关键词： 响应性药物递送   饥饿治疗   靶向递送   化疗  

摘要： 随着纳米技术的迅速发展,纳米材料及其在医学上的应用研究已成为近年来科学界的一个热点。在纳米材料中,脂质体是最早被发现的纳米药物载体,并且已经发现脂质体在癌细胞的被动靶向中更有效,是被探索最多且功能最广泛的用于靶向药物递送系统的纳米药物载体。然而,脂质体总是很快从血液中清除。因此,为了提高其在体内的稳定性,研究人员以特定的方式功能化脂质体,从而实现脂质体更高效的靶向。然而构建功能化脂质体主要从两个方面着手:1)利用肿瘤微环境构建特异性响应的脂质体2)对脂质体进行修饰,赋予其具有靶向性的结构或基团。那么,解决了药物递送的问题后,更重要的问题出现了,递送什么样的药物才能够从根本上治疗癌症? 近年来,癌症饥饿疗法成为人们关注的热点。饥饿疗法,顾名思义就是使癌细胞处于能量供应不足的状态而诱导其凋亡。氯尼达明作为一种能够抑制癌细胞的呼吸和糖酵解,在细胞饥饿治疗中有很不错的表现,但是存在水溶性差、靶向性低、易耐药等多种化疗药的常见弊端,将其与功能化脂质体联用,可以将两者的治疗功能发挥到最大,实现更高效的癌症治疗。 本课题构建了一种基于GSH消耗脂质体的多功能纳米载药体系。通过将难溶性的线粒体抑制化疗药氯尼达明包载到GSH消耗的脂质体中,并在表面装载了具有靶向性的多肽衍生物DSPE-PEG2000-RGD,构建了具有肿瘤主动靶向作用的LND@CDC-RGD纳米颗粒。并针对具有极强迁移性和侵袭性的三阴性乳腺癌MDA-MB-231进行了一系列的体内、体外抗肿瘤活性评价。 对于LND@CDC-RGD纳米颗粒的表征主要做了以下工作:1)纳米颗粒的形貌表征,SEM及TEM结果显示,LND@CDC-RGD纳米颗粒呈现规则的球形分布,颗粒大小均匀,粒径在250nm左右,能够满足肿瘤EPR效应的基本要求。Mapping结果显示了LND@CDC-RGD各组分的成功装载。2)通过Zeta对纳米颗粒的稳定性及分散程度进行了表征,同时也侧面证明了DSPE-PEG2000-RGD的装载,结果显示纳米颗粒的Zeta电位达到了19.8m V,具有较强的稳定性,并且能够在血液中均匀分散,实现高效的药物递送。3)通过紫外分光光度法测得LND@CDC-RGD的LND负载率到了（24.35±0.56）%,能够实现药物的高效递送。4)利用质谱法检测了脂质体与GSH发生的Michael加成的产物,证明了LND@CDC-RGD能够在肿瘤部位发生GSH消耗从而实现解体,释放线粒体抑制剂氯尼达明,与脂质体消耗GSH引发细胞凋亡实现了协同“1+1>2”的治疗效果。 对于LND@CDC-RGD纳米颗粒的体外抗肿瘤活性验证主要做了以下工作:1)通过MTT发和Calcein-AM/PI双染法对细胞活力进行了测定,验证了纳米颗粒对癌细胞的抑制作用以及对正常细胞的毒性。2)通过细胞克隆法测定了纳米颗粒处理后癌细胞的增殖力。3)通过ROS染色试剂盒测定了由于GSH消耗引起的癌细胞ROS水平升高的现象。4)通过JC-1染色试剂盒测定了由LND引起的癌细胞线粒体功能异常的现象。5)由于MDA-MB-231细胞具有极强的迁移性和侵袭性,我们还通过划痕实验,评价了纳米颗粒对MDA-MB-231细胞迁移性以及侵袭性的影响。 对于体内抗肿瘤活性评价,做了以下工作:1)通过构建IR780@CDC-RGD进行了裸鼠活体成像,检测了纳米颗粒在体内的运输情况。2)构建MDA-MB-231荷瘤裸鼠模型进行了纳米颗粒的体内抗肿瘤效果,结果显示,LND@CDC-RGD的体内的肿瘤抑制率达到了67.35%。 综上所述,本课题通过构建了一种基于GSH消耗的功能化脂质体,实现了线粒体抑制剂氯尼达明的体内靶向递送,并且LND的线粒体抑制和GSH消耗的脂质体实现了协同治疗“1+1>2”的效果,并对纳米颗粒进行了一系列的体外表征、体外活性、作用机制、体内活性以及靶向递送验证等初步探索,并且进行了结果分析与评价。结果证明LND@CDC-RGD是一种非常有潜力的多功能纳米制剂,实现安全高效的药物递送和抗肿瘤治疗。

关键词： 抗雄激素药物   抗雄激素治疗   肿瘤直径   雄激素受体   叉头   三阴性乳腺癌细胞   李惠利   慢病毒转染  

摘要： 本研究通过抗雄激素药物作用于慢病毒转染构建的叉头框家族蛋白A1(FOXA1)高表达管腔样雄激素受体型(LAR)三阴性乳腺癌(TNBC)细胞株,探究抗雄激素治疗在LAR型TNBC中的作用。一、资料与方法1.一般资料:收集2017年12月至2021年12月宁波市医疗中心李惠利医院三阴性乳腺癌患者共104例。按AR表达分为三组:高表达组(AR≥50%);低表达组(10%

关键词： 地皮菜   三阴性乳腺癌   网络药理学   分子对接   AKT1  

摘要： 目的采用网络药理学方法和分子生物学实验探究地皮菜抗三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)的活性成分与靶点。方法查阅文献并结合实验室前期研究收集地皮菜的活性成分,采用Swiss Target Prediction数据库进行靶点预测,TTD、Genecards和OMIM数据库获取TNBC靶点。应用STRING在线平台进行蛋白互作,使用Metascape数据库进行KEGG信号通路和GO基因功能富集分析。通过AutoDock软件将地皮菜成分N-乙酰基色胺与靶点AKT1进行分子对接。采用Annexin V-FITC/PI双染色法检测地皮菜活性成分对乳腺癌细胞凋亡的影响。利用RT-qPCR和Western blotting检测地皮菜活性成分抗TNBC的作用机制。结果网络药理学结果发现N-乙酰基色胺、Scytonemin和Nostocionone等8个有效成分,涉及细胞信号传导和AKT1、STAT3、CCND1等75个关键靶点。KEGG信号通路和GO基因功能富集分析结果涉及癌症相关信号通路、PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路等。分子对接显示N-乙酰基色胺与AKT1的亲和作用较好。N-乙酰基色胺对乳腺癌细胞没有明显的促凋亡作用,Western blotting结果显示N-乙酰基色胺下调了AKTI的蛋白表达量。RT-qPCR结果显示N-乙酰基色胺可以有效降低乳腺癌细胞AKT1的mRNA表达。结论N-乙酰基色胺可能通过抑制AKT1信号通路抑制TNBC细胞增殖,从而发挥抗TNBC作用。

关键词： 三阴性乳腺癌   穿心莲内脂   YAP蛋白   上皮间质转化  

摘要： 目的通过体内外实验,探讨穿心莲内酯(andrographolide,Andro)对三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移、干细胞特性和上皮间质转化进程的影响及可能作用机制。方法利用磺酰罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)比色法检测细胞活性;采用细胞划痕实验、流式技术和干细胞成球实验检测细胞迁移能力、干细胞增殖能力及CD44^(+)/CD24^(-/low)的比例;Western Blot实验检测NESTIN、NANOG、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Fibronectin、p-YAP、YAP、ANKRD1蛋白的表达。采用小鼠移植瘤实验检测Andro对乳腺癌细胞体内增殖和小鼠致瘤性的作用。利用免疫组化实验检测各组肿瘤组织中YAP和ANKRD1的表达。结果体外实验结果表明:Andro可剂量依赖性降低MDA-MB-231和4T1细胞活性;与对照组比较,经Andro干预后的MDA-MB-231和4T1细胞的划痕愈合率降低,CD44^(+)/CD24^(-/low)比例下降,干细胞微球的体积减小和数量降低(P<0.05),NESTIN、NANOG、Vimentin、N-cadherin、Fibronectin、YAP和ANKRD1蛋白表达下降,而E-cadherin和p-YAP的表达上升。体内实验结果表明:与对照组相比,经Andro干预的小鼠肿瘤体积和肿瘤质量减小,肿瘤组织中YAP和ANKRD1的表达下降(P<0.01)。结论Andro可通过调控Hippo/YAP信号通路发挥抗三阴性乳腺癌的作用。

关键词： 网络药理学   山茱萸-虎杖   三阴性乳腺癌   分子对接  

摘要： 目的利用网络药理学方法结合分子对接探究山茱萸-虎杖药对治疗三阴性乳腺癌的作用机制。方法采用TCMSP数据库获取药物的化学成分及其相关靶点;选择Gene Cards和OMIM数据库收集疾病的相关靶点,筛选出二者的共同靶点后可绘制蛋白质互作(PPI)网络;对关键靶点进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因组与基因组百科全书通路(KEGG)通路富集分析,最后进行分子对接验证。结果筛选得到药物有效成分共20个;疾病相关靶点1512个,与药物共同靶点47个。通过PPI网络得出ESR1、EGFR和PTGS2为关键靶点。GO通路和KEGG富集分析显示,山茱萸-虎杖药对通过参与多种生物学过程抗三阴性乳腺癌;通过PI3K-Akt等信号通路调控病理进程。分子对接显示活性成分与核心靶点之间有较好的结合力。结论山茱萸-虎杖可以通过多成分、多靶点、多途径发挥抗三阴性乳腺癌的作用,从而为其临床应用及相关机制的研究提供理论依据。

关键词： 余甘子   三阴性乳腺癌   网络   药理学  

摘要： 目的借助网络药理学方法和实验验证方法探究余甘子抗三阴性乳腺癌(TNBC)的作用机制。方法1.网络药理学方法:1)通过TCMSP数据库分析余甘子活性成分,2)借助Pharm Mapp数据库进行作用靶点垂钓,3)利用生物信息学方法筛选TNBC差异表达基因,4)进行GO生物功能和KEGG通路富集分析,5)运用STRING数据库进行蛋白质互作网络的构建,6)使用Kaplan-Meier Plotter工具对相关靶点作生存分析,2.实验验证方法:1)用CCK-8法探究余甘子粗提物对MDA-MB-231细胞生长的影响,2)以划痕实验探究余甘子粗提物对三阴性乳腺癌细胞迁移能力的影响。结果1.网络药理学方法结果:1)通过TCMSP数据库获得余甘子有效活性成分21个,2)通过靶点垂钓分析得到作用靶点115个,3)通过TNBC差异基因分析发现2876个基因表达发生显著变化,4)余甘子有29个主要作用靶点影响孕酮受体、激素调节信号传导、乳腺细胞分化和中心体分离等通路,5)确定关键靶点为AURKA、PGR、AR、CCNA2、PPARG,6)AURKA、CCNA2的低表达与PGR、AR、PPARG的高表达与患者生存预后呈正相关关系;2.实验验证方法结果:1)确定了余甘子粗提物IC_(50)=6.1μg·mL^(-1),2)余甘子粗提物显著抑制MDA-MB-231细胞迁移。结论1.网络药理学结论:1)确定了余甘子抗TNBC的21种主要活性成分,2)预测其关键靶点为AURKA、PGR、AR、CCNA2、PPARG;2.实验验证结论:余甘子粗提物能够明显抑制MDA-MB-231细胞的生长和迁移。

关键词： 半枝莲   网络药理学   三阴性乳腺癌   靶基因   信号通路  

摘要： 目的利用网络药理学探讨半枝莲治疗三阴性乳腺癌的作用机制。方法本研究采用网络药理学方法,主要包括靶点预测、网络构建和功能富集。从中药系统药理学数据库与分析平台中获取“半枝莲”所有化合物靶点,并与其活化物进行匹配,发现木犀草素和汉黄芩素为主要相关化合物。构建蛋白-蛋白相互作用网络获得相关靶点信息,构建半枝莲与三阴性乳腺癌相关靶点网络,分析半枝莲抗三阴性乳腺癌的关键信号通路。结果共获得15个活性化合物的104个靶点。网络分析得出10个半枝莲治疗三阴性乳腺癌的关键靶点。功能富集分析表明,半枝莲可能通过协同调节多种生物学相关信号通路,对三阴性乳腺癌产生治疗作用。结论半枝莲治疗三阴性乳腺癌的药理机制可能与其协同调节细胞凋亡、细胞周期、分化、增殖、迁移、侵袭和血管生成密切相关。

关键词： 山慈菇   三阴性乳腺癌   网络药理学   分子对接  

摘要： 本研究基于网络药理学与分子对接的方法探讨山慈菇治疗三阴性乳腺癌的作用机制。利用TCMSP数据库和文献中获得山慈菇化学成分,在Swiss Target Prediction平台上搜索活性成分靶点;采用OMIM、GeneCards数据库检索三阴性乳腺癌靶点,并通过String构建蛋白质互作网络,使用DAVID数据库对核心靶点进行GO分析和KEGG通路富集分析;另外选取部分化合物和靶点使用Autodock软件进行分子对接验证;运用Western blot法检测相关调控靶点蛋白的表达。结果显示,共筛选出12个山慈菇活性成分,97个关键靶点,分子对接发现主要靶点HSP90AA1、EGFR、MAPK1、JUN和PIK3CA均与活性成分对接较好。山慈菇的作用靶点富集于PI3K-AKT信号通路,山慈菇通过降低p-AKT和p-PI3K的表达水平进行调控乳腺癌细胞的增殖、凋亡和迁移。本研究初步预测了山慈菇的有效活性成分、关键靶点和作用机制,可为山慈菇治疗三阴性乳腺癌的临床应用提供依据。

关键词： 喜树   喜树碱   铁死亡   光热治疗   化疗耐药   三阴性乳腺癌   肿瘤主动靶向   递药系统  

摘要： 研究背景:喜树碱是从喜树中提取分离得到的生物碱,主要通过作用于细胞内的拓扑异构酶I抑制DNA合成以达到抗肿瘤的作用。喜树碱完整的内酯环是抑制拓扑异构酶I的药效基团。喜树碱通过诱导细胞凋亡的形式杀死肿瘤细胞,极易发生多药耐药导致化疗失败。因此,将喜树碱以内酯环形式递送至肿瘤细胞,并能克服肿瘤对喜树碱的耐药,具有重要的研究价值。铁死亡是不同于细胞凋亡的一种程序性细胞死亡形式,在肿瘤治疗中发挥重要作用。铁死亡的本质是细胞内过量的游离铁催化过氧化氢,产生大量的ROS,进而氧化细胞膜上的脂质,形成大量的脂质氢过氧化物。因此,向肿瘤细胞内递送铁离子,有望通过铁死亡途径杀死耐药肿瘤细胞,从而克服肿瘤耐药。多巴胺可以与金属离子配位,在碱性环境下能够进行氧化自聚合反应,形成具有超强细胞黏附特性的聚多巴胺（Polydopamine,PDA）纳米粒。聚多巴胺纳米粒具有优异的光热转化能力和p H响应性的释放特性。聚多巴胺的网状结构也可以高效负载药物,另外,多巴胺结构上的氨基利于结构修饰,将肿瘤靶向基团叶酸连接在多巴胺上,还能够增强聚多巴胺纳米粒的肿瘤主动靶向特性。三阴性乳腺癌由于难以采用抗体和免疫治疗,化学治疗成为治疗三阴性乳腺癌的主要方法。而传统化疗由于易产生耐药性,协同治疗成为治疗三阴性乳腺癌并克服耐药的有前景的方法。研究目的:选用多巴胺和叶酸修饰的多巴胺为载体材料,通过氧化自聚合反应,制备共同负载CPT和Fe3+的肿瘤主动靶向纳米粒CPT/Fe@PDA-FA。将纳米粒靶向递送至肿瘤部位,实现纳米粒的高效入胞,并在细胞内p H响应刺激下释放CPT和Fe3+,利用PDA纳米粒的光热特性,实现基于喜树碱的凋亡、铁死亡与光热三联合肿瘤靶向治疗作用,多途径协同杀死耐药肿瘤细胞。研究方法:1.采用多巴胺与叶酸为原料,通过酰胺化反应,合成叶酸修饰的多巴胺肿瘤靶向材料,经过核磁共振波谱及红外光谱对目标化合物进行表征确证。2.以多巴胺及不同比例的叶酸修饰的多巴胺为原料,通过氧化自聚合反应,并利用多巴胺结构中的酚羟基与Fe3+的配位作用以及聚多巴胺网格结构与喜树碱平面结构的π-π堆积实现Fe3+和CPT的高负载,得到共同负载Fe3+和CPT的肿瘤主动靶向纳米粒CPT/Fe@PDA-FA;采用动态光散射激光粒度仪、高效液相色谱仪、紫外分光光度计、扫描电子显微镜与透射电子显微镜对纳米粒的粒径、多分散指数（PDI）、zeta电位、载CPT量、载铁量、稳定性、形态学及元素分布进行评价。***/Fe@PDA、CPT/Fe@PDA-FA5、CPT/Fe@PDA-FA10及CPT/Fe@PDA-FA20分别与4T1-Luc细胞共孵育后,通过激光共聚焦显微镜观察纳米粒的摄取量,筛选最优纳米粒。采用红外热成像仪考察CPT/Fe@PDA-FA10纳米粒的光热转化性能;考察CPT/Fe@PDA-FA10纳米粒的p H响应性释药特性、体外药物释放动力学及溶血作用。4.采用MTT实验、细胞克隆形成实验及活死细胞染色实验,考察CPT/Fe@PDA-FA10的体外抑制耐药三阴性乳腺癌细胞的增殖活性。5.采用MTT实验、ROS及LPO染色后激光共聚焦实验、GSH及MDA含量测定实验、生物透射电镜及Western blot等实验,观察细胞增殖活性、检测ROS、LPO、GSH及MDA含量、观察线粒体形态及观察铁死亡相关蛋白（GPX4和SLC7A11）的表达等,考察CPT/Fe@PDA-FA10的体外抑制耐药三阴性乳腺癌细胞的铁死亡活性。6.采用凋亡染色流式实验及Western blot实验,考察CPT/Fe@PDA-FA10的体外抑制耐药三阴性乳腺癌细胞的凋亡活性。7.采用MTT竞争性生长抑制实验及激光共聚焦竞争性摄取实验,考察CPT/Fe@PDA-FA10的肿瘤主动靶向作用及细胞摄取机制。8.通过原位注射4T1-Luc/CPT耐药细胞至乳腺,构建原位耐药三阴性乳腺癌裸鼠模型;通过红外热成像仪观察CPT/Fe@PDA-FA10在荷瘤裸鼠体内的光热转化性能。9.通过游标卡尺测量原位耐药三阴性乳腺癌的体积,小动物活体成像系统拍摄裸鼠肿瘤的荧光强度,考察CPT/Fe@PDA-FA10对裸鼠原位耐药三阴性乳腺癌生长的抑制作用。10.通过肿瘤组织的H&E染色、TUNEL染色、ROS染色、LPO染色、Ki67染色、Western blot实验、MDA和GSH的含量检测及Caspase 3、Bcl-2、GPX4和SLC7A11免疫荧光染色实验,考察CPT/Fe@PDA-FA10抗原位耐药三阴性乳腺癌的机制。11.通过称量荷瘤裸鼠体质量,检测裸鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的活性,以及血清尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）的含量,裸鼠的心、肝、脾、肺及肾组织的H&E染色,考察CPT/Fe@P

关键词： 姬松茸   活性成分   抗三阴性乳腺癌   生物活性   作用机制  

摘要： 三阴性乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer,TNBC)是一种不表达雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)或人表皮生长因子受体2(HER-2)的特定乳腺癌亚型,具有高侵袭性、高转移性、易复发和预后不良等多种临床特征,目前,化疗是最重要的治疗方法,但后期化疗药物的耐药性导致临床效果不佳。因此从天然产物中寻找高效抗三阴性乳腺癌的先导化合物迫在眉睫,具有极大的价值和意义。 姬松茸(Agaricus Blazei Murill,ABM)又名巴西蘑菇,是一种珍贵的药、食两用真菌,具有丰富的食用和药用价值,且安全性高,具有多样化的生物活性,如抗肿瘤、抗病毒,抗氧化、降血糖、免疫调节等。目前在多种疾病已得到广泛运用,如肝炎、糖尿病、增强机体免疫功能以及辅助癌症治疗等,但姬松茸的抗肿瘤活性研究集中于含量较多的多糖成分,在此基础上本课题组前期通过抗肿瘤活性筛选发现其非多糖成分亦具有很强的抗三阴性乳腺癌作用,但目前对姬松茸中非多糖成分抗三阴性乳腺癌的物质基础以及作用机制未见任何报道。所以,本课题研究旨在对姬松茸子实体中非多糖部分的化学成分开展一系列的抗三阴性乳腺癌活性与分子作用机制研究,为寻找高效的抗三阴性乳腺癌的先导化合物,以及阐明姬松茸的有效物质基础提供重要依据。 本课题通过硅胶柱层析、开放ODS柱层析、Biotage中低压、半制备型HPLC等多种分离方法,首次从姬松茸子实体中提取分离得到35个单体化合物,经1D-NMR,2D-NMR,MS、旋光等多种波谱学结构鉴定,包括已知化合物26个,新化合物9个,全部为首次从姬松茸中分离得到。结构类型包括甾醇类,萜类,脂链状脂肪酸类、生物碱类、芳香环类等。通过细胞划痕实验、克隆形成实验、transwell实验和细胞凋亡实验等,发现甾醇类化合物BXG-1(新化合物)与8能显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖和迁移,并能够诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡。 综上,本课题首次从姬松茸子实体中分离鉴定了35个化合物(新化合物9个、已知化合物26个),并通过一系列细胞实验发现姬松茸子实体中BXG-1和BXG-8的抗MDA-MB-231细胞的增殖和迁移活性,并诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡的作用,为研究姬松茸抗三阴性乳腺癌的先导化合物提供了重要基础。