关键词:
手足口病
CVA4
小鼠模型
鱼腥草
丝裂原活化蛋白激酶
摘要:
背景:柯萨奇病毒A4型(Coxsackievirus A4,CVA4)是引起手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)的重要病原体之一。CVA4属于小核糖核酸病毒科,肠道病毒属,为单义正链RNA病毒,含有约7400个核苷酸。在过去的5年中,CVA4已成为全球手足口病的优势流行株,在全球引起了更严重、更大范围的流行性疾病。由于CVA4可致患儿心肌炎、脑膜炎甚至死亡,现已受到各国政府的广泛关注。理想的感染疾病动物模型是抗病毒药与疫苗开发的必要条件。近年来国内外相继有采用1至7日龄乳鼠建立CVA4感染疾病模型的报道,但由于7日龄以内乳鼠体型过小、器官发育不全及给药容量有限等诸多缺陷,很难适合用于抗病毒药物与疫苗疗效评价,因此迫切需要建立一种可用于抗病毒药物药效评价的大日龄CVA4感染小鼠模型。此外,目前国内外尚未有抗手足口病的特效药物,开展此类药物的研发尤为迫切。我国的临床实践表明由清热解毒类中草药组成的中药方剂在临床治疗手足口病具有一定疗效。初步机制研究显示此类药物主要通过抑制病毒复制、阻止病毒致细胞病变、调节免疫功能、改善肺循环、镇痛、抗炎等作用发挥抗手足口病疗效。因此,基于中草药的安全性与易获得性,从传统中草药(Traditional Chinese Medicine,TCM)中开发防治手足口病药物可能是一条比较便捷的途径。
目的:鉴于当前缺乏合适的CVA4药效评价模型,本论文首要目的是建立一种适合于开展抗CVA4病毒药物药效评价的大日龄小鼠模型;其次是通过体内外CVA4感染疾病模型对传统中草药鱼腥草抗CVA4的药效作用及机制进行研究,以期为后续开发广谱抗手足口病创新中药奠定基础。
方法:
(一)柯萨奇病毒CVA4小鼠感染模型的建立首先采用蚀斑纯化法从临床样本中分离到一株对非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)和人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)呈高致病性的CVA4临床分离株,然后通过肌肉注射在11日龄乳鼠体内和RD细胞上交替反复传代10次驯化获得对大日龄乳鼠呈高致死性的CVA4鼠适应株;然后在RD细胞上对其复制特性进行了测定;采用PCR法分段扩增CVA4鼠适应病毒株的全基因序列,经DNASTAR软件进行序列拼接,获得CVA4全基因序列并构建遗传进化树分析其基因型;在此基础上通过体内实验确定了CVA4最佳感染日龄、最佳感染剂量和最佳感染途径;CPE法测定乳鼠各个组织器官中的病毒载量;多细胞因子芯片法测定乳鼠血清中MIP-2、IL-22、IL-10、IL-18、TNF-α、IL-6、IL-13、IL-9、IL-4、IL-12p70、IFN-γ、MCP-1、MCP-3、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、IP-10、Eotaxin和GM-CSF等19种炎症因子的水平;HE染色法分析CVA4感染乳鼠骨骼肌、肺、小肠和脑部位的组织病理学变化。
(二)鱼腥草抗CVA4药效作用及机制研究首先采用MTT法检测了鱼腥草在Vero和RD细胞中的细胞毒性;然后以CVA4分别感染Vero和RD细胞为模型,采用细胞病变抑制试验(CPE)对鱼腥草的抗CVA4活性进行评价;免疫荧光法对鱼腥草抑制CVA4复制的作用进行了评价,接着采用Western blot和q RT-PCR法分别对鱼腥草抑制CVA4蛋白表达与RNA的作用进行了分析;在此基础上采用Western blot法对鱼腥草抗CVA4感染的潜在作用机制进行了探究;最后以CVA4感染13日龄乳鼠为动物模型,以体重增长率、临床评分、生存率、生存时间、小鼠骨骼肌组织病理变化和病毒RNA水平等评价指标综合评估了鱼腥草体内抗CVA4感染的药效作用。
结果:
(一)柯萨奇病毒CVA4小鼠感染模型的建立经11日龄乳鼠肌肉注射与人横纹肌肉瘤RD细胞多次交替传代所获得的鼠适应CVA4毒株能很好地在RD细胞中生长,测得其滴度可高达108.8TCID50/m L。全基因序列分析结果表明该毒株属于CVA4血清型中的C基因型。经最佳感染日龄、最佳感染剂量和最佳途径感染实验确定最佳感染条件为肌肉注射100TCID50的13日龄乳鼠模型。病毒载量测定结果表明CVA4感染不同日龄乳鼠的骨骼肌、心、肺、脑、肝、肾、脾和小肠部位均存在病毒复制,其中骨骼肌的病毒载量最高,接近10~6TCID50/50mg。CVA4感染13日龄乳鼠后第1天骨骼肌的病毒滴度为104.79TCID50/50mg;感染后第3天病毒滴度达到峰值,为106.59TCID50/50mg;感染后第5、7、9天病毒复制水平基本恒定,分别为106.14、106.92、105.87TCID50/50mg。血清细胞因子结果表明,CVA4感染乳鼠导致MIP-2、IL-22、IL-10、IL-18、TNF-α、IL-6、IL-13、IL-9、