关键词:
宫腔粘连
载雌二醇介孔硅水凝胶
细胞实验
动物实验
功能性
相容性
摘要:
目的:
本研究旨在将治疗宫腔粘连的屏障疗法与雌激素药物疗法相结合,研发一种新型材料制备成雌二醇宫内缓释系统。前阶段设计制备组织相容性好的水凝胶,并负载载雌二醇介孔硅,平稳缓释雌二醇。本阶段主要目的探究该新型雌二醇宫内缓释系统材料PHMH-Si水凝胶在体外细胞中及动物体内进行试验,以探究该新型材料是否具备良好的生物安全性和功能性,最终为临床治疗宫腔粘连(IUA)提出新的方法及参考依据。
材料和方法:
将我们的实验对象PHMH-Si水凝胶,与生物相容安全度高的PHEMA水凝胶作为对照材料进行对比实验。首先,采用高糖培养基与相同体积和重量的水凝胶共同浸泡72小时提取浸取液。用人脐静脉内皮细胞作为实验所需细胞。然后,将不同的浸取液与人脐静脉细胞混合,进行不同天数的培养,并使用细胞死活染色法和莱卡荧光显微镜观察细胞死亡情况,以评估材料与组织的相容性。在另外一组板上也用两种水凝胶浸取液与人脐静脉细胞共同培养1,3,5天,加入cck-8溶液10ul,置入培养箱中孵育1小时测450nm处吸光度,根据吸光度计算不同天数时细胞增殖率,计算实验材料对细胞的增殖率,判断细胞的生物安全性。
在功能性实验中,将我们的实验对象PHMH-Si水凝胶,与不含雌激素的PHMH水凝胶作为对比实验,在高糖培养基中浸泡,提取浸取液。原代人子宫内膜细胞及经过培养传代后,用子宫内膜细胞在96孔板上种板,再加入各组浸取液培养不同天数,测量450nm处OD值,计算细胞增殖率,判断材料促子宫内膜生长的功能性。同时加做细胞染色死活实验判断PHMH-Si水凝胶的生物安全性。
为了进一步研究该水凝胶在活体动物体内对子宫内膜的促生长作用以及治疗宫腔粘连的效果,我们设计了SD大鼠动物实验。将大鼠分为A,B,C三组,每组大鼠四只,A组为假手术组(仅作开关腹),B组为造模组(手术行人工造成子宫粘连模型),C组为实验组(大鼠造宫腔粘连模型后置入PHMH-Si水凝胶)。三组实验大鼠完成手术后,继续饲养大鼠13.5天后处死并取出子宫。接下来,我们将对子宫进行病理学检查,制作出组织切片。为了确定水凝胶的有效性,我们采用HE染色和MASSON染色技术,并对切片的结果进行详细的记录和分析。
统计方法:指标使用SPSS25.0软件进行统计分析。计量资料均值±标准差表示,先进行描述统计分析检验数据的正态性,再用Levene检验方差齐性,若方差齐性则进行单因素方差分析(ONE WAY AVOVA),并采用LSD(总体均数有差异,P<0.05)或Scheffe(总体均数无差异,P>0.05)进行组间两两多重比较;若方差不齐采用Welch稳健方差分析,并采用Dunnett’s T3进行组间两两多重比较。P<0.05被认为具有统计学意义。
结果:
1.通过将两种水凝胶浸取液在人脐静脉内皮细胞中培养1、3和5天后的死、活细胞染色的代表性荧光图像,可知PHEMA以及PHMH-Si水凝胶的细胞增殖和扩散良好,5d的时候会观察到少许死亡细胞,与空白组对比无明显差别。根据细胞增殖率的测定,其中PHEMA水凝胶5d后的细胞增殖率与空白对照组比较计算出增殖率为113.37%,而另一组计算吸光度得出PHMH-Si水凝胶5d后的细胞增殖率为96.66%。PHMH-Si水凝胶的细胞增殖率与PHEMA水凝胶无显著差异。因此证明了,PHMH-Si水凝胶在体外细胞毒性实验中对实验细胞低毒性。
2.细胞功能性实验中人子宫内膜细胞与PHMH-Si水凝胶提取物共培养5d后,细胞存活率为对照组的117.37%。该实验结论证实了我们设计的载雌二醇水凝胶系统可以促进子宫内膜的生长。该组的细胞死活染色也可观察到第5天各组红色死细胞无明显差异,证明实验材料PHMH-Si水凝胶在子宫内膜细胞中也有很好的生物安全性,不会造成细胞死亡增加。
3.大鼠实验结果显示,假手术组的子宫内膜厚度明显高于造模组(P<0.01),而置入载雌二醇介孔硅水凝胶的实验组子宫内膜厚度虽然薄于假手术组,但明显高于造模组(P<0.05)。在子宫内膜腺体计数比较方面,假手术组腺体数目最多,造模组最少,实验组略少于假手术组,但明显多于造模组(P<0.05)。三组大鼠单位面积纤维化比较表明,宫腔内置入载雌二醇介孔硅水凝胶能显著抑制子宫内膜纤维化。PHMH-Si组的纤维化面积百分比小于IUAs组造模组,差异有统计学意义(P<0.05)。
结论:
经过本阶段研究中,我们发现雌二醇介孔硅水凝胶PHMH-Si对脐静脉内皮细胞的较好生物安全性和对促子宫内膜生长有一定功能性;动物实验中也对大鼠宫腔粘连有一定的治疗作。初步表明了我们的新型雌二醇宫内缓释系统材料有良好的生物安全性和功能性。