Pep19-2.5对ATG5KO MDA-MB-231细胞增殖的影响，结果表明抗菌肽Pep19-2.5是通过抑制自噬流来抑制MDA-MB-231细胞增殖的。流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测结果显示，抗菌肽Pep19-2.5可穿透肿瘤细胞膜，定位于溶酶体。自噬小体和溶酶体共定位观察实验结果表明Pep19-2.5抑制自噬体-溶酶体降解。ELISA结果显示溶酶体标志酶ACP和溶酶体主要蛋白酶CTSB、CTSD相对酶活性降低，说明抗菌肽Pep19-2.5 影响了溶酶体水解功能，可能影响了溶酶体的pH。RNA-Seq分析结果表明，抗菌肽Pep19-2.5作用相关的途径有：细胞增殖、生物调节、癌症途径、抗癌药物的耐药性等。通过Pulldown-MS蛋白靶点垂钓实验及蛋白靶点的筛选和验证，初步推测，ATP6V1A可能是抗菌肽Pep19-2.5抑制自噬流抗三阴性乳腺癌的作用靶点，但仍有待进一步研究。　　3. 抗菌肽 Pep19-2.5 在动物体内的药效评价：通过构建NOD/SICD小鼠人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞移植瘤模型，对抗菌肽Pep19-2.5进行药效评价。HE染色、TUNEL染色、免疫荧光、免疫组化检测小鼠对抗菌肽Pep19-2.5的耐受性、肿瘤组织的凋亡率及自噬分子LC3、SQSTM1/p62的表达情况，结果表明Pep19-2.5在小鼠体内具有良好的耐受性，能够同样有效的抑制自噬流、诱导肿瘤凋亡。　　4. 抗菌肽Pep19-2.5的结构基础及活性结构初步分析：CCK8结果表明抗菌肽 Pep19-2.5 在 40μM 浓度以下不抑制正常细胞株NIH/3T3、HUVECs和MCF-10A的增殖。溶血试验表明Pep19-2.5在160μM浓度以下的溶血率极低。采用生信分析软件和圆二色谱对Pep19-2.5的理化性质、二级结构、亲疏水性、信号肽等进行分析，结果表明Pep19-2.5是一个双亲性多肽，结构上显示出少量β折叠。对抗菌肽Pep19-2.5序列中碱性氨基酸聚集的部分进行改构，CCK8结果表明，抗菌肽Pep19-2.5抑制MDA-MB-231细胞增殖的作用可能与氨基酸序列中的赖氨酸和精氨酸有关。　　综上所述，本文研究结果表明抗菌肽Pep19-2.5通过

关键词： 纳米材料   制备工艺   肿瘤靶向性   线粒体靶向性   氯尼达明   药物递送   三阴性乳腺癌   抗肿瘤效果  

摘要： 乳腺癌是一个全球关注的问题，世界卫生组织报道，每年约210万女性被检出患有乳腺癌。三阴性乳腺癌(TNBC)是一类具有早期转移性、高侵袭性、高复发率和低预后性的乳腺癌。临床传统治疗手段(手术、放疗和化疗)存在较大的毒副作用且治疗效果有限。氯尼达明属于广谱抗肿瘤药，可用于乳腺癌的治疗，由于其主要的抗癌机制是靶向肿瘤细胞线粒体代谢干扰肿瘤细胞能量产生，因此对正常细胞的杀伤作用小,然而其水溶性较差,不能较大程度地靶向肿瘤线粒体，为了将氯尼达明载入肿瘤细胞线粒体，将氯尼达明与合适的纳米生物材料结合，制备能够精准靶向肿瘤细胞线粒体的纳米粒具有重要意义。研究发现，快速增殖的肿瘤细胞表面会高表达整合素αVβ3，而在成熟血管内皮细胞和正常组织中表达较少，同时，整合素αVβ3可以特异性识别短肽RGD(Arg-Gly-Asp,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)结构并与之发生特异性结合，从而抑制肿瘤细胞的粘附，对肿瘤细胞的增殖起抑制作用。因此，RGD及其衍生物被广泛用作肿瘤细胞表面高表达整合素的配体来提高抗肿瘤药物的靶向能力。线粒体是细胞中重要的细胞器,对细胞代谢及生物能量合成起关键作用，扰乱线粒体功能对肿瘤细胞的正常生命活动有重要影响。基于肿瘤线粒体较正常线粒体具有更高的膜电位，研究发现，亲脂性阳离子可以很好地选择性聚集到肿瘤细胞线粒体内，其中研究较多的线粒体靶向阳离子主要是三苯基膦。　　本研究课题以氯尼达明(Lonidamine,LND)作为抗肿瘤药物，设计合成两种主要纳米材料，包括肿瘤靶向材料DSPE-S-S-PEG-R6RGD(DSSR)和线粒体靶向材料TPP-TPGS(TPS),通过水包油乳化溶剂挥发法制备纳米粒LND-PLGA/TPS/DSSR NPs包裹氯尼达明，纳米粒负载氯尼达明程序性靶向三阴性乳腺癌细胞的线粒体，起到增效减毒的作用。通过红外光谱、核磁共振、飞行质谱等仪器对纳米材料进行表征，并验证了纳米粒的稳定性和体外释药性能，通过体外细胞实验验证其细胞摄取、线粒体定位和线粒体凋亡机制。通过三阴性乳腺癌荷瘤鼠体内药效实验阐明其抗肿瘤活性和体内安全性。透射电镜结果显示负载LND后纳米颗粒呈均匀球形，具有光滑的表面形态，其粒径在200-350 nm均匀分布。LND-PLGA/TPS/DSSR NPs 的平均直径为 319.93±16.66 nm,大于LND-PLGA/TPS NPs 和 LND-PLGA/DSSR NPs,这可能是由于 DSSR 和 TPS 的共包裹效应。多分散系数(PDI)约为0.3,表明纳米粒子具有良好的分散性。LND-PLGA/TPS NPs 电位为正值，而 LND-PLGA/DSSR NPs 和LND-PLGA/TPS/DSSR NPs均为负值。带正电的纳米粒与带负电的血管表面结合,容易被快速清除，而负电荷可以保护纳米粒避免在血液循环中被快速清除。通过紫外分析，LND-PLGA/TPS/DSSR NPs的包封率和载药率值分别为87.51％和18.82％。粒径和分散度分析表明，纳米粒在一周内具有较高的稳定性。以pH 8.0和10 mM GSH模拟肿瘤线粒体微环境，采用透析法不同时间点取样，发现24小时后其累积释放量可达到100％,几乎完全释放。在纳米粒成功制备的基础上进行体外活性和体内药效研究，激光共聚焦结果表明RGD修饰有助于纳米粒LND-PLGA/TPS/DSSR NPs更好的靶向整合素αVβ3阳性的MDA-MB-231细胞，同时其细胞摄取与能量产生相关。采用CCK-8检测试剂分析载药纳米粒对MDA-MB-231细胞的细胞毒性，发现其抗增殖效果是与LND浓度相关的，与氯尼达明相比，纳米粒可以明显增强其对肿瘤细胞毒性。动物体内药效和病理组织染色实验结果显示，与LND和其他组纳米粒相比，LND-PLGA/TPS/DSSR NPs能够更好的抑制肿瘤的发展，且对正常组织没有明显毒副作用。在此基础上进一步探索线粒体作用机制，通过JC-1试剂盒和透射电镜结果可以看出，LND-PLGA/TPS/DSSR NPs能够明显增加氯尼达明对线粒体的损伤效果。Western blot和流式细胞术实验结果表明，纳米粒主要诱导肿瘤细胞的早期和晚期凋亡发生，且与线粒体凋亡相关的凋亡蛋白caspase-9和caspase-3的表达水平相应提高。线粒体呼吸链抑制作用实验表明，LND-PLGA/TPS/DSSR NPs比游离的LND更明显的降低了基础呼吸值、ATP合成量、最大呼吸值和备用呼吸值，证明了被靶向纳米材料包裹后的氯尼达明能够更好的靶向线粒体，使其更好的发挥抗肿瘤效果。因此，这种线粒体靶向递送系统可被临床上开发为TNBC的潜在治疗方法。