关键词： 金属配合物   磺胺二甲嘧啶   抗三阴性乳腺癌   抗炎   铜死亡  

摘要： 目的:合成并表征以邻菲罗啉、磺胺二甲嘧啶或芳香-芳香偶联的二磺胺二甲嘧啶为配体的新型金属(II)基配合物HA-Cu、HA-Co和HA-Ni,通过实验测定HA-Cu、HA-Co和HA-Ni抗肿瘤活性,其中着重研究对三阴性乳腺癌的治疗效果,为治疗三阴性乳腺癌药物的开发提供思路。 方法:第一章:使用磺胺二甲嘧啶、邻菲罗啉与提供Cu(Ⅱ)离子的六水合高氯酸铜盐进行配位反应,合成了Cu(Ⅱ)配合物HA-Cu;以磺胺二甲嘧啶、邻菲罗啉和四水合乙酸钴为原料,在乙酸钴的催化下,原位反应合成了含有芳烃-芳烃偶联的二磺胺二甲嘧啶配体的Co(Ⅱ)配合物HA-Co。使用磺胺二甲嘧啶、邻菲罗啉和六水合氯化镍为原料,在氯化镍的催化下,原位反应合成了含有芳烃-芳烃偶联的二磺胺二甲嘧啶配体的Ni(Ⅱ)配合物HA-Ni。采用红外光谱、元素分析、电感应耦合等离子体质谱、液相色谱质谱联用和X-射线衍射对合成的配合物进行表征。第二章:通过细胞毒性实验、细胞摄取实验、分子对接实验、HUVEC管状结构形成实验、细胞凋亡实验、活性氧实验、线粒体膜电位实验、蛋白免疫印迹实验、MDA-MB-231细胞异种移植构建裸鼠肿瘤模型实验、HE染色实验和免疫组化分析实验,探究HA-Cu、HA-Co和HA-Ni的抗肿瘤活性。 结果:第一章:成功合成了HA-Cu、HA-Co和HA-Ni,并获得了它们的单晶结构。第二章:证明了HA-Cu、HA-Co和HA-Ni具有广谱的细胞毒性,也能被MDA-MB-231细胞所摄取,从而抑制细胞的生长。HACu能与VEGF蛋白的活性位点结合,从而抑制VEGF的活性。HA-Cu、HA-Co和HA-Ni不仅能有效抑制HUVECs形成管腔结构,从而阻止内皮细胞生成自身的血管;还能显著上调MDA-MB-231细胞中活性氧的水平,并强烈诱导MDA-MB-231细胞线粒体膜电位的崩溃,导致MDA-MB-231细胞显著凋亡。HA-Cu通过下调MDA-MB-231细胞中VEGF/VEGFR2信号转导途径中的ERK1/2、AKT、FAK、VEGFR2以及磷酸化蛋白p-AKT、p-FAK和p-VEGFR2的表达,从而抑制MDA-MB-231细胞的生存、增殖、转移和肿瘤血管生成;并通过减少炎症因子NF-κB、p-NF-κB、TNF-α和IL-1β的表达来抵抗炎症,从而抑制肿瘤生存和发展;其阻断Caspase-9信号通路可能促进I型干扰素的产生,增强肿瘤特异性的T细胞和放疗介导的抗肿瘤免疫;通过上调促凋亡蛋白Bax的表达和下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来诱导肿瘤细胞凋亡;通过下调FDX1并上调HSP70蛋白的表达,以铜死亡的方式协同增强肿瘤细胞死亡。在接种了MDA-MB-231细胞的裸鼠异种移植模型中,HA-Cu通过抑制肿瘤组织来源的血管内皮细胞来抑制肿瘤血管生成,并调节上述炎症因子、凋亡相关因子和铜死亡因子来增强抗肿瘤效果,实验数据表明其治疗效果优越于DDP。 结论:HA-Cu、HA-Co和HA-Ni可有效抑制MDA-MB-231细胞的生长。HA-Cu通过抗血管生成、抗炎、细胞凋亡和铜死亡的协同效应在体内和体外都有效地抑制肿瘤生长。总之,本研究为TNBC的治疗提供了潜在的药物候选。

关键词： 三阴性乳腺癌   细胞侵袭   细胞转移   Mayamycin  

摘要： 目的和意义：　　确定Mayamycin对三阴性乳腺癌（TNBC）的抑制作用，检测Mayamycin发挥抗TNBC活性的功能，揭示Mayamycin抗TNBC的作用机制，验证Mayamycin体内抗TNBC效果。　　方法：　　采用CCK8试剂检测Mayamycin在TNBC细胞（MDA-MB-231和BT-549）和正常乳腺上皮细胞（MCF-10A）的细胞毒活性并计算IC50。使用流式细胞术和EdU试剂检测Mayamycin对TNBC细胞周期、增殖和凋亡的影响。利用Transwell实验确定Mayamycin对TNBC细胞侵袭、转移等功能的影响。通过构建异种移植瘤模型验证Mayamycin体内抗TNBC效果。结合基因测序和TNBC的scRNA-seq数据库，分析TNBC中特异激活、明显异常表达且与疾病预后密切相关的下游通路基因。运用靶点预测工具Autodockvina预测Mayamycin的结合位点，通过细胞热位移实验验证预测的结合位点。采用siRNA和Westernblot实验证实Mayamycin抗TNBC的作用机制。　　结果：　　1.与临床常用化疗药物顺铂相比，Mayamycin对TNBC细胞具有更好的选择性毒性和更强的抑制活性。研究发现，Mayamycin对正常乳腺上皮细胞MCF-10A的IC50值为5.76μM，而对TNBC细胞的IC50值分别为0.88和1.43μM，该差异具有统计学意义，表明与正常乳腺上皮细胞相比，Mayamycin对TNBC细胞具有较好的选择性细胞毒活性。此外，临床常用化疗药物顺铂对TNBC细胞的细胞毒活性和选择性均较差。上述结果表明与顺铂相比，Mayamycin对TNBC细胞具有更好的选择性毒性和更强的抑制活性。　　***能够导致TNBC细胞周期S期阻滞和增殖抑制。用Mayamycin分别处理TNBC细胞24h后，流式细胞术检测发现随着Mayamycin浓度增加，细胞周期的S期占比增加，EdU染色阳性的细胞数量明显减少，证实了Mayamycin可导致TNBC细胞周期S期阻滞和增殖抑制。　　***能够诱导TNBC细胞的凋亡。采用流式细胞术检测细胞凋亡的结果表明，随Mayamycin浓度增加或作用时间延长，TNBC细胞的凋亡率逐渐增加。Westernblot实验结果发现Bax/Bcl-2比值上升，证实了Mayamycin可以诱导TNBC细胞Bax/Bcl-2介导的凋亡。　　***能够有效抑制TNBC细胞的侵袭和转移。通过Transwell转移实验和基质胶侵袭实验，发现Mayamycin处理24h后，MDA-MB-231和BT-549细胞的侵袭和转移能力明显随着浓度的增加而降低。针对影响侵袭和转移关键蛋白的Westernblot实验结果证实了Mayamycin可有效抑制TNBC细胞的侵袭和转移。　　***具有体内抗三阴性乳腺癌功能。利用荷瘤小鼠提供体内环境检测Mayamycin的体内抗TNBC效果。结果表明，Mayamycin在剂量为2mg/kg和4mg/kg治疗荷瘤小鼠时可有效抑制小鼠皮下TNBC肿瘤的生长，联合顺铂治疗，肿瘤生长抑制效果优于单独使用Mayamycin或顺铂。证实了Mayamycin具有体内抗三阴性乳腺癌功能。　　6.通过检测Mayamycin处理前后MDA-MB-231的转录组学测序联合TNBC的scRNA-seq数据进行生物信息学分析，发现Mayamycin可以下调TNBC细胞中疾病预后相关基因STMN1的表达。　　7.下调STMN1的表达抑制TNBC细胞的侵袭和转移。小干扰RNA抑制TNBC细胞的STMN1基因表达后检测TNBC细胞的转移侵袭水平情况，证实了下调STMN1可抑制TNBC细胞的侵袭和转移。　　***可结合CDK7。Autodockvina软件对人类蛋白分子预测结构与Mayamycin分子进行批量模拟对接，发现Mayamycin与CDK7存在结合位点，具有较低的结合能。细胞热位移实验结果表明Mayamycin可提高CDK7的稳定性，证明Mayamycin可与CDK7结合，形成配体-蛋白质复合物。　　结论：　　本研究发现，Mayamycin对TNBC具有选择性的细胞毒活性。Mayamycin具有抑制TNBC细胞周期进程、增殖、侵袭转移和促进TNBC细胞凋亡的功能。Mayamycin可直接结合CDK7蛋白，以及通过下调STMN1表达抑制TNBC细胞侵袭迁移。本研究首次证明Mayamycin具有体内抑制TNBC肿瘤生长效果。

关键词： 飞燕草素   乳酸化修饰   糖酵解   PI3K/AKT/mTOR   自噬  

摘要： 研究背景与目的: 近年来,三阴性乳腺癌因其具有高复发性,高转移性,受到科研学者和临床医生的关注。糖酵解作为能量代谢的标志之一,在肿瘤生长繁殖中有着重要作用。乳酸化修饰作为新近发现的一种新型蛋白质翻译后修饰,在肿瘤调控方面仍处于空白。来自草本植物和蔬果类的花青素在治疗和预防癌症方面具有潜在的有益作用。课题组前期研究证实,花青素中的飞燕草素可以激活自噬,抑制三阴性乳腺癌细胞增殖。然而,目前并未有研究将乳酸化修饰和糖酵解途径、自噬通路结合起来。本研究拟从体内体外两方面,探讨飞燕草素通过糖酵解途径调控乳酸化修饰,抑制PI3K/AKT/m TOR轴,诱发自噬的机制研究。以期为飞燕草素作为植物化学物质抗乳腺癌的预防和治疗提供理论基础和实验依据。 材料与方法: 1.选择不同浓度的飞燕草素处理三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231、BT549)24h造模,CCK-8法检测细胞活力,筛选浓度进行后续实验。集落形成实验检测飞燕草素对三阴性乳腺癌细胞的侵袭能力;划痕实验检测飞燕草素对三阴性乳腺癌细胞的迁移能力。采用乳酸试剂盒、葡萄糖试剂盒、ATP试剂盒和丙酮酸试剂盒检测飞燕草素对三阴性乳腺癌细胞内的乳酸含量、葡萄糖摄取量、ATP生成量和丙酮酸含量的影响。 2.将三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)分为对照组和给药组(Delphinidin处理24h),分别进行蛋白提取和酶切,用赖氨酸乳酸化泛抗体亲和富集,检测蛋白乳酸化的修饰水平变化,再用液相色谱串联质谱(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MC)检测富集到的乳酸化肽段,进行蛋白定量分析,利用KEGG、Protein domain、COG/KOG和STRING数据库对显著差异蛋白进行生物学信息分析。 3.用2-脱氧-D-葡萄糖(2-Deoxy-D-glucose,2-DG)和Rotenone提前处理三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231、BT549)24h,然后用飞燕草素再处理24h,随机分为空白组,2-DG组,Rotenone组,2-DG+飞燕草素组,Rotenone+飞燕草素组。利用RT-q PCR和Western blotting实验观察糖酵解途径中相关基因和蛋白的表达,观察PI3K/AKT/m TOR通路和自噬蛋白LCⅡ/Ⅰ蛋白的表达,并用透射电镜观察细胞内自噬小体的数目。另外,采用乳酸试剂盒、葡萄糖试剂盒、ATP试剂盒和丙酮酸试剂盒检测三阴性乳腺癌细胞内的乳酸含量、葡萄糖摄取量、ATP生成量和丙酮酸含量。同时,选用4周龄的BALB/c-nu裸小鼠作为实验对象,选择MDA-MB-231细胞建立裸鼠皮下异种移植瘤模型。分为control组、飞燕草素组、2-DG组和飞燕草素+2-DG组。每周检测裸鼠重量和瘤体体积,利用免疫组织化学染色技术检测肿瘤组织中PKM2、PFKFB3和Pan kla蛋白的表达情况。 结果: 1.飞燕草素对三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231、BT549)存在抑制作用,且细胞存活率随飞燕草素浓度的增加而降低。用不同浓度的飞燕草素处理细胞24h后,进行细胞划痕实验和集落形成实验,发现飞燕草素可以抑制MDA-MB-231细胞和BT549细胞的迁移和增殖能力,呈剂量依赖性。通过酶标法发现飞燕草素可以降低三阴性乳腺癌(MDA-MB-231、BT549)中与糖酵解有关的乳酸含量、葡萄糖摄取量、ATP生成量和丙酮酸含量。 2.通过motif分析,我们在经过飞燕草素处理后的三阴性乳腺癌细胞中找到了发生赖氨酸乳酸化修饰的肽段序列特征。根据1.5倍差异表达量作为明显差异上下调的变量阈值,筛选得到255个乳酸化修饰位点数。其中,上调的乳酸化修饰位点为160个,下调的乳酸化修饰位点为95个。同时,共有128个乳酸化水平上调的蛋白与88个乳酸化水平下调的蛋白。从COG/KOG分类结果可知,发生显著上调的蛋白质主要在蛋白质转录、功能预测、RNA加工和修饰、染色质结构等方面,显著下调的蛋白质主要在蛋白质翻译、核糖体结构和生物发生、信号转导机制等方面。根据亚细胞定位,发现发生赖氨酸乳酸化修饰的在细胞质中占65.2%,最低的在细胞质核内占3.43%。基于GO富集分析,发现蛋白P13051、P51608、Q9Y3T9等分别在生物过程,分子功能,细胞成分中起着重要作用。从蛋白结构域结果来看,发生赖氨酸乳酸化修饰的蛋白位点主要集中于锌指结构。另外,将筛选出来的前50个蛋白,进行蛋白互作网络分析,发现HDAC2、CHD4、NOCL2等蛋白均与糖酵解途径相关。我们推测,乳酸化修饰和糖酵解途径之间存在着联系,开展了第三部分相关实验。 3.2-DG和Rotenone呈剂量依赖性抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖。对照组和2-DG组相比,2-DG降低了细胞

关键词： 三阴性乳腺癌   ChaxineB   细胞凋亡   铁死亡  

摘要： 目的：三阴性乳腺癌是乳腺癌中的一种特殊的分子亚型，是乳腺癌治疗中的一大难题。由于其发病年龄低，生存期短，易转移侵袭，后期化疗耐药等特点，迫切需要寻求治疗三阴性乳腺癌（triple-negativebreastcancer,TNBC）的新药物。目前从天然产物资源中寻找治疗TNBC的活性化合物是一种有效的策略。本课题选择课题组前期从蘑菇姬松茸中分离出的单体化合物ChaxineB（CAB）进行研究，前期活性筛选发现，CAB具有显著的抑制人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞增殖作用，故本课题拟深入地对CAB抑制MDA-MB-231细胞增殖、转移、侵袭和诱导细胞凋亡及铁死亡的作用机制进行研究。　　方法：　　***法筛选有效抗肿瘤化合物CAB，检测不同浓度、不同干预时长的CAB对包含MDA-MB-231细胞的多种癌症细胞的增殖抑制作用。　　2.细胞克隆实验、Transwell实验、划痕实验检测CAB对MDA-MB-231细胞的增殖、迁移、侵袭的影响。　　***检测黏附蛋白E-cadherin、N-cadherin;凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、PARP。　　4.抑制剂筛选细胞死亡方式。　　5.流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期、Ca2+、ROS水平。　　6.共聚焦显微镜分析ROS水平。　　7.线粒体膜电位检测。　　***染色检测细胞凋亡。　　9.脂质氧化MDA检测。　　***-qPCR检测铁死亡标志性基因Aifm2、Gpx4、Acsl4、Slc7a11、Nfe2l2、Tp53。　　结果：***对多种癌症细胞增殖的作用。CAB对多种癌症细胞均有抑制增殖的作用，其中对三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞增殖抑制作用最为明显，CAB处理后多种细胞出现了不同程度的生长缓慢现象（P＜0.05orP＜0.001）;***对MDA-MB-231细胞的增殖、迁移、侵袭的影响。细胞克隆形成实验发现，CAB处理降低MDA-MB-231细胞（P＜0.01orP＜0.001）和4T1细胞（P＜0.05,P＜0.01orP＜0.001）的克隆形成能力;划痕实验显示，CAB对MDA-MB-231细胞呈浓度依赖型抑制迁移作用（P＜0.001）;且CAB使MDA-MB-231细胞内粘附蛋白E-cadherin表达增加（P＜0.05orP＜0.001）、N-cadherin表达减少（P＜0.01orP＜0.001），进而抑制肿瘤细胞转移;Transwell实验发现CAB的抗侵袭作用，且呈浓度依赖性（P＜0.05orP＜0.001）;***诱导MDA-MB-231细胞发生死亡的方式。取活性氧抑制剂Acetylcysteine（NAC）、凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、自噬抑制剂3-Methyladenine（3-MA）、坏死抑制剂Necrostatin-1（Nec）、铁死亡抑制剂Deferoxamine（DFO）和Ferrostatin-1（Ferr-1）对死亡方式进行筛选，结果显示CAB干预可使MDA-MB-231细胞产生凋亡（P＜0.01）、铁死亡（P＜0.01）;***诱导MDA-MB-231发生凋亡。CAB干预后细胞出现线粒体膜电位的下降;流式细胞术检测细胞凋亡，验证CAB具有诱导MDA-MB-231细胞凋亡的作用;周期检测显示MDA-MB-231细胞经CAB处理产生了G1期阻滞;Hoechst染色检测结果显示CAB干预使MDA-MB-231细胞发生凋亡;通过流式细胞术和共聚焦显微镜观测可见CAB使细胞内活性氧水平增加;20μM的CAB使凋亡蛋白Bax增加（P＜0.001）、Bcl-2减少（P＜0.001）、PARP减少（P＜0.001）、Bcl-2/Bax的表达下调（P＜0.001）;***诱导MDA-MB-231发生铁死亡。WesternBlot结果显示，CAB干预可使铁死亡关键蛋白GPX4下降（P＜0.01orP＜0.001）;与空白对照组相比，CAB干预组MDA产生增多（P＜0.001）;CAB干预后相关铁死亡标志性基因表达Aifm2（P＜0.05,P＜0.01orP＜0.001）、Acsl4（P＜0.01orP＜0.001）、Tp53（P＜0.01orP＜0.001）基因表达显著上调，Nfe2l2（P＜0.05）、Slc7a11（P＜0.001）、Gpx4基因表达显著下调（P＜0.05,P＜0.01orP＜0.001）;6.化合物CAB能够促进MDA-MB-231细胞内Ca2+浓度增加，且Ca2+浓度与药物剂量、时间呈正相关。钙离子螯合剂EGTA、BAPTA的使用（P＜0.01）验证CAB干预造成的胞内Ca2+增加和ROS间存在关联。　　结论：　　***呈剂量依赖性抑制三阴性乳腺癌

关键词： 树突状细胞   肿瘤复发   水凝胶   免疫治疗  

摘要： 三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）作为一种恶性程度极高的乳腺癌亚型,临床预后较差。目前,手术辅以放/化疗仍是临床治疗TNBC的主要方式,但因其高度异质性及高侵袭性常导致术后治疗效果不理想。不可避免的复发和转移已成为大多数TNBC患者死亡的主要原因。近年来,免疫治疗为临床上恶性肿瘤及转移瘤的治疗提供了有效的策略,并逐步改变了TNBC的治疗模式。 树突状细胞（Dendritic cells,DCs）作为机体功能最强的专职抗原提呈细胞,在启动特异性抗肿瘤免疫中发挥重要作用。目前基于DCs的免疫疗法主要通过制备DCs疫苗或DCs联合其他肿瘤治疗方式如放/化疗、免疫靶点抑制剂疗法等,以增强机体的抗肿瘤免疫效应。但DCs作为抗肿瘤免疫治疗的主要免疫细胞,其在免疫治疗过程中仍受到一定限制。一方面,术后肿瘤部位已有抗肿瘤的特异性效应T细胞的存在,但未成熟DCs浸润居多。未成熟DCs不仅无法有效激活效应T细胞,还可导致免疫耐受的产生,能否有效逆转DCs的功能障碍成为肿瘤免疫治疗的关键。另一方面,DCs凋亡、DCs分化受抑制以及趋化因子分泌减少等诸多因素,显著地抑制了肿瘤部位DCs的浸润数量。因此如何安全有效地募集内源性DCs也成为治疗的另一关键方面。 基于以上两个方面,改善TME中未成熟DCs的免疫抑制状态,促进DCs成熟,并有效增加DCs在肿瘤部位的浸润,是提高疫苗治疗效果、促进机体抗肿瘤免疫的关键所在。水凝胶作为一种新兴材料,具有良好的生物相容性,能够在局部区域更好的实现药物释放,已广泛应用于药物递送领域。因此本研究以水凝胶作为递送载体,开发基于调控DCs募集与活化的可注射免疫治疗性水凝胶。 本研究包括以下三部分: 1、免疫治疗性水凝胶的制备及表征:首先构建负载XCL-1、ABs@Dz的水凝胶,使用XCL-1趋化因子解决DCs浸润少的问题;同时利用疏水作用将含肿瘤抗原的凋亡小体（Apoptotic bodies,ABs）连接上修饰有胆固醇基团的DNAzyme,特异性沉默DCs成熟抑制基因STAT3,协同促进DCs的成熟与活化,将上述两种材料共同负载于蚕丝蛋白水凝胶（Silk protein hydrogel,SPH）中。经荧光显微镜、流式细胞术、TEM（Transmission electron microscope）、荧光分光光度计等实验验证ABs的提取及ABs@Dz的成功合成;通过释放性实验验证SPH具有优良的缓释能力;通过催化活性实验验证DNAzyme切割靶基因的能力;体外CCK-8与活死染实验,体内伤口愈合实验及SPH降解性检测验证了该SPH具有良好的生物安全性且注射后不发生显著降解。 2、免疫治疗性水凝胶的体外抗肿瘤实验研究:通过流式细胞术、共聚焦检测ABs@Dz的细胞摄取能力;Transwell实验验证XCL-1对DCs的募集作用,流式细胞术检测DCs表面MHC-II类分子与CD86的表达水平、ELISA检测IL-12 p70、TNF-α的分泌水平,验证ABs@Dz可有效促进DCs的成熟与活化;通过流式细胞术检测CD3、CD8的表达水平验证DCs对T细胞的激活能力;CCK-8实验验证活化后的CD8+T细胞对4T1的特异性杀伤作用。 3、免疫治疗性水凝胶的体内抗肿瘤实验研究:构建4T1荷瘤小鼠肿瘤切除后复发模型,通过小鼠体重、肿瘤体积大小证实该免疫治疗性水凝胶（ABs@SDz+XCL-1@SPH）可有效抑制肿瘤生长,肿瘤组织H&E、TUNEL、Ki67免疫组织化学染色及心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的H&E验证该免疫治疗性水凝胶可促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖;通过免疫组化验证DNAzyme对STAT3基因的沉默能力;流式细胞术分析验证了该免疫治疗性水凝胶可促进肿瘤部位DCs的募集及活化,促进CD8+T细胞的有效浸润,激活局部免疫应答;ELISA检测血清中IL-6、IL-12 p70的分泌,验证该免疫治疗性水凝胶具有激活全身免疫的作用。 以上实验结果显示,该免疫治疗性水凝胶使用XCL-1趋化因子联合ABs与STAT3靶点的DNAzyme,协同改善TME中DCs免疫抑制状态,促进DCs的成熟,并提高T细胞的激活水平。这种基于DCs的双重调控策略有效促进了机体的抗肿瘤免疫效应,为抑制TNBC复发提供了新的思路与方法。

关键词： DNA损伤修复   ATR蛋白   视网膜母细胞瘤蛋白(RB)   三阴性乳腺癌(TNBC)  

摘要： 背景与目的: 三阴性乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer,TNBC)是一种恶性程度高、预后最差的乳腺癌亚型,约占乳腺癌病理类型的15～20%;因分子靶标匮乏,TNBC的临床治疗仍以放化疗为主。DNA损伤修复包括DNA损伤的应答(DNA Damage Response,DDR)及修复,其间涉及多种修复蛋白的参与及重要核酸中间体的形成,是应对各类DNA损伤维持基因组稳定的重要系统。由于肿瘤细胞增殖迅速、复制压力大并普遍存在DNA修复缺陷,靶向DNA损伤修复是一种极具潜力的抗肿瘤新策略。 共济失调毛细血管扩张突变基因和Rad3相关激酶(Ataxia Telangiectasia Mutated and Rad-3 Related Kinase,ATR)蛋白是DNA损伤修复中重要的功能蛋白,针对该蛋白开展化学干预研究具有广阔应用前景,但靶向其抗肿瘤的分子机制及精准治疗策略仍不明确,严重制约小分子抑制剂的开发与临床使用。 本研究评价并总结了ATR抑制剂抗TNBC活性与肿瘤分型的关系,发现了视网膜母细胞瘤蛋白(Retinoblastoma,RB)表达高低对ATR抑制剂疗效的影响,阐明了DNA损伤修复新通路ATR-DNAPKcs-RB轴调控TNBC细胞周期的分子机制。据此,本研究提出了靶向ATR-DNAPKcs-RB轴杀伤RB高表达TNBC的抑瘤新策略,也讨论了其在RB低表达TNBC中的应用,为TNBC的精准治疗提供新思路、新策略。 方法与结果: ***抑制剂抗TNBC活性与肿瘤细胞内RB蛋白的表达呈正相关 本研究利用MTT、细胞周期检测、WB等实验验证ATR抑制剂对不同TNBC细胞的毒性以及对其细胞周期进程的影响有明显的选择性。并且,体内实验结果表明ATR抑制剂对不同TNBC细胞的体内抗肿瘤活性也有明显的选择性,并且这种选择性是由于TNBC细胞中RB蛋白表达量的不同,ATR抑制剂对RB阳性细胞增殖抑制作用优于RB阴性TNBC细胞。 2.化学靶向ATR能通过调控hn RNPK蛋白抑制DNAPKcs-RB轴功能,驱动RB阳性细胞由细胞周期G1期向S期转变 本研究利用MTT、WB、RT-q PCR、双荧光素酶报告基因检测、Pull down和质谱分析、RIP等实验探索并验证靶向ATR对不同TNBC毒性和周期进程影响选择性的原因,结果表明,靶向ATR对RB阳性的TNBC细胞毒性强,是由于靶向ATR可以阻断核不均一核糖蛋白K(Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein K,hn RNPK)蛋白在DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA Dependent Protein Kinase Catalytic Subunit,DNAPKcs)非转录区域的招募而下调后者的表达,抑制RB蛋白的表达并激活转录因子E2F1,加速细胞周期由G1期向S期转变。 3.在RB阳性TNBC细胞中靶向ATR-RB轴与HJ可引起致死性损伤 本研究利用WB、生物膜干涉技术(Biolayer Interferometry,BLI)、凝胶迁移阻滞(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)等实验,发现部分ATR抑制剂有组装HJ的能力,且对HJ有高结合亲和力,这部分ATR抑制剂对RB阳性TNBC细胞的毒性和DNA损伤程度更大,结果表明,由于细胞内HJ的稳定和ATR抑制的相加效应,使ATR抑制剂引起高细胞毒性和致命的DNA损伤。 4.在RB阴性TNBC中靶向ATR治疗效果有限,但联合HRR抑制剂可加剧细胞对HJ的敏感性 RB阴性TNBC细胞中,由于ATR-RB信号轴失活,细胞对ATR抑制和HJ不敏感。通过转录组测序(RNA Sequencing,RNA-seq)、MTT等实验,发现RB阴性TNBC细胞中同源重组修复(Homologous Recombination Repair,HRR)相关基因不受ATR抑制和未修复的HJ的影响。并且探究并验证联合靶向HJ和HRR相关蛋白可以为治疗RB缺陷的TNBC提供一种新的方向。 研究结论: 本研究发现了ATR蛋白在细胞周期调控中的新机制,提出了靶向ATR可以增加肿瘤对化疗敏感的新机制,并提出了精准靶向RB阳性TNBC细胞的治疗新策略,同时,为精准靶向RB阴性TNBC细胞的治疗提供了新思路。

关键词： αO-芋螺毒素   GeXIVA[1,2]   三阴性乳腺癌   凋亡   增殖  

摘要： 目的:根据世界卫生组织调查发现,乳腺癌是女性中最高发的癌症类型。临床结果显示乳腺癌肿瘤具有异质性,其中三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）亚型最恶性、常复发,开发针对三阴性乳腺癌的有效治疗药物迫在眉睫。烟碱型乙酰胆碱受体（Nicotinic acetylcholine receptor,n ACh R）是一种离子通道,与肿瘤的发生发展紧密相关。α9 n ACh R的表达能影响肿瘤细胞的凋亡和增殖,阻断α9 n ACh R能抑制肿瘤生长,从芋螺毒素中分离鉴定得到的GeXIVA[1,2]是α9 n ACh R的特异性拮抗剂。本实验旨在探究GeXIVA[1,2]在体内的抗肿瘤疗效和抗肿瘤机制。为开发GeXIVA[1,2]抗肿瘤药物提供科学依据和理论基础。 方法:本研究通过体内外实验共同探究GeXIVA[1,2]对三阴性乳腺癌的作用。首先,通过MTT、克隆形成实验和凋亡流式细胞术检测在体外评价GeXIVA[1,2]对乳腺癌细胞生长和凋亡的作用。随后,通过构建动物模型、肿瘤生长和大小对比等实验在体内评价GeXIVA[1,2]对乳腺癌肿瘤生长的作用。最后通过Western Blot对GeXIVA[1,2]的抗肿瘤反应机制进行研究。除此之外,我们还通过流式细胞术检测了GeXIVA[1,2]对体内肿瘤免疫的影响。 结果:在本实验中,我们旨在研究GeXIVA[1,2]在三阴性乳腺癌中的体内抗肿瘤疗效及其机制。首先,我们发现GeXIVA[1,2]在体内外均具有抗肿瘤活性。在体内,GeXIVA[1,2]处理4T1细胞48和72H的IC50分别为62.52μM和23.99μM。在体外,0.1nmol GeXIVA[1,2]有效抑制了4T1肿瘤的体内生长。其次,我们发现GeXIVA[1,2]可以通过多条通路调控细胞凋亡和细胞增殖。GeXIVA[1,2]通过激活cleaved caspase-3,同时上调Bax/Bcl-2的比例诱导凋亡。GeXIVA[1,2]通过抑制转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）的磷酸化、AKT-m TOR通路及其下游蛋白和核因子κB（Nuclear factor kappa-B,NF-κB）活性等途径抑制细胞增殖。流式细胞术结果显示GeXIVA[1,2]能激活Cytotoxic T细胞和NK T细胞,并促使巨噬细胞向M1极化。 结论:我们通过对比芋螺毒素GeXIVA[1,2]在体内外的抗肿瘤活性,发现GeXIVA[1,2]在4T1小鼠移植瘤模型上用极低的剂量就具有显著的抗肿瘤疗效。体内抗肿瘤分子机制研究表明,GeXIVA[1,2]一方面能通过caspase-3、AKT-m TOR,STAT3和NF-κB等多条通路诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖,另一方面能通过激活体内免疫增强免疫应答反应。本研究为开发芋螺毒素GeXIVA[1,2]成为新型抗肿瘤药物提供科学依据和理论指导。

关键词： 响应性药物递送   饥饿治疗   靶向递送   化疗  

摘要： 随着纳米技术的迅速发展,纳米材料及其在医学上的应用研究已成为近年来科学界的一个热点。在纳米材料中,脂质体是最早被发现的纳米药物载体,并且已经发现脂质体在癌细胞的被动靶向中更有效,是被探索最多且功能最广泛的用于靶向药物递送系统的纳米药物载体。然而,脂质体总是很快从血液中清除。因此,为了提高其在体内的稳定性,研究人员以特定的方式功能化脂质体,从而实现脂质体更高效的靶向。然而构建功能化脂质体主要从两个方面着手:1)利用肿瘤微环境构建特异性响应的脂质体2)对脂质体进行修饰,赋予其具有靶向性的结构或基团。那么,解决了药物递送的问题后,更重要的问题出现了,递送什么样的药物才能够从根本上治疗癌症? 近年来,癌症饥饿疗法成为人们关注的热点。饥饿疗法,顾名思义就是使癌细胞处于能量供应不足的状态而诱导其凋亡。氯尼达明作为一种能够抑制癌细胞的呼吸和糖酵解,在细胞饥饿治疗中有很不错的表现,但是存在水溶性差、靶向性低、易耐药等多种化疗药的常见弊端,将其与功能化脂质体联用,可以将两者的治疗功能发挥到最大,实现更高效的癌症治疗。 本课题构建了一种基于GSH消耗脂质体的多功能纳米载药体系。通过将难溶性的线粒体抑制化疗药氯尼达明包载到GSH消耗的脂质体中,并在表面装载了具有靶向性的多肽衍生物DSPE-PEG2000-RGD,构建了具有肿瘤主动靶向作用的LND@CDC-RGD纳米颗粒。并针对具有极强迁移性和侵袭性的三阴性乳腺癌MDA-MB-231进行了一系列的体内、体外抗肿瘤活性评价。 对于LND@CDC-RGD纳米颗粒的表征主要做了以下工作:1)纳米颗粒的形貌表征,SEM及TEM结果显示,LND@CDC-RGD纳米颗粒呈现规则的球形分布,颗粒大小均匀,粒径在250nm左右,能够满足肿瘤EPR效应的基本要求。Mapping结果显示了LND@CDC-RGD各组分的成功装载。2)通过Zeta对纳米颗粒的稳定性及分散程度进行了表征,同时也侧面证明了DSPE-PEG2000-RGD的装载,结果显示纳米颗粒的Zeta电位达到了19.8m V,具有较强的稳定性,并且能够在血液中均匀分散,实现高效的药物递送。3)通过紫外分光光度法测得LND@CDC-RGD的LND负载率到了（24.35±0.56）%,能够实现药物的高效递送。4)利用质谱法检测了脂质体与GSH发生的Michael加成的产物,证明了LND@CDC-RGD能够在肿瘤部位发生GSH消耗从而实现解体,释放线粒体抑制剂氯尼达明,与脂质体消耗GSH引发细胞凋亡实现了协同“1+1>2”的治疗效果。 对于LND@CDC-RGD纳米颗粒的体外抗肿瘤活性验证主要做了以下工作:1)通过MTT发和Calcein-AM/PI双染法对细胞活力进行了测定,验证了纳米颗粒对癌细胞的抑制作用以及对正常细胞的毒性。2)通过细胞克隆法测定了纳米颗粒处理后癌细胞的增殖力。3)通过ROS染色试剂盒测定了由于GSH消耗引起的癌细胞ROS水平升高的现象。4)通过JC-1染色试剂盒测定了由LND引起的癌细胞线粒体功能异常的现象。5)由于MDA-MB-231细胞具有极强的迁移性和侵袭性,我们还通过划痕实验,评价了纳米颗粒对MDA-MB-231细胞迁移性以及侵袭性的影响。 对于体内抗肿瘤活性评价,做了以下工作:1)通过构建IR780@CDC-RGD进行了裸鼠活体成像,检测了纳米颗粒在体内的运输情况。2)构建MDA-MB-231荷瘤裸鼠模型进行了纳米颗粒的体内抗肿瘤效果,结果显示,LND@CDC-RGD的体内的肿瘤抑制率达到了67.35%。 综上所述,本课题通过构建了一种基于GSH消耗的功能化脂质体,实现了线粒体抑制剂氯尼达明的体内靶向递送,并且LND的线粒体抑制和GSH消耗的脂质体实现了协同治疗“1+1>2”的效果,并对纳米颗粒进行了一系列的体外表征、体外活性、作用机制、体内活性以及靶向递送验证等初步探索,并且进行了结果分析与评价。结果证明LND@CDC-RGD是一种非常有潜力的多功能纳米制剂,实现安全高效的药物递送和抗肿瘤治疗。

关键词： 抗雄激素药物   抗雄激素治疗   肿瘤直径   雄激素受体   叉头   三阴性乳腺癌细胞   李惠利   慢病毒转染  

摘要： 本研究通过抗雄激素药物作用于慢病毒转染构建的叉头框家族蛋白A1(FOXA1)高表达管腔样雄激素受体型(LAR)三阴性乳腺癌(TNBC)细胞株,探究抗雄激素治疗在LAR型TNBC中的作用。一、资料与方法1.一般资料:收集2017年12月至2021年12月宁波市医疗中心李惠利医院三阴性乳腺癌患者共104例。按AR表达分为三组:高表达组(AR≥50%);低表达组(10%

关键词： 地皮菜   三阴性乳腺癌   网络药理学   分子对接   AKT1  

摘要： 目的采用网络药理学方法和分子生物学实验探究地皮菜抗三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)的活性成分与靶点。方法查阅文献并结合实验室前期研究收集地皮菜的活性成分,采用Swiss Target Prediction数据库进行靶点预测,TTD、Genecards和OMIM数据库获取TNBC靶点。应用STRING在线平台进行蛋白互作,使用Metascape数据库进行KEGG信号通路和GO基因功能富集分析。通过AutoDock软件将地皮菜成分N-乙酰基色胺与靶点AKT1进行分子对接。采用Annexin V-FITC/PI双染色法检测地皮菜活性成分对乳腺癌细胞凋亡的影响。利用RT-qPCR和Western blotting检测地皮菜活性成分抗TNBC的作用机制。结果网络药理学结果发现N-乙酰基色胺、Scytonemin和Nostocionone等8个有效成分,涉及细胞信号传导和AKT1、STAT3、CCND1等75个关键靶点。KEGG信号通路和GO基因功能富集分析结果涉及癌症相关信号通路、PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路等。分子对接显示N-乙酰基色胺与AKT1的亲和作用较好。N-乙酰基色胺对乳腺癌细胞没有明显的促凋亡作用,Western blotting结果显示N-乙酰基色胺下调了AKTI的蛋白表达量。RT-qPCR结果显示N-乙酰基色胺可以有效降低乳腺癌细胞AKT1的mRNA表达。结论N-乙酰基色胺可能通过抑制AKT1信号通路抑制TNBC细胞增殖,从而发挥抗TNBC作用。