关键词:
宫腔粘连
微小RNA
miR-664b-3p
MAP3K7
摘要:
目的:
通过对宫腔粘连组织和对应的正常内膜组织行miRNA芯片分析,筛选差异表达微小RNA(micro RNA,miRNA),并探索微小RNA 664b-3p在宫腔粘连中的作用并分析其具体分子机制。
方法:
(1)选取3对宫腔粘连组织和对应的正常内膜组织,通过miRNA芯片筛选差异表达miRNA。
(2)通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)验证该miRNA的表达情况,通过生物信息学方法(通过miRDB、miRWalk、miRTarbase、RNACentral预测)预测该miRNA的靶基因。
(3)使用双荧光素酶报告基因实验验证该miRNA是否与靶基因结合。
(4)培养人子宫内膜上皮细胞(endometrial epithelial cells,EECs),通过PCR、蛋白印迹(Western blot)、免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)法从细胞学层面进一步证实miRNA的功能、miRNA及其靶基因的表达以及其在宫腔粘连中的作用。
结果:
(1)miR-664b-3p在宫腔粘连组织、TGF-β1刺激后的子宫内膜上皮细胞中的表达较对应的正常内膜组织和子宫内膜上皮细胞显著降低。
(2)通过PCR、Western blot、ICC/免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)法证实宫腔粘连组织、TGF-β1刺激后的子宫内膜上皮细胞中上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)和角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)表达明显降低,而间质标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和成纤维细胞特异蛋白1(fibroblast specific protein 1,FSP-1)表达显著升高。
(3)在EECs中转染miR-664b-3p的激动剂后,通过PCR、Western blot、ICC法证实上皮标志物E-cadherin和CK18表达明显升高,而间质标志物α-SMA和FSP-1表达显著下降。在EECs中转染miR-664b-3p的抑制剂后,通过PCR、Western blot、ICC法证实上皮标志物E-cadherin和CK18表达明显下降,而间质标志物α-SMA和FSP-1表达显著上升。
(4)生物信息学预测结果表明,MAP3K7可能是miR-664b-3p的靶基因。通过双荧光素酶报告基因试验证实了MAP3K7确实是miR-664b-3p的靶基因。
(5)通过PCR、Western blot、IHC法证实MAP3K7在宫腔粘连组织中表达明显高于对应的正常内膜组织。细胞学实验表明,转染MAP3K7过表达质粒可使上皮标志物E-cadherin和CK18表达明显下降,而间质标志物α-SMA和FSP-1表达显著上升。而转染MAP3K7的小干扰RNA(siRNA)则使上皮标志物E-cadherin和CK18表达明显上升,而间质标志物α-SMA和FSP-1表达显著下降。
结论:
(1)宫腔粘连过程中存在上皮-间质转化。miR-664b-3p可以抑制上皮-间质转化,抑制宫腔粘连。
(2)MAP3K7是miR-664b-3p的靶基因。MAP3K7可促进宫腔粘连的发生。
(3)miR-664b-3p可通过靶向调控MAP3K7抑制宫腔粘连的发生。