关键词：
手足口病
肠道病毒
二代测序
全基因组
摘要：
背景和目的:手足口病近年来在我国和东南亚地区国家造成了数百万的感染,导致严重的公共卫生问题。在我国呈高发趋势的手足口病病原体是肠道病毒EV-71型和柯萨奇病毒CV-A16型。深入研究肠道病毒的基因组特点和进化规律,将对手足口病的流行和防治起到至关重要的作用。虽然目前临床诊断肠道病毒以检测到病毒核酸为确诊指标之一,但只是确认病毒的局部特征片段,并不能获取全基因组序列,不能支持肠道病毒的深入研究,而对肠道病毒进行基因组比较分析必须首先找到能够扩增我国肠道病毒流行株的引物。本研究通过调查近年来我国肠道病毒流行株的全基因组序列,建立一种能够获得我国肠道病毒序列的通用扩增方法,为今后的手足口病流行病学分析、致病机理等打下基础。方法:收集我国近五年各地报道的肠道病毒流行株全基因组序列作为参考序列,对参考序列进行比对分析,在保守区设计通用引物,以本实验室保存的肠道病毒毒株对引物进行筛选和验证。利用经过优化的3’RACE、长距离PCR扩增肠道病毒编码区和3’UTR区,利用简并引物扩增肠道病毒5’UTR区,获得肠道病毒的全基因组序列。使用Ion Torrent PGM二代测序仪对扩增产物进行深度测序以对扩增方法进行验证和评价。进一步,利用qRT-PCR建立肠道病毒拷贝数的标准曲线,构建系列梯度浓度的原始病毒液样本,探索该扩增方法的检测下限,评价该检测方法的灵敏度。在此基础上,通过系列摩尔比例混合两种肠道病毒模拟混合肠道病毒感染的情况,使用我们建立的通用扩增方法进行扩增并测序验证,验证该扩增方法的特异度。继而我们使用了一株已验证的肠道病毒重组毒株进行验证,再次验证该扩增方法的准确性。结果:本研究通过优化引物序列和反应体系条件,建立国内肠道病毒流行株通用扩增方法,经二代测序实验获得了肠道病毒全基因组序列,均达到一千倍以上的测序深度。进一步通过16株EV-71型或CV-A16型肠道病毒进行验证,均获得了较高测序深度的肠道病毒全基因组序列。与特异性引物分段扩增相比,两种扩增方法在单一肠道病毒感染时具有相同的特异性和准确度。在检测下限的评价中,肠道病毒的病毒载量低至10～4时,该扩增方法仍能够获得全基因组序列信息。通过系列比例模拟混合病毒感染,该扩增方法能够在1:10比例混合情况下同时获得两株肠道病毒的全基因组序列,且通过测序reads可基本推算混合病毒感染的比例。国内肠道病毒流行株的通用扩增方法扩增重组肠道病毒能够完整地揭示肠道病毒重组情况。结论:本研究建立了针对我国近年来肠道病毒流行株的通用全基因组扩增方法,在病毒培养液肠道病毒的提取与扩增中显示了较高的灵敏度,能够反映混合病毒感染、重组病毒的真实情况。该扩增方法将为今后肠道病毒的全序列扩增及毒力研究等提供高效、准确、便捷的解决方案。
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