关键词:
肠道病毒71型
IgM抗体
金棒
纳米酶
金核铂壳纳米材料
石墨烯量子点
比率荧光
摘要:
手足口病是一种由多种人类肠道病毒感染引起的传染性疾病,多发于5岁以下儿童。其主要特征是发热和手、足、口腔等部位出现皮肤粘膜皮疹、疱疹和溃疡等病症。该病于1957年首次在新西兰报道,随后在全球范围内传播流行,现已成为全球性的公共卫生问题。相比其它肠道病毒,肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)更易引起中枢神经系统症状,是引发手足口病重症病例的主要病原体,对患者的危害性更大。对于手足口病患者,尽早鉴别出是否为EV71感染,对该病的早期诊治具有重要意义。EV71感染人体后,机体的免疫应答首先产生IgM抗体,血液中其含量快速升高。因此,IgM抗体是一种常用的早期诊断指标。目前临床上使用的检测方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)和胶体金试纸条,但存在显色信号单一和灵敏度不足的缺点。纳米材料被广泛应用于分析检测领域,促进了检测技术的发展。本研究分别采用金棒(AuNRs)、金核铂壳纳米材料(Au@Pt NPs)和石墨烯量子点(GQDs),从裸眼判定结果和提高检测灵敏度等方面建立新型免疫学检测方法,为满足EV71 IgM抗体的检测需求提供新的解决办法。主要研究内容如下:***71 IgM抗体的间接ELISA和捕获ELISA检测方法的建立。EV71阳性样品的敏感性试验、临床样品检测结果表明,间接ELISA优于捕获ELISA。因此,选择在间接ELISA的基础上,构建基于纳米材料的EV71 IgM抗体新型检测方法。2.基于TMB2+蚀刻AuNRs的EV71 IgM抗体多色检测方法的建立。采用种子生长法制备纵向吸收峰在730 nm的AuNRs。利用TMB2+蚀刻AuNRs时,出现鲜艳的颜色变化和纵向吸收峰的移动,建立基于裸眼比色和光谱扫描两种结果判定方式。敏感性试验中,EV71阳性样品在稀释200~3200倍时仍可以检出。临床样品检测结果表明,该方法的敏感性为100.00%,特异性为91.06%,符合率为92.57%。该方法与间接ELISA相比,裸眼比色的结果判定方式不需要仪器辅助,能够满足在资源有限地区或场景对EV71感染的快速分析和检测应用。3.基于Au@Pt NPs类过氧化物酶活性的EV71 IgM抗体比色检测方法的建立。制备四种不同铂厚度的Au@Pt NPs,并筛选出催化能力最佳的Au@Pt NPs制备探针,用于构建检测方法。敏感性试验中,EV71阳性样品在稀释200~6400倍时仍可以检出。临床样品检测结果表明,该方法的敏感性为96.00%,特异性为92.68%,符合率为93.24%。该方法与间接ELISA相比,采用纳米酶Au@Pt NPs代替天然酶HRP,检测成本降低,检测性能更优,具有代替现有ELISA检测方法的潜力。4.基于Au@Pt NPs和GQDs的EV71 IgM抗体比率荧光检测方法的建立。Au@Pt NPs探针能够催化邻苯二胺(OPD)生成氧化态OPD,后者猝灭GODs在410 nm的发射光,并在580 nm出现新的发射光。采用580 nm和410 nm的荧光比值作为信号,建立比率荧光检测方法。敏感性试验中,EV71阳性样品在稀释200~12800倍时仍可以检出。临床样品检测结果表明,该方法的敏感性为96.00%,特异性为90.24%,符合率为91.22%。该方法与间接ELISA相比,结合纳米酶和比率荧光检测模式的优势,具有检测灵敏度更高和结果稳定等优点,能够满足EV71感染早期诊断的需求。综上所述,EV71 IgM抗体是临床上确诊EV71感染的早期诊断指标。本研究首先建立了EV71 IgM抗体的间接ELISA和捕获ELISA检测方法。通过比较检测性能,选择在间接ELISA基础上,构建三种基于纳米材料的EV71 IgM抗体新型检测方法。这三种新型检测方法可以满足EV71 IgM抗体的多种检测需求,能够应用于手足口病EV71型的早期诊断,也为其它疾病的免疫学检测方法研究提供了新思路。