关键词:
高通量测序
宏基因组
肠道病毒
手足口病
CV-B3
摘要:
研究背景:肠道病毒属隶属于小RNA病毒目(Picornavirales)下的小RNA病毒科(Picornaviridae),目前肠道病毒属包括15个组(Species),分别是肠道病毒A-L和鼻病毒A-C,共计200多个血清型,引起人类疾病的主要是肠道病毒A-D和鼻病毒A-C,肠道病毒是引起人类弛缓性麻痹、无菌性脑膜炎、心肌炎和儿童手足口病等传染病重要的致病病原体。自从2008中国大陆建立起手足口病实验室监测网络以来,肠道病毒的流行病学、病原学以及分子流行病学研究有了突飞猛进的进展,肠道病毒的诊断方法得到了较大的改进。由于肠道病毒A组71型、柯萨奇病毒A组16型和柯萨奇病毒A组6型是手足口病的主要致病病原体,因此目前大多数研究集中在这几种肠道病毒上,但是对于其他少见血清型肠道病毒的研究依旧较少,对于他们的遗传进化规律、流行特点、传播模式和致病力的研究仍是空白。并且,肠道病毒感染后多数呈现隐性感染和轻症感染,由于没有临床症状或症状轻微因而很难被监测到,对于它们的分子流行病学特征和变异变迁规律的研究也不够充分。随着下一代测序技术(next-generation sequencing,NGS)的发展,应用NGS去研究动物、植物、真菌和细菌的遗传变异规律已经成为国际上的常规技术手段,为认识病毒圈(Virosphere)奠定了技术基础。NGS也为我们研究健康儿童体内肠道病毒病原谱构成提供了技术条件,有利于研究人员全面地认识肠道病毒在健康人群内流行特点、遗传变异规律和致病力的变化。对于充分了解我国人民的健康水平有着非常重要的作用,有利于肠道病毒病的临床诊断、治疗、疫苗研发和公共卫生防控政策的制定。西藏自治区位于我国的西南边陲,与缅甸、印度、不丹、尼泊尔、克什米尔等国家及地区接壤,地理位置的重要性十分突出,在国家大力援助西藏自治区的政策方针下,加强西藏自治区健康儿童的肠道病毒流行特征监测,对于提升当地人民的健康水平和公共卫生政策的制定有着十分重要的意义。研究目的:进行2017年我国西藏自治区健康儿童粪便样本病毒组学研究,探索分析粪便标本处理、病毒宏基因组文库构建、生物信息学数据分析等对病毒组学研究的影响及适用条件。结合病毒分离和一代Sanger测序方法,从病毒宏基因组和一代测序两个角度分析2017年西藏自治区健康儿童携带肠道病毒的病原谱构成,揭示西藏自治区健康儿童主要血清型肠道病毒的流行和传播特点。研究方法:对采集于2017年中国西藏自治区健康儿童的311份粪便样本进行处理,分别使用转录组NGS测序和病毒分离结合一代Sanger测序方法对粪便标本进行肠道病毒病原谱研究。本研究中对311份粪便标本共构建4个文库,采取宏转录组测序方法;同时使用fastqc、Trimmomatic、bwa、blast等国际上最新的生物信息学软件,对二代测序的原始数据进行处理和分析,从中获取到病毒的序列,并且完成组装和注释工作;采用病毒分离方法,并对分离的肠道病毒进行一代Sanger测序和分子定型工作,以验证病毒宏基因组测序结果;结合GenBank中已有序列,对柯萨奇病毒B组3型(coxsackievirus B3,CV-B3)进行系统的分析,阐明其分子流行病学特征、进化和变异变迁规律等。研究结果:1.基于NGS技术对2017年西藏健康儿童粪便标本中的病毒谱进行了分析。尽管去除了人类rRNA后,人类基因组序列和细菌序列仍然占据文库数据的90%以上,病毒的序列所占比例不足5%。2.通过病毒宏基因组学方法揭示了 2017年西藏健康儿童粪便标本中的病毒组构成,结果表明不同文库中的主要病毒类型差异较大,其中杯状病毒科和小RNA病毒科在各个文库中含量较高,并且EV核苷酸序列在各个文库占比变化较大。各个文库含有非常多与人类疾病无关的病毒(例如烟草花叶病毒),有一些未分类和未能培养的病毒(占病毒序列的比例不足1%),这初步表明健康儿童的粪便样本中病原谱十分复杂。3.探讨了 EV宏基因组学的研究方法,针对粪便标本处理、文库构建和生物信息学数据分析等影响因素进行探讨,形成了一条适用于EV的简单的病毒发现和鉴定的工作流程。进一步分析了 EV宏基因组结果,探讨了测序数据中的EV基因组的测序深度和覆盖度,对造成测序数据回帖至参考基因组失败的原因进行了分析。4.初步构建了针对EV的高通量数据生物信息学分析平台,并将该平台应用于EV的发现和鉴定,于2017年西藏健康儿童粪便标本共鉴定EV血清型12个,并且成功拼接出部分丰度较高的CV-A10等EV的全基因组序列,。5.采取病毒分离、荧光定量PCR和一代Sanger测序方法对宏基因组学的结果进行了验证和分析,共鉴定EV血清型14个,EV病原谱以CV-B3为主。***-B3在中国大陆地区形成了三条传播链(lineagel-3),其中lineag