关键词： 三阴性乳腺癌   微流控法   紫杉醇   ROR1 siRNA   脂质纳米颗粒  

摘要： 三阴性乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer,TNBC）因其进展快、易转移且预后较差,被称为“乳腺癌之王”。TNBC一线化疗药物紫杉醇（Paclitaxel,PTX）主要通过稳定微管使细胞周期停滞,抑制肿瘤细胞生长。然而,PTX的临床应用受到毒副作用等方面的限制。受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（Receptor Tyrosine Kinase-like Orphan Receptor 1,ROR1）作为膜受体参与诸多信号通路,促进TNBC的增殖和远端转移。基于核糖核酸干扰（Ribonucleic Acid Interference,RNAi）疗法的ROR1小干扰RNA（Small Interfering RNA,si RNA）可有效沉默和干扰ROR1基因的表达,抑制TNBC的生长和迁移。遗憾的是,裸RNA在体内易被降解,递送困难,这使得RNAi疗法在TNBC治疗中受到严重限制。因此,需要寻找合适的递送载体。脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle,LNP）作为一种高效的核酸药物递送载体,可保护ROR1 si RNA递送至靶细胞。同时,微流控法可解决传统LNP制备工艺中粒径分布广及批次间重复性差等问题。基于上述背景,我们利用微流控法制备共载PTX及ROR1 si RNA的脂质纳米颗粒（PR-LNP）,减少PTX的毒副作用,并沉默ROR1基因的表达。本研究主要包括以下三个方面: ***-LNP的制备 通过微流控法制备PR-LNP,以PTX包封率、琼脂糖凝胶中RNA迁移距离为评价指标,采用单因素控制变量法对磷脂的质量、水相介质、氮磷比等因素进行优化。经研究确定最优处方及制备工艺:DOTAP:DOPE:CHOL:DSPE-PEG2000的质量比为14:56:5:3、水相介质为10 n M p H 4.0柠檬酸盐缓冲液、吐温-80占水相体积的1.5%、药脂比为1:20、氮磷比为8、有机相和水相的流速比为1:3及总流速0.5m L/min。 ***-LNP的表征 对PR-LNP的粒径与电位、形态、包封率和载药量等理化性质及稳定性进行考察,并评价了PR-LNP的体外释放特性。结果显示,PR-LNP粒径为148.50±0.80nm、PDI为0.24±0.02、电位为17.43±0.66 m V,透射电子显微镜下PR-LNP呈形态均一、结构完整的球形。PR-LNP的PTX包封率为96.36±0.34%,PTX载药量为3.35±0.18%;ROR1 si RNA包封率为86.07±1.23%,ROR1 si RNA载药量为0.44±0.03%。PR-LNP在10%血清中24 h内稳定性良好,体外释放结果显示PR-LNP在p H 7.4 PBS中48 h内累积释放率达67%,缓慢释放。 ***-LNP的体外评价研究 采用4T1细胞模型,研究PR-LNP对4T1细胞的摄取、毒性及转移的影响,考察ROR1 si RNA干扰ROR1基因表达情况,评价PR-LNP的体外入胞能力、抑制肿瘤细胞生长和转移能力以及ROR1 si RNA的沉默效果。将荧光标记香豆素6包载于LNP中,摄取实验结果显示4 h内香豆素6荧光强度逐渐增加,4 h后载体LNP促使药物从溶酶体逃逸,使其进入细胞质发挥作用。与流式细胞仪定量测定结果一致。蛋白质印迹实验结果显示80μM ROR1 si RNA在体外可有效阻断ROR1基因的表达。细胞毒性结果显示PR-LNP可显著抑制4T1细胞增殖,其IC50为1.39μg/m L,且R-LNP及空白载体安全性良好。细胞划痕、迁移及侵袭实验结果显示沉默ROR1基因表达可显著抑制4T1细胞体外转移,ROR1 si RNA与PTX协同作用,进一步增强抑制转移能力。 ***-LNP的体内评价研究 以4T1荷瘤小鼠为模型,评价PR-LNP在体内的递药特性、代谢情况、抑制肿瘤的增殖和转移能力以及制剂初步生物安全性。采用荧光标记DIR LNP进行组织分布定性、半定量分析及测定PTX在组织中含量,结果显示PR-LNP显著增加24 h内PTX在肿瘤和肺部的药物累积（P<0.05）。在药物动力学中,PR-LNP的PTX半衰期较游离PTX提高1.23倍,血浆清除率降低12.68%,有效延长PTX血液循环时间。药效学评价结果显示PR-LNP组肿瘤抑制率为49.24%,较游离PTX组提高约2.77倍,肿瘤重量较游离PTX组有显著性差异（P<0.001）。对肿瘤TUNEL和CD8+T细胞免疫荧光染色切片,结果表明PR-LNP可诱导大量肿瘤细胞凋亡并增加CD8+T细胞浸润,促进免疫应答。通过记录肺部结节个数及观察肺部H&E染色切片,结果表明PR-LNP可有效抑制肺转移灶的形成。PR-LNP初步生物安全性考察结果显示荷瘤小鼠给药期间体重

关键词： ZIF-8   BH3肽   抗肿瘤药物载体   pH响应   MDA-MB-231细胞  

摘要： 一直以来,人类与癌症抗争的脚步就从未停止过。当前被广泛应用于临床的化疗、放疗和手术等传统方法往往有易复发、毒副作用较高、价格高昂等局限性,因而用于癌症治疗的新兴智能纳米药物装载体系领域应声而出。经过良好设计的智能纳米载药体系不仅具有更高效的肿瘤杀伤能力和更好的生物相容性,还往往具有靶向性和多种功能。 以Bcl-2家族蛋白为作用原理构建的BH3肽具有良好的抗肿瘤能力,但同时具有肽类药物共有的不稳定、难被细胞摄取、易被蛋白酶降解、对外界环境条件敏感性高等缺点,难以直接给药发挥肿瘤细胞杀伤能力。金纳米粒子(Au NPs)是一种生物安全性较好的金属纳米材料,可以以硫金配位键与含有巯基的BH3肽紧密结合,从而将溶液中游离存在的BH3肽捕捉装载,然而该连接产物不具有长期低温储存的稳定性。类沸石咪唑酯骨架-8(ZIF-8)是一种生物安全性被广泛认可的类沸石咪唑酯骨架材料,表面的多孔结构常赋予其良好的药物装载效率。几乎所有的常见实体肿瘤细胞都具有酸性的细胞环境,ZIF-8的pH敏感性恰好可以在中性的正常组织细胞区域保护药物,在酸性的肿瘤细胞内释放药物从而实现药物的可控释放。 以三阴性乳腺癌这一易转移、难治疗的乳腺癌亚型为研究对象,根据对类沸石咪唑酯骨架材料和金纳米粒子的研究以及对BH3肽自身局限性的了解,设计了基于ZIF-8的BH3肽载药体系构建及其抗三阴性乳腺癌研究这一课题。 论文取得的主要结果为: (1)成功制备了掺入金纳米粒子和BH3连接产物Au-BH3的ZIF-8材料Au-BH3@ZIF-8并对其基础表征进行检测。用粒径和电位检测、透射电镜检测、元素分析、红外光谱分析等实验对Au-BH3@ZIF-8进行表征,证明成功合成了粒径为152 nm,电位为-17.1m V,性质稳定均一的Au-BH3@ZIF-8纳米载药系统; (2)证明了Au-BH3@ZIF-8优秀的低温储存稳定性、良好的药物装载能力以及pH响应性药物释放能力。用稳定性评价实验证明了Au-BH3@ZIF-8在八天的检测时间内保持基础表征相对稳定,可以进一步保护BH3肽药物;用BCA定量法测得Au-BH3@ZIF-8的包封率和载药率分别为29.52%和4.92%;在不同的pH条件下测试Au-BH3@ZIF-8的释药情况,测定时间内pH=5.5条件下最大释药率为74.06%,远大于测得pH=7.4条件下的最大释药率30.93%,也就是说Au-BH3@ZIF-8在实验模拟的近中性条件下结构保持稳定,在pH偏酸性的条件下结构崩解,表现出pH响应性的BH3肽可控释放。 (3)验证了Au-BH3@ZIF-8的体外抗三阴性乳腺癌能力并初步探究了其机理。用细胞摄取实验验证Au-BH3@ZIF-8可被三阴性乳腺癌细胞在短时间内成功摄取;用细胞毒性实验、台盼蓝染色实验、Hoechst染色实验、流式细胞术实验验证了Au-BH3@ZIF-8具有良好的促三阴性乳腺癌细胞凋亡能力;用集落实验、Transwell实验、细胞划痕实验证明了Au-BH3@ZIF-8能够显著抑制三阴性乳腺癌细胞生长和迁移;用线粒体跨膜电位检测、钙离子内流浓度检测、Caspase-3/-8/-9酶活性检测对Au-BH3@ZIF-8抗三阴性乳腺癌机理进行初步探究。 综上,论文利用具有pH响应性的ZIF-8和生物安全性良好的金纳米粒子及抗肿瘤药物BH3肽共同合成了Au-BH3@ZIF-8载药系统,可以利用高渗透长滞留效应(EPR效应)滞留在肿瘤部位,在酸性的三阴性乳腺癌细胞环境进行可控释药,增加药物利用率,减少对其他正常组织细胞的伤害。

关键词： 蛋白降解工具   三阴性乳腺癌   靶向蛋白降解   JQ1  

摘要： 近年来乳腺癌的新发病例数量逐年升高,已经超过了肺癌成为最常见的癌症类型。其中,三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)作为乳腺癌(Breast cancer,BC)最恶性的亚型,其特点在于不表达雌激素受体(Estrogen receptor,ER)、孕激素受体(Progesterone receptor,PR)及人表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2),这一特性使得常规的激素治疗和HER2靶向治疗策略在此类乳腺癌中无效。此外,由于TNBC复杂的发病机制,如基因突变、基因组不稳定性及特殊的肿瘤微环境也进一步增加了治疗的难度。当前TNBC的主要治疗方法包括手术、放疗、化疗和若干新兴药物。在这些治疗方法中,化疗是治疗TNBC的最优选择。然而化疗后的复发率仍然很高,因此迫切需要新的治疗三阴性乳腺癌的方法。 靶向蛋白质降解(Targeted protein degradation,TPD)技术是近年迅速发展起来的一种新型治疗策略,通过设计特定的小分子药物来特异性地引导与病理相关的蛋白进入细胞内的蛋白质降解路径,从而达到治理疾病的效果。其中,基于嵌合体蛋白水解(Proteolysis-targeting chimera,PROTAC)的方法是目前研究最为广泛和深入的技术之一。目前已有二十多种药物进入临床试验,展现了其在癌症治疗中的巨大潜力。然而,对于TNBC的治疗,E3连接酶及其配体的选择匮乏限制了靶向蛋白降解技术的应用。近年来随着新的氟试剂和氟化手段的持续开发,含氟药物的发展速度得到了快速推进,促进了许多新型药物的诞生。在众多新型含氟药物中相当一部分药物具有靶蛋白降解的能力。基于此,我们设计了一种新型的多氟小分子,旨在将其作为蛋白降解工具应用于TNBC治疗中。将蛋白降解工具应用TNBC中,还需挑选合适的POI(Protein of interest)配体。研究显示,降低溴结构域蛋白4(Bromodomain-containing protein 4,BRD4)和鼠双微体蛋白2(Mouse double minute 2,MDM2)的表达对抑制TNBC细胞增殖具有明显效果,因此本文合成了JQ1和Nutlin-1作为针对这些蛋白的配体。这些配体不仅能与目标蛋白发生竞争性结合,还能促进肿瘤细胞的分化和生长停滞,甚至在特定条件下诱导细胞死亡,为其抗肿瘤活性提供了坚实的实验基础。基于以上背景,本课题聚焦于一种新型的多氟小分子作为蛋白降解工具,并将其与JQ1结合,开发了一种新的小分子药物用于治疗三阴性乳腺癌。 在本课题中,我们合成了一种新的多氟代蛋白降解剂,并成功验证了其能够有效抑制三阴性乳腺癌细胞的体外实验结果。通过深入分析JQ1和多氟化小分子的结构特征,我们确定了这种新型小分子药物的具体结构,并制定了详细的合成路线。我们按照不同的合成策略进行实验,并根据每个步骤的产率进行及时的方案调整,成功筛选出了一种高效的合成方法,从而获得了期望的目标产物。目标产物经高效液相色谱(HPLC)进一步纯化,并通过核磁共振(NMR)图谱验证了目标产物的结构。最终,我们通过对TNBC细胞进行抗增殖实验和对BRD4蛋白进行Western Blot(WB)实验来验证该药物的效果,这些实验结果不仅展示了新药物在抑制细胞增殖方面的有效性,同时也为三阴性乳腺癌的治疗提供了思路。

关键词： 金属配合物   磺胺二甲嘧啶   抗三阴性乳腺癌   抗炎   铜死亡  

摘要： 目的:合成并表征以邻菲罗啉、磺胺二甲嘧啶或芳香-芳香偶联的二磺胺二甲嘧啶为配体的新型金属(II)基配合物HA-Cu、HA-Co和HA-Ni,通过实验测定HA-Cu、HA-Co和HA-Ni抗肿瘤活性,其中着重研究对三阴性乳腺癌的治疗效果,为治疗三阴性乳腺癌药物的开发提供思路。 方法:第一章:使用磺胺二甲嘧啶、邻菲罗啉与提供Cu(Ⅱ)离子的六水合高氯酸铜盐进行配位反应,合成了Cu(Ⅱ)配合物HA-Cu;以磺胺二甲嘧啶、邻菲罗啉和四水合乙酸钴为原料,在乙酸钴的催化下,原位反应合成了含有芳烃-芳烃偶联的二磺胺二甲嘧啶配体的Co(Ⅱ)配合物HA-Co。使用磺胺二甲嘧啶、邻菲罗啉和六水合氯化镍为原料,在氯化镍的催化下,原位反应合成了含有芳烃-芳烃偶联的二磺胺二甲嘧啶配体的Ni(Ⅱ)配合物HA-Ni。采用红外光谱、元素分析、电感应耦合等离子体质谱、液相色谱质谱联用和X-射线衍射对合成的配合物进行表征。第二章:通过细胞毒性实验、细胞摄取实验、分子对接实验、HUVEC管状结构形成实验、细胞凋亡实验、活性氧实验、线粒体膜电位实验、蛋白免疫印迹实验、MDA-MB-231细胞异种移植构建裸鼠肿瘤模型实验、HE染色实验和免疫组化分析实验,探究HA-Cu、HA-Co和HA-Ni的抗肿瘤活性。 结果:第一章:成功合成了HA-Cu、HA-Co和HA-Ni,并获得了它们的单晶结构。第二章:证明了HA-Cu、HA-Co和HA-Ni具有广谱的细胞毒性,也能被MDA-MB-231细胞所摄取,从而抑制细胞的生长。HACu能与VEGF蛋白的活性位点结合,从而抑制VEGF的活性。HA-Cu、HA-Co和HA-Ni不仅能有效抑制HUVECs形成管腔结构,从而阻止内皮细胞生成自身的血管;还能显著上调MDA-MB-231细胞中活性氧的水平,并强烈诱导MDA-MB-231细胞线粒体膜电位的崩溃,导致MDA-MB-231细胞显著凋亡。HA-Cu通过下调MDA-MB-231细胞中VEGF/VEGFR2信号转导途径中的ERK1/2、AKT、FAK、VEGFR2以及磷酸化蛋白p-AKT、p-FAK和p-VEGFR2的表达,从而抑制MDA-MB-231细胞的生存、增殖、转移和肿瘤血管生成;并通过减少炎症因子NF-κB、p-NF-κB、TNF-α和IL-1β的表达来抵抗炎症,从而抑制肿瘤生存和发展;其阻断Caspase-9信号通路可能促进I型干扰素的产生,增强肿瘤特异性的T细胞和放疗介导的抗肿瘤免疫;通过上调促凋亡蛋白Bax的表达和下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来诱导肿瘤细胞凋亡;通过下调FDX1并上调HSP70蛋白的表达,以铜死亡的方式协同增强肿瘤细胞死亡。在接种了MDA-MB-231细胞的裸鼠异种移植模型中,HA-Cu通过抑制肿瘤组织来源的血管内皮细胞来抑制肿瘤血管生成,并调节上述炎症因子、凋亡相关因子和铜死亡因子来增强抗肿瘤效果,实验数据表明其治疗效果优越于DDP。 结论:HA-Cu、HA-Co和HA-Ni可有效抑制MDA-MB-231细胞的生长。HA-Cu通过抗血管生成、抗炎、细胞凋亡和铜死亡的协同效应在体内和体外都有效地抑制肿瘤生长。总之,本研究为TNBC的治疗提供了潜在的药物候选。

关键词： 三阴性乳腺癌   细胞侵袭   细胞转移   Mayamycin  

摘要： 目的和意义：　　确定Mayamycin对三阴性乳腺癌（TNBC）的抑制作用，检测Mayamycin发挥抗TNBC活性的功能，揭示Mayamycin抗TNBC的作用机制，验证Mayamycin体内抗TNBC效果。　　方法：　　采用CCK8试剂检测Mayamycin在TNBC细胞（MDA-MB-231和BT-549）和正常乳腺上皮细胞（MCF-10A）的细胞毒活性并计算IC50。使用流式细胞术和EdU试剂检测Mayamycin对TNBC细胞周期、增殖和凋亡的影响。利用Transwell实验确定Mayamycin对TNBC细胞侵袭、转移等功能的影响。通过构建异种移植瘤模型验证Mayamycin体内抗TNBC效果。结合基因测序和TNBC的scRNA-seq数据库，分析TNBC中特异激活、明显异常表达且与疾病预后密切相关的下游通路基因。运用靶点预测工具Autodockvina预测Mayamycin的结合位点，通过细胞热位移实验验证预测的结合位点。采用siRNA和Westernblot实验证实Mayamycin抗TNBC的作用机制。　　结果：　　1.与临床常用化疗药物顺铂相比，Mayamycin对TNBC细胞具有更好的选择性毒性和更强的抑制活性。研究发现，Mayamycin对正常乳腺上皮细胞MCF-10A的IC50值为5.76μM，而对TNBC细胞的IC50值分别为0.88和1.43μM，该差异具有统计学意义，表明与正常乳腺上皮细胞相比，Mayamycin对TNBC细胞具有较好的选择性细胞毒活性。此外，临床常用化疗药物顺铂对TNBC细胞的细胞毒活性和选择性均较差。上述结果表明与顺铂相比，Mayamycin对TNBC细胞具有更好的选择性毒性和更强的抑制活性。　　***能够导致TNBC细胞周期S期阻滞和增殖抑制。用Mayamycin分别处理TNBC细胞24h后，流式细胞术检测发现随着Mayamycin浓度增加，细胞周期的S期占比增加，EdU染色阳性的细胞数量明显减少，证实了Mayamycin可导致TNBC细胞周期S期阻滞和增殖抑制。　　***能够诱导TNBC细胞的凋亡。采用流式细胞术检测细胞凋亡的结果表明，随Mayamycin浓度增加或作用时间延长，TNBC细胞的凋亡率逐渐增加。Westernblot实验结果发现Bax/Bcl-2比值上升，证实了Mayamycin可以诱导TNBC细胞Bax/Bcl-2介导的凋亡。　　***能够有效抑制TNBC细胞的侵袭和转移。通过Transwell转移实验和基质胶侵袭实验，发现Mayamycin处理24h后，MDA-MB-231和BT-549细胞的侵袭和转移能力明显随着浓度的增加而降低。针对影响侵袭和转移关键蛋白的Westernblot实验结果证实了Mayamycin可有效抑制TNBC细胞的侵袭和转移。　　***具有体内抗三阴性乳腺癌功能。利用荷瘤小鼠提供体内环境检测Mayamycin的体内抗TNBC效果。结果表明，Mayamycin在剂量为2mg/kg和4mg/kg治疗荷瘤小鼠时可有效抑制小鼠皮下TNBC肿瘤的生长，联合顺铂治疗，肿瘤生长抑制效果优于单独使用Mayamycin或顺铂。证实了Mayamycin具有体内抗三阴性乳腺癌功能。　　6.通过检测Mayamycin处理前后MDA-MB-231的转录组学测序联合TNBC的scRNA-seq数据进行生物信息学分析，发现Mayamycin可以下调TNBC细胞中疾病预后相关基因STMN1的表达。　　7.下调STMN1的表达抑制TNBC细胞的侵袭和转移。小干扰RNA抑制TNBC细胞的STMN1基因表达后检测TNBC细胞的转移侵袭水平情况，证实了下调STMN1可抑制TNBC细胞的侵袭和转移。　　***可结合CDK7。Autodockvina软件对人类蛋白分子预测结构与Mayamycin分子进行批量模拟对接，发现Mayamycin与CDK7存在结合位点，具有较低的结合能。细胞热位移实验结果表明Mayamycin可提高CDK7的稳定性，证明Mayamycin可与CDK7结合，形成配体-蛋白质复合物。　　结论：　　本研究发现，Mayamycin对TNBC具有选择性的细胞毒活性。Mayamycin具有抑制TNBC细胞周期进程、增殖、侵袭转移和促进TNBC细胞凋亡的功能。Mayamycin可直接结合CDK7蛋白，以及通过下调STMN1表达抑制TNBC细胞侵袭迁移。本研究首次证明Mayamycin具有体内抑制TNBC肿瘤生长效果。

关键词： 飞燕草素   乳酸化修饰   糖酵解   PI3K/AKT/mTOR   自噬  

摘要： 研究背景与目的: 近年来,三阴性乳腺癌因其具有高复发性,高转移性,受到科研学者和临床医生的关注。糖酵解作为能量代谢的标志之一,在肿瘤生长繁殖中有着重要作用。乳酸化修饰作为新近发现的一种新型蛋白质翻译后修饰,在肿瘤调控方面仍处于空白。来自草本植物和蔬果类的花青素在治疗和预防癌症方面具有潜在的有益作用。课题组前期研究证实,花青素中的飞燕草素可以激活自噬,抑制三阴性乳腺癌细胞增殖。然而,目前并未有研究将乳酸化修饰和糖酵解途径、自噬通路结合起来。本研究拟从体内体外两方面,探讨飞燕草素通过糖酵解途径调控乳酸化修饰,抑制PI3K/AKT/m TOR轴,诱发自噬的机制研究。以期为飞燕草素作为植物化学物质抗乳腺癌的预防和治疗提供理论基础和实验依据。 材料与方法: 1.选择不同浓度的飞燕草素处理三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231、BT549)24h造模,CCK-8法检测细胞活力,筛选浓度进行后续实验。集落形成实验检测飞燕草素对三阴性乳腺癌细胞的侵袭能力;划痕实验检测飞燕草素对三阴性乳腺癌细胞的迁移能力。采用乳酸试剂盒、葡萄糖试剂盒、ATP试剂盒和丙酮酸试剂盒检测飞燕草素对三阴性乳腺癌细胞内的乳酸含量、葡萄糖摄取量、ATP生成量和丙酮酸含量的影响。 2.将三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)分为对照组和给药组(Delphinidin处理24h),分别进行蛋白提取和酶切,用赖氨酸乳酸化泛抗体亲和富集,检测蛋白乳酸化的修饰水平变化,再用液相色谱串联质谱(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MC)检测富集到的乳酸化肽段,进行蛋白定量分析,利用KEGG、Protein domain、COG/KOG和STRING数据库对显著差异蛋白进行生物学信息分析。 3.用2-脱氧-D-葡萄糖(2-Deoxy-D-glucose,2-DG)和Rotenone提前处理三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231、BT549)24h,然后用飞燕草素再处理24h,随机分为空白组,2-DG组,Rotenone组,2-DG+飞燕草素组,Rotenone+飞燕草素组。利用RT-q PCR和Western blotting实验观察糖酵解途径中相关基因和蛋白的表达,观察PI3K/AKT/m TOR通路和自噬蛋白LCⅡ/Ⅰ蛋白的表达,并用透射电镜观察细胞内自噬小体的数目。另外,采用乳酸试剂盒、葡萄糖试剂盒、ATP试剂盒和丙酮酸试剂盒检测三阴性乳腺癌细胞内的乳酸含量、葡萄糖摄取量、ATP生成量和丙酮酸含量。同时,选用4周龄的BALB/c-nu裸小鼠作为实验对象,选择MDA-MB-231细胞建立裸鼠皮下异种移植瘤模型。分为control组、飞燕草素组、2-DG组和飞燕草素+2-DG组。每周检测裸鼠重量和瘤体体积,利用免疫组织化学染色技术检测肿瘤组织中PKM2、PFKFB3和Pan kla蛋白的表达情况。 结果: 1.飞燕草素对三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231、BT549)存在抑制作用,且细胞存活率随飞燕草素浓度的增加而降低。用不同浓度的飞燕草素处理细胞24h后,进行细胞划痕实验和集落形成实验,发现飞燕草素可以抑制MDA-MB-231细胞和BT549细胞的迁移和增殖能力,呈剂量依赖性。通过酶标法发现飞燕草素可以降低三阴性乳腺癌(MDA-MB-231、BT549)中与糖酵解有关的乳酸含量、葡萄糖摄取量、ATP生成量和丙酮酸含量。 2.通过motif分析,我们在经过飞燕草素处理后的三阴性乳腺癌细胞中找到了发生赖氨酸乳酸化修饰的肽段序列特征。根据1.5倍差异表达量作为明显差异上下调的变量阈值,筛选得到255个乳酸化修饰位点数。其中,上调的乳酸化修饰位点为160个,下调的乳酸化修饰位点为95个。同时,共有128个乳酸化水平上调的蛋白与88个乳酸化水平下调的蛋白。从COG/KOG分类结果可知,发生显著上调的蛋白质主要在蛋白质转录、功能预测、RNA加工和修饰、染色质结构等方面,显著下调的蛋白质主要在蛋白质翻译、核糖体结构和生物发生、信号转导机制等方面。根据亚细胞定位,发现发生赖氨酸乳酸化修饰的在细胞质中占65.2%,最低的在细胞质核内占3.43%。基于GO富集分析,发现蛋白P13051、P51608、Q9Y3T9等分别在生物过程,分子功能,细胞成分中起着重要作用。从蛋白结构域结果来看,发生赖氨酸乳酸化修饰的蛋白位点主要集中于锌指结构。另外,将筛选出来的前50个蛋白,进行蛋白互作网络分析,发现HDAC2、CHD4、NOCL2等蛋白均与糖酵解途径相关。我们推测,乳酸化修饰和糖酵解途径之间存在着联系,开展了第三部分相关实验。 3.2-DG和Rotenone呈剂量依赖性抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖。对照组和2-DG组相比,2-DG降低了细胞

关键词： 树突状细胞   肿瘤复发   水凝胶   免疫治疗  

摘要： 三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer,TNBC）作为一种恶性程度极高的乳腺癌亚型,临床预后较差。目前,手术辅以放/化疗仍是临床治疗TNBC的主要方式,但因其高度异质性及高侵袭性常导致术后治疗效果不理想。不可避免的复发和转移已成为大多数TNBC患者死亡的主要原因。近年来,免疫治疗为临床上恶性肿瘤及转移瘤的治疗提供了有效的策略,并逐步改变了TNBC的治疗模式。 树突状细胞（Dendritic cells,DCs）作为机体功能最强的专职抗原提呈细胞,在启动特异性抗肿瘤免疫中发挥重要作用。目前基于DCs的免疫疗法主要通过制备DCs疫苗或DCs联合其他肿瘤治疗方式如放/化疗、免疫靶点抑制剂疗法等,以增强机体的抗肿瘤免疫效应。但DCs作为抗肿瘤免疫治疗的主要免疫细胞,其在免疫治疗过程中仍受到一定限制。一方面,术后肿瘤部位已有抗肿瘤的特异性效应T细胞的存在,但未成熟DCs浸润居多。未成熟DCs不仅无法有效激活效应T细胞,还可导致免疫耐受的产生,能否有效逆转DCs的功能障碍成为肿瘤免疫治疗的关键。另一方面,DCs凋亡、DCs分化受抑制以及趋化因子分泌减少等诸多因素,显著地抑制了肿瘤部位DCs的浸润数量。因此如何安全有效地募集内源性DCs也成为治疗的另一关键方面。 基于以上两个方面,改善TME中未成熟DCs的免疫抑制状态,促进DCs成熟,并有效增加DCs在肿瘤部位的浸润,是提高疫苗治疗效果、促进机体抗肿瘤免疫的关键所在。水凝胶作为一种新兴材料,具有良好的生物相容性,能够在局部区域更好的实现药物释放,已广泛应用于药物递送领域。因此本研究以水凝胶作为递送载体,开发基于调控DCs募集与活化的可注射免疫治疗性水凝胶。 本研究包括以下三部分: 1、免疫治疗性水凝胶的制备及表征:首先构建负载XCL-1、ABs@Dz的水凝胶,使用XCL-1趋化因子解决DCs浸润少的问题;同时利用疏水作用将含肿瘤抗原的凋亡小体（Apoptotic bodies,ABs）连接上修饰有胆固醇基团的DNAzyme,特异性沉默DCs成熟抑制基因STAT3,协同促进DCs的成熟与活化,将上述两种材料共同负载于蚕丝蛋白水凝胶（Silk protein hydrogel,SPH）中。经荧光显微镜、流式细胞术、TEM（Transmission electron microscope）、荧光分光光度计等实验验证ABs的提取及ABs@Dz的成功合成;通过释放性实验验证SPH具有优良的缓释能力;通过催化活性实验验证DNAzyme切割靶基因的能力;体外CCK-8与活死染实验,体内伤口愈合实验及SPH降解性检测验证了该SPH具有良好的生物安全性且注射后不发生显著降解。 2、免疫治疗性水凝胶的体外抗肿瘤实验研究:通过流式细胞术、共聚焦检测ABs@Dz的细胞摄取能力;Transwell实验验证XCL-1对DCs的募集作用,流式细胞术检测DCs表面MHC-II类分子与CD86的表达水平、ELISA检测IL-12 p70、TNF-α的分泌水平,验证ABs@Dz可有效促进DCs的成熟与活化;通过流式细胞术检测CD3、CD8的表达水平验证DCs对T细胞的激活能力;CCK-8实验验证活化后的CD8+T细胞对4T1的特异性杀伤作用。 3、免疫治疗性水凝胶的体内抗肿瘤实验研究:构建4T1荷瘤小鼠肿瘤切除后复发模型,通过小鼠体重、肿瘤体积大小证实该免疫治疗性水凝胶（ABs@SDz+XCL-1@SPH）可有效抑制肿瘤生长,肿瘤组织H&E、TUNEL、Ki67免疫组织化学染色及心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的H&E验证该免疫治疗性水凝胶可促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖;通过免疫组化验证DNAzyme对STAT3基因的沉默能力;流式细胞术分析验证了该免疫治疗性水凝胶可促进肿瘤部位DCs的募集及活化,促进CD8+T细胞的有效浸润,激活局部免疫应答;ELISA检测血清中IL-6、IL-12 p70的分泌,验证该免疫治疗性水凝胶具有激活全身免疫的作用。 以上实验结果显示,该免疫治疗性水凝胶使用XCL-1趋化因子联合ABs与STAT3靶点的DNAzyme,协同改善TME中DCs免疫抑制状态,促进DCs的成熟,并提高T细胞的激活水平。这种基于DCs的双重调控策略有效促进了机体的抗肿瘤免疫效应,为抑制TNBC复发提供了新的思路与方法。