关键词:
埃可病毒11型
手足口病
急性迟缓性肌肉麻痹
流行病学
基因特征
基因重组
实验室生物安全
摘要:
研究背景:肠道病毒(enterovirus,EV)归属于小RNA病毒目小RNA病毒科中的肠道病毒属。目前已经报道的EV有116种血清型,分属于15个组:EV-A至EV-L,以及鼻病毒A-C组。肠道病毒为无包膜病毒,在酸性环境中稳定,对紫外线敏感,目前实验室常用的EV灭活方式包括热力灭活、紫外线照射、含氯消毒剂及甲醛熏蒸等方式。Echovirus 11作为EV-B的一员,是较常分离到的EV,疾病谱分布广泛:从轻度非特异性症状到全身性疾病,如皮疹,发热,手足口病(Handfoot,andmouthdisease,HFMD),葡萄膜炎(uveitis)和严重的神经系统疾病,包括无菌性脑膜炎,脑炎和急性迟缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)等。特别是导致新生儿败血症样症状(sepsis-likedisease)和多器官系统出血(multisystem hemorrhagic disease)的发生,其高病死率引起社会恐慌。文献提示,有关E-11流行病学和基因特征及实验室EV灭活效果评价方面的研究仍比较匮乏。仅有的E-11基因特征研究在地理分布和时间跨度上也较为局限,本实验室曾经对1999年西藏自治区和1999-2003年山东省AFP病例中分离得到的E-11毒株进行过相关研究,本研究在此基础上依托HFMD网络实验室监测技术平台,首次对中国大陆分离得到的E-11毒株进行流行病学、基因特征及遗传进化等方面的系统研究;并在EV生物安全二级实验室(Biosafety laboratory-2,BSL-2)中首次对EV常用灭活方式进行了系统评价。研究目的:阐明我国E-11的流行规律,建立E-11 VP1全长及全基因组序列的测定方法,更新E-11基于VP1全长的基因分型结果,系统掌握E-11不同基因型别毒株在全球及全国范围内的分布及流行规律,完善对其基因重组及遗传进化规律的认识,为E-11的进一步研究提供基础数据,为相关疾病的预警预测及预防控制提供科学依据。系统评价EV常用灭活方式的灭活效果,建立BSL-2实验室表面消毒技术,确保实验操作人员安全,为生物安全管理提供可靠数据。研究方法:基于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所建立的中国大陆AFP、HFMD网络实验室监测技术平台,收集1999-2003年,2008-2017年中国大陆由E-11引起的共59例AFP及HFMD病例信息,并扩增全部E-11 VP1全长序列。同时收集筛选GenBank数据库500条国内外E-11 VP1编码区全长序列,建立E-11 VP1区全长序列数据集;对从HFMD网络实验室检测平台获得的17株E-11毒株进行全基因组测序,使用Sequencher、MEGA、Bioedit、Simplot软件对其基因序列特征,重组情况和进化规律等特征进行系统分析。利用细胞培养技术,将灭活处理后的病毒接种于细胞进行病毒滴度实验,通过观察细胞病变效应(CPE),并利用behrens-karber法计算灭活后EV的TCID5o,评价EV热力灭活及常用消毒剂的灭活效果。研究结果:1.截止至2018年12月5日,共收集到国内外E-11 VP1区核苷酸序列全长559条,其中包含分离至六大洲33个国家,时间跨度为1953-2014年度,来源于11种疾病类型的E-11 VP1区全长序列359条和分离至中国大陆1994-2017年12个省份(自治区)的200条E-11VP1区核苷酸全长序列。其中59条为本实验室分离株:41株来源于本实验室前期基于AFP网络实验室监测技术平台,18株来源于HFMD网络实验室监测平台。HFMD来源的18株E-11毒株中有4株为重症HFMD,分离至2012年广东省,2010年湖南省,海南省和2017年河北省。2.基于VP1区核苷酸序列全长,按照肠道病毒基因型别划分标准将E-11划分为A-F六个基因型,基因型A,C和D可被进一步划分为A1-A5,C1-C4和D1-D5基因亚型。其中基因型F是本研究划分的新基因型,D5基因亚型在HFMD中的检出为国内首次报道。3.除中国大陆外共获得六大洲33个国家,时间跨度为1953-2014期间的359株E-11毒株,经分型鉴定后分布于A4-A5、B、C2、C4、D1-D5和F基因(亚)型中。D5基因亚型为1998-2014年度国外流行的优势基因亚型,首次于1998年分离于Tunsia。4.中国大陆分离至1994-2017年度的200株E-11经分型鉴定后,分布于A1-A3、B、C1、C3、D5和E基因(亚)型中,A1基因亚型为2008-2017年度中国大陆流行的优势基因亚型。A1基因亚型自2006年首次从AFP病例中被分离后,至2017年一直有持续性流行。5.将HFMD来源的可获得全长序列的17株E-11毒株根据不同