关键词:
手足口病
感染性克隆
柯萨奇病毒A组10型
乳鼠模型
ICR乳鼠
摘要:
目的:柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CA10)是小核糖核酸病毒科肠道病毒属A组的成员,近年来已成为引起手足口病(Foot,and mouth disease,HFMD)的四大病原体之一。CA10还能引起疱疹性咽峡炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经呼吸综合征甚至死亡。目前尚无针对CA10的预防性疫苗和特殊治疗药物。以往研究结果提示:利用反向遗传学技术,构建病毒基因的感染性克隆获得拯救病毒,继而为进一步研究提供有力的工具。因此,本研究拟通过构建CA10cDNA感染性克隆获得拯救病毒,再利用拯救的CA10病毒建立ICR乳鼠动物模型,以期为CA10相关的疾病的诊断、防治等工作提供实验基础。方法:***10cDNA感染性克隆的构建与病毒拯救将本课题组已构建成功的pSVA-CA10-P148的质粒,与pLVX-Puro-T7RNA polymerase(由华大基因公司合成)共转染293T细胞;用转染后的培养上清液感染RD细胞,当感染细胞发生病变后收获拯救病毒。通过TEM、RT-PCR、Western Blot等方法对拯救病毒进行检测。其中,感染RD细胞时,以无处理组为阴性对照、母本病毒株处理组作为阳性对照。2.应用拯救病毒CA10构建ICR乳鼠动物模型(1)使用拯救病毒CA10感染一日龄ICR乳鼠实验将实验动物分成实验组和阴性对照组,其中实验组使用拯救病毒CA10,阴性对照组使用无菌PBS缓冲液;方式为颅内注射。记录注射后21天内,实验动物的体重、临床评分、生存状态等情况。将实验中,实验组濒死鼠的脑组织上清液收集,通过RT-PCR方法检测CA10病毒,如为阳性,即作为第二次动物实验组的病毒感染液,并命名为CA10-ICR-BTS1。(2)使用CA10-ICR-BTS1感染一日龄ICR乳鼠实验实验分组、处理方式及观察指标与拯救病毒CA10感染一日龄ICR乳鼠实验相同,不同的是实验组使用CA10-ICR-BTS1。将实验中,仍将实验组濒死鼠的脑组织上清液收集,通过RT-PCR方法检测CA10病毒;如为阳性,即作为第三次动物实验的病毒感染液,并命名为CA10-ICR-BTS2。(3)使用CA10-ICR-BTS2感染一日龄ICR乳鼠实验(1)将CA10-ICR-BTS2进行10倍连续稀释(10~010-6),通过颅内注射分别感染一日龄ICR乳鼠,每个稀释度为一组,每组8只,同时以PBS处理组为阴性对照;注射后21天内观察乳鼠临床表现,平均体重及生存状态。(2)使用10-4TCID500 20ul剂量的CA10-ICR-BTS2感染一日龄ICR乳鼠,观察21天。观察乳鼠临床表现,平均体重及生存状态;并将濒死乳鼠或实验结束仍然存活实验鼠的脑、心、肝、肺、肠、四肢肌等组织分别进行实时定量PCR、HE染色及免疫组织化学分析。结果:***10cDNA感染性克隆的构建与病毒拯救结果。拯救的CA10病毒感染RD细胞出现CPE。TEM可观察到实验组与对照组均存在大小形状一致的病毒颗粒。同时,两组细胞均有CA10病毒基因和VP1蛋白表达。2.应用拯救病毒CA10构建ICR乳鼠动物模型的结果(1)拯救病毒CA10感染一日龄ICR乳鼠实验结果发现:(1)与对照组相比,实验组小鼠的体重增长明显受到影响。(2)实验组的平均临床评分第1-4天出现明显上升,第14-16天下降后趋稳;阴性对照组则一直为0。(3)实验组生存率为37.5%,阴性对照组为100%。(4)RT-PCR结果提示,部分实验组鼠大脑组织中CA10病毒阳性。(2)CA10-ICR-BTS1感染一日龄ICR乳鼠实验结果发现:(1)与对照组相比,实验组小鼠的体重增长仍明显受到影响。(2)实验组的平均临床评分第1-2天出现明显上升,第3-21天乳鼠全部死亡,平均临床症状评分为5;阴性对照组则一直为0。(3)实验组生存率为0,阴性对照组为100%。(4)RT-PCR结果提示,全部实验组鼠大脑组织中CA10病毒阳性。(3)CA10-ICR-BTS2感染一日龄ICR乳鼠实验结果发现:(1)10~0-10-4组拯救病毒感染的乳鼠死亡率为100%。10-5组乳鼠存活率为25%,感染5天(5dpi)后仍然存活的实验鼠平均体重有小幅增长;5dpi时平均临床评分为4,16dpi后平均临床评分下降到3.75。10-6组无死亡,平均体重与阴性对照无显著差异;平均临床评分在4 dpi时为3级,在17 dpi后则下降至0。(2)10-4TCID50剂量的CA10-ICR-BTS2感染一日龄ICR乳鼠实验结果发现:A.实时定量PCR结果提示:脑,肠,心脏,四肢肌,肝脏和肺中的平均病毒拷贝分别为6.0×10~5,1.1×10~5,1.9×10~6,8.9×10~8,7.0×10~6和1.2×10~7(copie