关键词：
肠道病毒
手足口病
RNAi抗病毒免疫
解旋酶
多肽药物
摘要：
天然免疫是宿主细胞抵御病毒感染的首道防线。RNAi（RNA干扰）是一种普遍存在于真核生物中的基因转录后沉默机制。RNAi介导一种保守的抗病毒免疫反应,其在植物、昆虫和哺乳动物中均发挥重要的抗病毒作用。另一方面,病毒往往编码RNAi抑制因子（VSR）来抵御RNAi免疫。
肠道病毒71型（EV-A71）是肠道病毒A族中的一种,也是导致手足口病（hand-foot-mouth disease,HFMD）的主要病原。EV-A71是一种正义单链RNA病毒。其非结构蛋白3A具有VSR活性,能在细胞与小鼠体内抵御宿主RNAi抗病毒免疫,促进病毒感染。据此,本论文开展了靶向3A的VSR功能的抗病毒药物研发工作。我们以3A蛋白的α螺旋区域为模板设计了多肽药物,旨在通过破坏3A蛋白的二聚化,从而破坏其VSR功能,释放RNAi抗病毒免疫活性。我们设计、合成、筛选了一系列靶向3A的多肽,并检测了它们的抗病毒活性,最终确定一种经优化改造后的多肽（ER-DRI）具有高效的抗病毒活性并兼顾安全性,其IC50可以达到0.45μM,CC50高达206μM。我们的研究证明ER-DRI通过破坏3A的VSR功能起到抗病毒作用,且经ER-DRI处理的细胞能够检测到大量vsi RNA,并加载到RISC复合物中,最终导致病毒靶标RNA的降解。在Dicer和AGO2缺失的293T细胞中,ER-DRI的抗病毒效果显著减弱,进一步证明了ER-DRI的抗病毒效果基于RNAi通路。另外,在小鼠原代细胞中,我们也检测到ER-DRI良好的抗病毒效果以及大量vsi RNA的产生,进一步证明ER-DRI的药效依赖于RNAi通路。之后我们对于另一种能引起手足口病的病毒CV-A16进行药效检测,发现无论是对CV-A16的不同临床株,还是在不同种类的细胞中,ER-DRI均具有很好的抗病毒效果,并在Dicer缺失时药效明显减弱。综上所述,对于EV-A71和CV-A16,多肽药物均是通过RNAi免疫通路起到的抗病毒作用,因此,该多肽具有成为广谱性对抗手足口病药物的潜力。并且该多肽是第一个以病毒VSR为靶标设计的药物,为抗病毒药物研发和临床治疗提供了一个新的思路。
解旋酶是一类核酸重塑蛋白,具有ATP酶活性,可以通过利用ATP释放的能量结合并解开DNA或RNA双链。肠道病毒非结构蛋白2C是一种保守的解旋酶。基于解旋酶在病毒复制中的重要性以及2C的保守性,解旋酶常被作为药物设计的靶点。据此,本论文开展了靶向2C解旋酶活性的抗病毒药物研究工作。通过对2C蛋白进行结构分析,我们发现在2C蛋白的羧基末端区域包含一段长且突出的α螺旋,能够通过插入到另一个2C单体中由ATP酶区域和锌指结构域组成的孔洞结构,从而形成稳定的寡聚体并行使解旋酶的功能。基于2C羧基末端突出的α螺旋结构及序列,我们设计了多肽药物2CL,旨在通过与α螺旋竞争结合另一2C单体的孔洞结构,从而破坏2C的寡聚化结构,抑制解旋酶的功能。首先,我们通过凝胶阻滞层析和体外解旋实验证明了2CL能够使2C的寡聚化受到破坏,并影响它的解旋功能。其次,我们在多种细胞系中检测到了2CL的抗病毒效果,并证明2CL能够有效抑制EV-A71和同族CV-A16的临床株。值得一提的是,2CL对于EV-A71感染的小鼠也有很好的拯救效果,这些研究为2CL后续的临床试验奠定了基础。进一步的,为了检测以2C为靶标的多肽药物设计模式对B族肠道病毒是否同样有效,我们将2CL改造成B-2CL,并检测到了B-2CL对CVB3和Echo 11的抗病毒效果。更重要的是,2CL对B族肠道病毒同样具有良好的抗病毒效果,说明以2C解旋酶活性为靶标有望开发广谱的抗肠道病毒药物。
本论文针对在肠道病毒复制及与宿主相互作用中发挥关键作用的病毒非结构蛋白,设计开发出具有较好细胞与体内水平抗病毒效果的多肽药物,具有重要的科学与应用价值。
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