关键词： 铜基配合物   抑制肿瘤血管生成   抗肿瘤   三阴性乳腺癌  

摘要： 目的:通过检测四个铜基配合物对MDA-MB-231细胞的体外抑制效果,初步探讨其诱导细胞凋亡及抗肿瘤血管生成作用的机制,为临床治疗三阴性乳腺癌药物候选提供理论参考。方法:第一章:1、制备以L-蛋氨醇衍生的席夫碱为配体的四核铜基配合物的纳米粒子,用ICP-MS技术分析铜基配合物的细胞吸收;2、通过MTT法验证这两个铜基配合物对MDA-MB-231细胞和HUVEC细胞的抑制作用;3、流式细胞术,管形成实验,蛋白分子免疫印迹重点研究这两个铜基配合物的体外诱导MDA-MB-231细胞凋亡作用及调控肿瘤血管生成相关通路因子表达方面的作用。第二章:1、制备另外两个铜基配合物的纳米粒子;2、通过MTT法验证这两个铜基配合物对MDA-MB-231细胞和HUVEC细胞生存能力的抑制作用;3、用流式细胞术分析了这两个铜基配合物的体外诱导MDA-MB-231细胞和HUVECs凋亡作用。结果:第一章:1、透射电镜可以看到两个化合物的纳米粒子呈球形,分散性良好,N（TNCu-1）的直径是（88.33±16.07）nm,N（TNCu-2）的纳米粒子直径是（308.00±14.43）nm。ICP-MS结果可表明两个化合物均可被MDA-MB-231细胞和HUVEC细胞吸收。2、MTT试验结果表明,在MDA-MB-231细胞中,N（TNCu-2）展示出与顺铂相当的毒性,N（TNCu-1）毒性略弱于N（TNCu-2）。在HUVEC细胞中,N（TNCu-1）与N（TNCu-2）毒性均弱于顺铂。3、凋亡实验和MMP实验证实,两个化合物在MDA-MB-231细胞和HUVEC细胞中,均降低MMP诱导凋亡形成;N（TNCu-1）和N（TNCu-2）在MDA-MB-231细胞中下调ROS水平,而在HUVEC细胞中上调ROS水平;N（TNCu-1）诱导细胞凋亡的能力比N（TNCu-2）的能力弱,但它们均使细胞呈现浓度依赖性的凋亡,且对HUVECs的作用小于MDA-MB-231细胞。HUVEC细胞的管形成实验,与空白对照组以及阳性对照组相比,两个铜基配合物均展示较强的抑制作用;AKT、Erk1/2和FAK蛋白及其磷酸化蛋白p-AKT、p-Erk1/2和p-FAK是位于VEGFR2通路下游的关键信号分子,蛋白分子免疫印迹显示,两个铜基配合物均对VEGF/VEGFR2信号通路中的这些关键信号因子具有调节作用。第二章:1、透射电镜可以看到两个化合物的纳米粒子分散性良好,N（Cu-3）形态是更为清晰的球形。N（Cu-3）的直径是（56.14±6.28）nm,N（Cu-4）的平均大小为（74.98±12.50）nm。2、MTT试验结果表明,在MDA-MB-231细胞和HUVECs中,N（Cu-3）均展示出比顺铂、N（Cu-4）更强的毒性,N（Cu-4）毒性则均弱于顺铂。3、凋亡实验中,N（Cu-3）对MDA-MB-231细胞和HUVECs均有影响,同浓度下对MDA-MB-231细胞作用更强,对HUVECs作用则呈现明显的剂量依赖。N（Cu-4）对MDA-MB-231细胞的作用呈现明显的剂量依赖而对HUVECs则影响甚微。结论:第一章:N（TNCu-1）和N（TNCu-2）的纳米粒子均对MDA-MB-231细胞有一定的抑制作用,其通过破坏细胞内活性氧水平、降低线粒体膜电位水平以及激活VEGF/VEGFR2信号通路中的信号分子显著地诱导MDA-MB-231细胞凋亡以及抑制血管生成。这些抑制作用与N（TNCu-1）和N（TNCu-2）浓度和时间相关,但作用效果因其结构差异而呈现不同水平。第二章:N（Cu-3）和N（Cu-4）纳米粒子对MDA-MB-231细胞有不同程度的抑制作用,同时凋亡实验显示两者均可使细胞凋亡且都对MDA-MB-231细胞有更高选择性。

关键词： 二代测序   高通量筛选   三阴性乳腺癌   余甘子   抗肿瘤  

摘要： 目的:乳腺癌治疗中的一个世界性难题是三阴性乳腺癌的临床治疗目前没有特效药物。本研究以MDA-MB-231细胞为模型,应用基于二代测序的高通量筛选技术发现中药余甘子具有抗三阴性乳腺癌作用,并进一步研究余甘子抗三阴性乳腺癌机理。方法:1.以二代测序为基础的高通量技术筛选出余甘子,进行差异表达基因KEGG富集分析。2.设置实验组和对照组,在体外培养人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞,采用四氮唑蓝(MTT)比色法检测经余甘子(320、160、80、40、20、10、5μg/m L)处理MDA-MB-231细胞24 h后的细胞活性并计算IC50;3.流式细胞术分析经余甘子(20μg/m L)处理MDA-MB-231细胞24 h后的细胞的周期变化;4.细胞划痕实验判断余甘子(20μg/m L)处理后MDA-MB-231细胞迁移能力;5.荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测经余甘子(20μg/m L)处理MDA-MB-231细胞24 h后的Cyclin G2和细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子p21的表达水平;***数据库分析三阴性乳腺癌患者Cyclin G2、p21的表达与预后情况。结果:与对照组比较,余甘子(320、160、80、40、20、10、5μg/m L)在体外对MDA-MB-231细胞活性具有明显的抑制作用(P<0.05),且这种抑制作用呈浓度依赖效应;余甘子(20μg/m L)可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞体外增殖,细胞周期阻滞在G1/S期;余甘子(20μg/m L)能显著上调MDA-MB-231细胞中Cyclin G2、p21 m RNA的表达水平(P<0.05);余甘子(20μg/m L)细胞划痕间伤口愈合距离百分比明显高于对照组,而抑制后细胞划痕间伤口愈合距离百分比明显低于对照组;通过KMplot分析临床数据提示高表达Cyclin G2、p21水平具有潜在增加三阴性乳腺癌患者良好预后的作用。结论:应用基于二代测序的高通量筛选技术发现中药余甘子(20μg/m L)具有抗三阴性乳腺癌作用,其机制可能与上调Cyclin G2、p21 m RNA水平有关。

关键词： 氧化苦参碱   贝伐珠单抗   三阴性乳腺癌   上皮细胞-间充质转化   Wnt/β-Catenin信号通路  

摘要： 目的探讨氧化苦参碱(Oxymatrine,OM)增强贝伐珠单抗(Bevacizumab,BV)抗三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)的作用及其相关作用机制。方法通过MTT实验分析OM在不同浓度(0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 m M)对TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468增殖的影响;利用流式细胞术检测OM对TNBC细胞周期和凋亡的影响;通过transwell invasion和划痕损伤修复实验观察OM、BV以及OM与BV联用对MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞侵袭与迁移能力的影响;通过小管生成实验观察OM是否能增强BV的抗血管生成能力;采用ALDEFLOUR实验分析OM对肿瘤干细胞样细胞比例的影响;利用Western blot、免疫荧光技术检测相关蛋白的变化,对OM的抗肿瘤机制进行研究;建立荷人乳腺癌(MDA-MB-231、MDA-MB-468)裸鼠模型,进一步验证OM是否可以增强BV的抗肿瘤作用。结果OM可有效抑制TNBC细胞增殖,且呈浓度依赖性。OM将MDA-MB-231细胞阻滞在S期,MDA-MB-468细胞阻滞在G0/G1期,并有效诱导两株细胞的凋亡。OM明显抑制BV诱导的细胞侵袭与迁移,并降低BV用药引起的肿瘤干细胞样细胞比例的增大。Western blot和细胞免疫荧光实验表明OM可以明显抑制BV用药诱导的TNBC细胞中β-Catenin的核转移,并减少β-Catenin蛋白的总表达量,说明OM可以有效抑制BV诱导的Wnt/β-Catenin通路激活。从分子水平来看,相关目的蛋白的变化趋势表明OM可以逆转BV所引起的上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transformation,EMT)。裸鼠移植瘤实验表明OM可以有效抑制TNBC肿瘤的生长,并且可以增强BV抗TNBC的活性。小管生成实验结果以及VEGFA和CD31表达量的减少表明了无论是体内还是体外实验,OM均表现出较强的抑制肿瘤血管生成的作用,联合用药时可以增强BV的抗肿瘤血管生成作用。Ki-67表达量的减少表明了两者联用有效抑制了肿瘤的生长。从肿瘤组织层面来看,OM可以减少细胞核中β-Catenin的累积,与细胞水平方面结果一致。细胞微球实验表明OM可以抑制BV引起的增强肿瘤细胞自我更新的能力。结论OM体现出了良好的抗TNBC及抗血管生成活性,并且可以通过Wnt/β-Catenin信号通路来增强BV的抗肿瘤作用。

关键词： AP-1   三阴性乳腺癌   藜芦胺   结构修饰  

摘要： 三阴性乳腺癌（TNBC）是一种严重威胁女性健康的疾病,目前治疗手段以化疗为主,毒副作用大且患者易产生耐药性,临床迫切需要开发有效的靶向疗法。机制研究表明,激活转录因子AP-1在三阴性乳腺癌中高表达,开发以AP-1为靶点的抑制剂具有重要意义。课题组的前期研究工作中,发现藜芦胺及其类似物可特异性识别并结合AP-1靶基因序列,从而抑制下游多种与肿瘤形成、侵袭和转移相关的蛋白表达,发挥抗肿瘤作用。本课题首先以藜芦胺为先导化合物对其展开结构修饰,通过分析先导化合物藜芦胺与AP-1靶向DNA序列的结合特点,从四个方面对藜芦胺衍生物进行结构设计:（1）将E环氮原子连接不同长度和不同类型的侧链;（2）将3位羟基氧化成羰基同时伴随双键移位,羰基通过亲核加成反应构建成具有氢键给体或受体的基团;（3）利用乙酰化条件保护3位羟基,氧化23位羟基构建关键中间体,进行氟取代等衍生物的合成;（4）将双键转化为环氧桥或邻位双羟基。共设计合成50个藜芦胺衍生物,所有中间体及目标化合物均通过HR-MS,1H-NMR和13C-NMR确证结构。其次,本课题对合成得到的藜芦胺衍生物进行了初步机制验证和体外三阴性乳腺癌细胞增殖抑制活性测试。以HEK293为模型细胞,构建了HEK293/AP-1荧光素酶报告基因系统,分别在30μM和10μM条件下测定了藜芦胺衍生物对AP-1信号通路的抑制作用,共筛选出13个目标化合物对AP-1信号通路的抑制作用比先导化合物藜芦胺更强。同时,考虑到NF-κB信号通路对人体正常生理功能的调节具有重要作用,本课题利用构建的HEK293/NF-κB荧光素酶报告基因系统测试了目标化合物对NF-κB信号通路的抑制作用。结合藜芦胺衍生物在以上两种报告基因系统中的测试结果,课题组共优选出8个衍生物VT-18、VT-19、VT-22、VT-23、VT-27、VT-38、VT-39、VT-42在保持较强AP-1通路抑制活性的基础上对NF-κB通路无明显抑制作用。因此,本课题测试了8个优选藜芦胺衍生物对三阴性乳腺癌细胞的增殖抑制活性,结果显示,衍生物VT-38和VT-39显示出比先导化合物藜芦胺(IC50=10.37μM)更优的体外增殖抑制活性,IC50值分别为3.87和4.22μM。进一步机制研究表明,优选衍生物通过结合于靶DNA序列,有效抑制了AP-1/DNA复合物的形成,从而抑制了下游MMP-2和MMP-9的表达,发挥抗三阴性乳腺癌侵袭和转移的作用。最后,利用分子对接技术考察优选衍生物与DNA靶序列的结合模式,结果表明优选化合物与DNA碱基之间的氢键作用与先导化合物藜芦胺的结合模式相似,且23位羟基是重要的药效基团,提示我们在下一步的结构修饰中应以原形形式保留更有利于保持活性。综上所述,本课题以活性天然产物藜芦胺为先导化合物,经结构优化及生物活性测试研究获得了一系列对AP-1通路具有较强选择性抑制活性的藜芦胺衍生物,其中两个衍生物对三阴性乳腺癌细胞在体外测试中显示较强的细胞增殖抑制活性,值得进一步研究。本课题新型AP-1通路抑制剂的研究结果为新型抗三阴性乳腺癌药物的研发提供了新的先导化合物,同时也为抗肿瘤药物设计提供了新思路。

关键词： 乳腺癌   骨化三醇   肿瘤转移   胶束   pH敏感  

摘要： 三阴性乳腺癌（TNBC）的治疗依赖于以细胞毒性药物为基础的化疗,包括紫杉醇（PTX）。不幸的是,PTX会促进癌细胞的转移以及转移灶的形成。为了对抗PTX在TNBC治疗中的促转移作用,本研究采用双pH敏感胶束将骨化三醇（CTL）与PTX一起递送。PTX/CTL共载双pH敏感胶束PCDM在肿瘤微环境的酸性条件下,组成PCDM的聚合物结构的改变,使胶束表面电荷由负向正转变,这种特性使得PCDM能够从单核吞噬细胞系统的清除中逃逸,并易于被肿瘤细胞摄取,在溶酶体内释放PTX和CTL。本研究主要包含以下四部分内容:1.胶束原料的合成及表征我们通过迈克尔加成的方法合成了两种胶束原料BD-PEG和BD-PEI-DMA,并通过核磁共振光谱结合已有的文献对产物的结构进行确认,并通过MALDI-TOF和GPC对两种物质的分子量大小进行了确认,分子量分别为3.35KDa和8.36KDa。***的合成及表征我们通过薄膜水化法合成了胶束PCDM,并测定胶束粒径和在不同pH值下的电位变化,通过透射电子显微镜观察胶束形态,并通过释放实验也证明了胶束良好的稳定性。***体外对乳腺癌细胞的影响我们构建了小鼠乳腺癌细胞4T1模型,用香豆素（C6）代替药物进行细胞摄取实验,并进行了定量摄取实验。细胞迁移、侵袭和划痕实验展现了胶束对4T1肿瘤细胞侵袭、迁移和划痕愈合能力的抑制作用,同时,细胞毒性实验也显示了PCDM胶束制剂对4T1肿瘤细胞生长和增殖的抑制作用。***在体内抑制乳腺癌增殖和肺转移的研究这部分中,我们首先通过大鼠的药代动力学实验和荷瘤裸鼠的分布实验,证明了PCDM有效提高了药物的血液循环时间,并增加了肿瘤组织的药物累积。在裸鼠乳腺癌原位瘤模型实验中,相对于游离药组和生理盐水组,含有PTX和CTL药物的PCDM胶束制剂可有效的抑制肿瘤的生长,且效果好于单用一种药物的制剂组和不含BD-PEI-DMA材料的制剂组。免疫荧光和肺组织中Ly6C+单核细胞数量的检测实验表明,PCDM通过下调MMP-9和BCL-2水平,上调E-cadherin水平,并通过CTL抑制了PTX诱导的CCL2和Ly6C+单核细胞水平升高,从而有效抑制小鼠4T1原发性肿瘤生长,抑制肺转移。且PCDM在不提高血清钙水平的情况下具有良好的生物相容性。综上所述,基于这种pH敏感胶束的PTX和CTL的联用有望用于三阴性乳腺癌的治疗。

关键词： 三阴性乳腺癌   华蟾素注射液   抗肿瘤多肽   细胞增殖   细胞周期   细胞凋亡   PI3K/Akt信号通路  

摘要： 三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是指雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)均表达为阴性的乳腺癌,占所有乳腺癌病理类型的15-20%。由于TNBC患者缺少ER、PR和HER2的表达,所以现有的针对ER、PR的内分泌治疗和针对HER2的靶向治疗均难以取得理想的治疗效果。而中医药在西医辨病的基础上,根据中医整体观念和辨证论治的原则,病证相应,在TNBC的临床治疗上,发挥独特的优势,因此从中药中寻找和开发全新的、低毒高效的治疗TNBC的先导药物具有迫切的现实意义。 华蟾素注射液为中华大蟾蜍皮经加工制成的水溶性制剂,广泛用于多种中晚期肿瘤的临床治疗。华蟾素注射液成分较为繁多且复杂,其中多肽占其固形物成分的50%以上,且为抗肿瘤的主要活性成分之一,然而如何明确复杂的华蟾素多肽的序列,并阐明其作用机制,是其开发过程中亟待解决的问题。本研究以华蟾素注射液及其多肽为研究对象,通过体内、外实验明确华蟾素注射液及其多肽对TNBC的抑制作用,并初步探索其机制,为华蟾素注射液的临床应用提供理论依据和实验基础,为靶向治疗TNBC提供新的潜在药物。 首先,检测华蟾素注射液对体外培养的不同类型乳腺癌细胞增殖的影响。CCK8实验表明,华蟾素注射液可以抑制MCF-7、MDA-MB-231、4T1、SK-BR-3和ZR-75-1细胞的增殖,并具有时间剂量依赖性。进一步集中分析华蟾素注射液对TNBC细胞系MDA-MB-231的影响并探究其机制。克隆形成实验表明,华蟾素注射液可以显著抑制MDA-MB-231的增殖;流式细胞术检测结果表明,华蟾素注射液可以引起MDA-MB-231细胞S期阻滞,并诱导细胞发生凋亡;Western blot结果表明,华蟾素注射液通过下调Bcl-2/Bax比值诱导细胞发生凋亡。上述实验结果提示,华蟾素注射液通过诱导S期阻滞和凋亡,抑制TNBC细胞的增殖。 本课题组前期利用“转录组-蛋白质组-肽组学”的整合关联分析,已经成功构建含有837条序列的华蟾素注射液的多肽库,在此基础上,本研究利用生物信息学分析进一步构建了华蟾素注射液的抗肿瘤多肽库,结合多肽的理化性质及结构分析,人工合成了其中5条候选抗肿瘤多肽。首先利用CCK8实验考察其对MCF-7、MDA-MB-231和4T1细胞增殖的影响,结果表明,在相同浓度下QK-17抑制乳腺癌细胞增殖的活性最强,其中对TNBC细胞的增殖抑制作用最显著。克隆形成和LDH释放实验表明,QK-17可以明显抑制MDA-MB-231细胞的克隆形成,且使其LDH释放增多,抑制细胞增殖。接下来,对QK-17抗TNBC的机制进行深入研究。流式细胞术检测结果表明,QK-17可以引起MDA-MB-231细胞S期阻滞,ROS含量增多,并诱导细胞发生凋亡;RNA-seq和Western blot结果表明,QK-17通过调节PI3K/Akt通路发挥抗肿瘤活性;动物实验表明,QK-17可以抑制4T1荷瘤小鼠的肿瘤生长,但对其体重、脏器均无明显影响,说明QK-17具有潜在的抗肿瘤开发前景。 综上所述,华蟾素注射液能够抑制多种乳腺癌细胞系的增殖,且能够引起TNBC细胞发生S期阻滞并诱导细胞凋亡;QK-17能通过调节PI3K/Akt通路抑制TNBC细胞增殖,进而引起细胞周期阻滞并发生凋亡;体内实验表明QK-17能够抑制TNBC荷瘤小鼠的肿瘤生长,且无显著毒性。本研究不仅为临床上治疗TNBC提供新的潜在药物,而且为其它富含蛋白多肽的中药研究提供一种高通量、高准确度的新方法。

关键词： 卤代噻唑   抗肿瘤   三阴性乳腺癌   MDA-MB-231  

摘要： 三阴性乳腺癌由于其特殊的分子分型特征,如ER（雌激素受体）表达阴性、PR（孕激素受体）表达阴性和HER2（人表皮生长因子受体）不过度表达等。导致诸多针对乳腺癌的临床药物缺乏既定的雌激素靶点,且化疗具有诸多副作用,包括毒副作用以及耐药性等。因此,开发新型的抗三阴性乳腺癌药物十分必要。天然卤代化合物具有良好的生物活性,但由于其结构和数量受限,因而化学组合设计合成卤代化合物逐渐成为药物研发的一大热点。以噻唑胺基作为结构母核添加活性基团后,进行卤素取代,可以改善化合物物理及化学性质,由此得到了一系列化合物。其中发现溴代苯甲醚类杂合物TSC-2C对三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231具有良好的增殖抑制活性;抑制细胞的迁移和侵袭能力,最终诱导细胞凋亡。这提示我们卤素取代的噻唑胺基对于抗肿瘤药物的合成具有指导意义。同时,我们发现该系列化合物中的氟代噻唑类化合物TSC-3C,对MDA-MB-231细胞株最为敏感,其IC50为2.79μM左右,且对正常细胞无毒性。研究发现化合物TSC-3C抑制MDA-MB-231细胞的科龙形成以及迁移侵袭能力,干扰线粒体膜电位及功能,影响线粒体内外蛋白含量;通过对作用机制的进一步探究,我们发现化合物TSC-3C影响了MAPK信号通路的相关蛋白变化,由此推测TSC-3C通过调节MAPK信号通路最终诱导MDA-MB-231细胞凋亡以实现其抗肿瘤活性。这为今后TSC-3C开发为靶向抑制三阴性乳腺癌的抗肿瘤药物奠定基础,也为该类化合物对于抗肿瘤药物的设计与合成提供一定的科学依据,对揭示MAPK通路在乳腺癌发生及发展中的作用和三阴性乳腺癌药物的研发具有理论意义。

关键词： 多肽   前药设计   超分子自组装   三阴性乳腺癌   抗肿瘤作用  

摘要： 超分子自组装是生物体构建自身结构实现复杂功能的重要手段，并在生物医学领域广泛用于仿生材料的构建。在众多仿生材料中，多肽因其生物可降解性和易于功能化修饰等突出优势，是一类重要的生物材料。进一步将多肽和其他功能性分子键合获得的两亲性杂合多肽衍生物，不仅丰富了分子结构设计，而且可自组装形成更为多样的微观结构，实现特殊的生物学功能，是多肽自组装及其生物医学应用研究领域的热点。　　三阴性乳腺癌(TNBC)是雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及人表皮生长因子受体2(Her-2)均为阴性的乳腺癌，具有恶性程度高、不依赖瘤体大小多脏器远端转移等特点，是临床上预后最差的乳腺癌。由于不表达相应受体，TNBC对激素疗法和分子靶向疗法不敏感，同时对免疫疗法的响应率低。目前，化疗是临床上对TNBC有效的唯一一种系统性治疗手段，但化疗药物的非选择性蓄积导致其严重的毒副作用，并限制了临床治疗剂量和药效。此外，TNBC微环境复杂，其肿瘤基质成分不仅限制了药物的瘤内分布，同时也造成了免疫抑制微环境。多肽自组装药物递送载体具有高药物负载率和肿瘤特异性富集能力，有望提高化疗药物或免疫调节剂的肿瘤蓄积和渗透。其中，多肽分子设计如何决定其自组装行为及载体理化特性，并影响生物相互作用是其中的关键科学问题。在此，我们设计合成了一系列两亲性多肽，通过评价其自组装特性和生物相互作用，筛选出具有良好肿瘤蓄积能力的两亲性多肽，并据此构建了自组装前药(SAPD)，提高了对转移性TNBC的治疗效果，降低了副作用，并揭示了其作用机制。　　为探究多肽亲水链段影响其自组装载体与生物相互作用的规律，我们首先合成了一系列含有相同亲水头基(HKD)、β-折叠片段(VVQQ)和疏水脂肪酸链(Pal)，但带有不同重复四肽片段(X4)的杂合多肽。我们发现，Pal-GVVQQHyp4HKD(Hyp4)形成的PPⅡ结构可通过形成空间位阻，减少血液中内源性蛋白与β-折叠片段和脂肪酸链的吸附，降低自组装载体的非特异性清除。该载体具有弱酸性(pH6.5)响应聚集的能力，显著提高了药物在微酸性肿瘤部位富集。该载体可有效包载多西他赛(DTX)，载药量可达16.2％，并将DTX在体内半衰期从游离药的0.46h延长到13.35h，将DTX的瘤内蓄积提高7.56倍，并提高了DTX的最大耐受剂量(MTD)，有效抑制了TNBC原位瘤生长和肺转移。　　在此基础上，我们进一步研究了Hyp4扩大高毒性药物DM1治疗窗的能力，发现采用Hyp4包载将DM1得MTD提高了1倍。进一步设计合成得到DM1自组装前药DM1-CGVVQQHyp4HKD(DM1-Hyp4)不仅提高了载药量，还通过降低DM1在毒性器官（脾和肾）的蓄积和瞬时暴露，将其MTD提高了8倍。在给予MTD的DM1后，DM1-Hyp4(4mg/kg)对原发肿瘤的生长抑制率达到92％，而DM1(0.5mg/kg)的抑制率仅为39％。　　肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)及其分泌的胞外基质是抑制TNBC内药物渗透以及免疫细胞浸润的主要生理屏障。为进一步提高Hyp4载体抗TNBC的效果，我们将调控CAFs活性的洛沙坦引入到两亲性多肽，构建了SAPD载体(LST-Hyp4)，并同时递送细胞免疫原性死亡(ICD)诱导剂DM1。我们发现，LST-Hyp4在较低剂量和给药频率时，即可抑制CAFs活性和胶原生成，从而促进药物渗透。递送的DM1可在肿瘤部位诱导ICD和免疫细胞浸润，最终激活抗肿瘤免疫应答，提高抗TNBC治疗效果。　　我们的研究表明，在两亲性多肽序列中引入具有空间占位功能的Hyp4和微酸性敏感的HKD多肽片段可通过抑制非特异性蛋白吸附，有效延长自组装载体的血液循环，实现肿瘤倾向性蓄积;通过还原敏感键共价偶联药物构建的SAPD，课改变药物生物分布和活性药物暴露，显著提高肿瘤靶向药物递送效率，增强治疗效果，降低副作用。我们的研究揭示了两亲性多肽的设计原理和SAPD体内生物转化机制，阐明了SAPD策略提高TNBC化疗效果和安全性方面的机理，为临床TNBC化疗和联合治疗提供了新策略，具有潜在的临床应用价值。

关键词： 虫草素   三阴性乳腺癌   网络药理学   TNF信号通路  

摘要： 蛹虫草Cordyceps militaris(L.)Fr.又名北虫草,是我国珍贵药食兼用菌。虫草素作为蛹虫草的主要活性成分之一,具有低毒、安全性高、高活性等天然优势,其显著的抗肿瘤作用更是受到极大的关注。三阴性乳腺癌(TNBC)作为女性乳腺癌中的最强“杀手”,当前治疗仍以化疗为主,寻找天然产物或药物进行联合以增强化疗的效果,是当前治疗的重要方向之一。因此,本研究将虫草素和抗肿瘤一线药(阿霉素)联合使用,以期丰富蛹虫草药效物质虫草素的药效基础理论,为治疗TNBC的临床用药提供新思路。本研究首先检测了联合用药的效应;其次,在体内、外明确了联合用药对TNBC的活力、增殖、迁移、凋亡和生长的影响及其毒副作用;再进一步基于网络药理学解析联合用药的分子作用机制;最后结合分子对接和生物学实验对分子机制进行初步验证。主要研究结果如下:(1)联合指数(CI)计算结果显示,供试浓度下虫草素联合阿霉素抗乳腺癌的CI值均小于1,表明联合用药呈协同效应;其中80μM虫草素联合1μM阿霉素的CI值仅为0.665,对细胞抑制率为60.31%±1.06,达到了细胞的半数致死率。(2)体外细胞实验显示,联合用药后细胞趋向变圆、逐渐脱落、破碎;平板克隆形成实验验证了联合用药抑制了细胞增殖,细胞增殖率仅为7.03%±1.19;细胞划痕实验证明联合用药抑制了细胞迁移,细胞迁移率仅为18.82%±2.43;Hochest 33258和DNA Laddder凋亡实验检测到联合用药诱导了细胞凋亡,细胞凋亡率达78.52%±11.18,并可观察到断裂的凋亡DNA条带。(3)体内裸鼠移植瘤实验显示,对照组的瘤重是联合组的3.57倍,联合组的肿瘤抑制率为79.53%±12.63,分别是虫草素组和阿霉素组的1.21倍和1.34倍;进一步发现,联合组的动物体重均匀,肝脏颜色红润、质地均匀、弹性较好,肝指数及肝功血清指标ALT,AST正常,与对照组相比,无显著性差异(P>0.05),表明联合用药在体内显著抑制乳腺癌生长的同时且并无明显毒性。(4)通过网络药理学探究联合用药的机制,预测获得虫草素和阿霉素相关靶点分别为147个和2469个;联合用药抗乳腺癌潜在作用靶点涉及76个;GO分析显示,76个靶点主要富集在肿瘤细胞凋亡、细胞转移、细胞周期等过程;KEGG和Enrichr分析显示,靶点主要富集在TNF、IL-17、AGE-RAGE和凋亡等6条与肿瘤生长密切相关的信号通路中,其中以TNF信号通路富集最显著。同时,TNF信号通路与富集的其他多条信号通路相互作用,表明联合用药的分子机制与调控TNF信号通路中的CFLAR、NFKB1、MAP3K7、MAPK8、CASP3、ICAM1、MMP3、MMP9、JUNB、CXCL1、CCL2等11个靶点有关。(5)分子对接结果显示,虫草素、阿霉素与11个靶点的结合能均小于0,表明二者分别能与11个靶点自发结合;并且二者可分别与CFLAR、MMP3和MAP3K7等关键蛋白的氨基酸残基形成氢键、PI键、H-PI复合键等作用,从而稳定地结合在蛋白的活性口袋中;同时,联合用药在基因和蛋白水平上也相应地上调了CASP3和MAPK8,下调了CFLAR、NFKB1、MAP3K7、ICAM1、MMP3、MMP9、JUNB、CXCL1、CCL2的表达,这与网络药理学的分析一致,提示联合用药可调控TNF信号通路中11个靶点抑制TNBC的生长。虫草素联合阿霉素在体内、外均能协同抑制TNBC的生长且并无明显毒性,其关键机制与对TNF信号通路中多靶点的调控有关,这为丰富蛹虫草药效物质虫草素的药效基础理论提供了科学依据。

关键词： 紫草素   微乳   靶向抗肿瘤   三阴性乳腺癌   CD133  

摘要： 目的评价CD133抗体修饰的紫草素微乳(anti CD133 antibody-modified shikonin-loaded microemulsion,Anti CD133Ab-SKN-MEs)治疗三阴性乳腺癌的可行性及优势。方法利用经典的成乳工艺制备紫草素微乳(SKN-MEs),再通过EDC/NHS缩合技术制备Anti CD133Ab-SKN-MEs,以粒径、Zeta电位、包封率为指标优化投料比、抗体修饰密度等工艺参数;采用MTT法考察三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖行为,利用异硫氰酸荧光素(FITC)作为探针定性定量考察细胞摄取行为,借助膜联蛋白V-PE/7-氨基放线菌素D(Annexin V-PE/7-AAD)试剂盒考察给药组诱导细胞凋亡行为;借助悬浮培养技术富集MDA-MB-231干细胞,通过各给药组孵育观察细胞成球性以及CD133+细胞率;建立裸鼠MDA-MB-231异位移植瘤模型,设生理盐水、紫草素(SKN)、SKN-MEs、Anti CD133Ab-SKN-MEs,4 mg/kg隔天iv 5次,观察肿瘤体积、裸鼠生存时间、抑瘤率和CD133+细胞比率。结果 Anti CD133Ab-SKN-MEs的最佳质量比为1.0%,抗体密度为0.025%,粒子形态圆整,粒径为(31.4±2.1)nm,电位为(-18.7±2.5)m V,包封率为(93.6±2.8)%;Anti CD133Ab-SKN-MEs对MDA-MB-231细胞的IC50为(1.53±0.43)μg/m L,细胞摄取显著高于SKN和SKN-MEs,孵育8 h可诱导(67.9±4.2)%细胞凋亡;Anti CD133Ab-SKN-MEs可以显著抑制MDA-MB-231干细胞的成球性,明显降低CD133+细胞率;Anti CD133Ab-SKN-MEs体内抑瘤率为78.5%,69 d后仍有12.5%裸鼠存活,瘤组织CD133+细胞率显著降低。结论与SKN相比,Anti CD133Ab-SKN-MEs在治疗三阴性乳腺癌方面优势明显,机制可能与降低肿瘤细胞干性作用有关。