关键词： 诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞   美洲大蠊提取物   宫腔粘连   铁死亡  

摘要： 研究背景: 宫腔粘连(Intrauterine adhesion,IUA)会导致流产和不孕,子宫内膜损伤是IUA的起始阶段,诱导多能性干细胞来源的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells derived from induced pluripotent stem cells,iMSCs)在IUA的治疗中有抗纤维化和促进子宫内膜再生的潜力。然而,由于移植后细胞活性低和停留时间短,导致iMSCs在粘连宫腔发挥的临床效果受到限制。临床上中药美洲大蠊提取物(Periplaneta americana extractions,PAEs)能提升细胞活力,抗纤维化作用明显,提高组织的愈合能力。本研究观察PAEs对iMSCs的作用效果,研究其是否可以增加iMSCs活力,以提高iMSCs治疗IUA的效果。 研究目的: 通过PAEs干预iMSCs,探索PAEs是否可以提升iMSCs的细胞活力,从而提高iMSCs对IUA的疗效,并探索其中的机制。 研究方法: 1、研究第一部分:通过血清剥夺(模拟干细胞在生物体内移植的培养条件)培养iMSCs观察,CCK8实验观察细胞增殖生长状况,通过凋亡细胞试剂盒检测细胞凋亡情况及DCFH-DA探针检测细胞内的活性氧(ROS)水平,细胞培养基内加入PAEs,摸索PAEs作用iMSCs的最佳浓度,干预后重新检测增殖及凋亡情况,同时通过MDA试剂盒检测细胞内的脂质氧化程度。 2、研究第二部分:观察PAEs处理与否的iMSCs在生物体内的存活时间及两组iMSCs对IUA小鼠模型的抗纤维化效果。动物活体成像实验检测iMSCs在IUA小鼠模型体内的存留时间。并在IUA小鼠模型上观察PAEs处理前后的iMSCs分别的治疗效果,模型小鼠设置正常组、模型组、血清剥夺培养iMSCs组、PAEs处理iMSCs组。HE染色检测小鼠子宫内膜的形态和结构;Masson染色及免疫组化检测模型动物子宫内膜纤维化的改变,最后合笼实验检测治疗后模型动物的生育能力。 3、研究第三部分:探索PAEs提升iMSCs生物学功能的机制,转录组学测序技术分析PAEs处理与否iMSCs的基因差异,RT-q PCR和Western blot筛选验证iMSCs中铁死亡差异表达的m RNAs和FTH1、FTL蛋白。免疫荧光及Western blot法检测GPX4表达量来验证iMSCs铁死亡情况,C11 BODIPY 581/591荧光探针检测iMSCs的脂质过氧化程度,斑点杂交实验检测m5C甲基化水平,免疫荧光分析m5C表达水平,免疫荧光和Western blot来检测m5C的甲基化酶NSUN5的表达情况。 研究结果: 1、研究第一部分:对多能性诱导干细胞来源的iMSCs进行培养鉴定,通过血清剥夺培养模式来模拟iMSCs在生物体内的生存环境,在血清剥夺的情况下,iMSCs细胞增殖明显受限,iMSCs凋亡水平升高,细胞内的活性氧(ROS)水平上升。加入PAEs后,iMSCs的增殖能力增加,细胞凋亡情况及细胞内的活性氧水平降低,同时,PAEs也降低了iMSCs细胞的MDA水平,降低其脂质氧化程度。 2、研究第二部分:动物体外成像实验观察到PAEs处理的iMSCs在小鼠体内的存留时间更长。在IUA小鼠模型上观察到PAEs处理的iMSCs治疗IUA小鼠子宫内膜的厚度和腺体数量与正常对照组无差异;Masson染色及免疫组化检测发现模型小鼠子宫内膜纤维化降低;最后合笼实验观测iMSCs治疗IUA小鼠胚胎数量明显增加。 3、研究第三部分:转录组学测序技术分析PAEs处理与否iMSCs的基因差异,提示PAEs参与了iMSCs在血清剥夺条件下的铁死亡通路。免疫荧光及Western blot法提示PAEs显著提高了iMSCs铁死亡标志性蛋白GPX4的表达量,C11 BODIPY 581/591荧光探针检测提示PAEs显著降低iMSCs的脂质过氧化程度。RT-q PCR验证了PAEs能够提高iMSCs铁死亡机制相关的FTH1及FTL基因及蛋白表达水平。斑点杂交及免疫荧光实验检测到iMSCs细胞的m5C甲基化水平在PAEs处理后增高,且相应的m5C甲基化酶NSUN5表达也升高。 结论: PAEs能够提升iMSCs在血清剥夺培养条件下的细胞活性,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡及过氧化;PAEs干预的iMSCs在IUA小鼠体内存活时间延长,治疗效果更佳;PAEs通过激活m5C甲基化及m5C的甲基化酶NSUN5来调节iMSCs的铁死亡通路相关因子的表达水平,降低iMSCs的铁死亡水平。

关键词： 宫腔粘连   间充质干细胞   外泌体   miRNAs   TGF-β  

摘要： 背景及目的:宫腔粘连(Intrauterine adhesion,IUA)是严重危害女性生育和身心健康的常见疾病。临床上常规的治疗手段效果并不理想,术后复发率仍然很高。因此亟需开发新的预防、逆转和修复子宫损伤的治疗策略。近年来研究发现间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)及其分泌的外泌体(Exosomes,Exos)在IUA的治疗中有较好的作用。但它们改善受损子宫内膜的分子机制并不明确,这也是间充质干细胞外泌体(Mesenchymal stem cells derived exosomes,MSC-Exos)目前还没有应用到临床治疗的原因之一,因此探究MSC-Exos详细的作用机制显得尤为重要。本研究旨在验证MSC-Exos对IUA的治疗作用,并且探究MSC-Exos在IUA治疗中的分子机制,为研究开发针对宫腔粘连新的治疗方法提供理论基础。 方法:***-Exos的提纯和鉴定:首先通过超速离心法从胎盘间充质干细胞(Placental mesenchymal stem cells,PMSCs)中提取 Exos 并对其进行鉴定。2.治疗作用和安全性评价:用TGF-β1诱导构建IUA细胞模型,电凝法构建大鼠IUA模型。分别通过构建好的体外和体内模型确定Exos的治疗效果,并且评估Exos治疗的安全性。3.分子机制研究:通过miRNA微阵列法和qRT-PCR法筛选特异性miRNAs。随后利用KEGG/GO富集分析、GEO数据库和Targetscan数据库等进行生物信息学分析,并且构建了蛋白互作网络图和miRNA-mRNA网络图。最后通过双荧光素酶报告基因实验、蛋白质印迹法(Western Blot,WB)和qRT-PCR等实验方法验证特异性miRNAs对TGF-β/smad通路的调控作用。 结果:1.动物研究表明:胎盘间充质干细胞来源的外泌体(PMSC-Exos)可以增加子宫内膜厚度、促进腺体增生和细胞增殖、减轻纤维化,并且恢复大鼠受损子宫的生育能力。此外,大鼠外周血生化和血常规检测证实宫内PMSC-Exos药物治疗是安全的。2.体外研究表明:PMSC-Exos可以促进子宫内膜细胞的增殖和迁移,抑制纤维化。3.特异性miRNAs的发现:筛选出了三个特异性miRNAs,它们在PMSC-Exos中含量较高且有抗纤维化的作用,被认为是PMSC-Exos治疗IUA 的关键。其中 miR-125b-5p/miR-30c-5p 和 miR-23a-3p 分别通过靶向 smad2和smad3的3'-UTR区抑制其表达,从而调节TGF-β/smad通路,发挥抗纤维化作用。 结论:综上所述,我们的研究表明PMSC-Exos可以有效的改善IUA,并通过传递miR-125b-5p,miR30c-5p和miR-23a-3p发挥抗纤维化和促进细胞增殖迁移的作用,为IUA的精准治疗和MSC-Exos的无细胞治疗提供了新思路。

关键词： 宫腔粘连   妊娠率   复发率   影响因素   列线图  

摘要： 背景:宫腔粘连(intrauterine adhesions,IUA)是指子宫内膜基底层损伤,子宫壁相互粘连,可使宫腔、宫颈管部分或全部闭塞的疾病。IUA的标准术式是宫腔镜宫腔粘连分离术(transcervical resection of adhesion,TCRA),尽管术后辅助治疗多样,但整体治疗效果不甚满意,表现出术后妊娠率低、复发率高的特点,给患者带来严重心理负担。目前针对TCRA术后妊娠和复发影响因素的研究结论尚不统一,且相关影响因素的评估无法直接指导临床诊疗,需要更为直观、可靠、个体化的评价方法来解决这一临床问题。 目的:观察TCRA术后妊娠与复发的情况,分别对TCRA术后影响妊娠、复发的各种因素进行分析,找到独立危险因素,建立列线图预测模型,为TCRA术后的个体化治疗提供依据。 方法:回顾性分析2018年01月～2022年6月在十堰市太和医院进行TCRA治疗的218例IUA患者的临床资料。收集术前、术中影响TCRA术后妊娠率、复发率的因素,通过SPSS及R语言统计学分析,建立临床预测模型。 结果:***、AFS、ESGE评分对妊娠有预测价值,AUC分别为0.550、0.605、0.585。Nasr评分在复发率上的差异不显著,March、AFS、valle、CSGE、ESGE评分对复发有预测价值,AUC分别为0.561、0.561、0.542、0.556、0.596。 ***术后总妊娠率48.17%(105/218),活产率31.19%(68/218),足月产率29.82%(65/218),早产率1.38%(3/218)。轻度、中度、重度粘连术后妊娠率分别为73.68%、50%、20.7%。不同粘连程度在不同时间段内的妊娠率具有统计学意义(P<0.05),术后7～12月妊娠率高于术后6月、1～2年内、2年后的妊娠率。 3.术后不良妊娠结局以稽留流产为主,胎盘异常率6.88%,胎盘异常组与胎盘正常组在不同粘连程度之间的分布无显著差异。单因素分析中有意义的指标有年龄、分娩次数、清宫原因、术前输卵管开口情况、其他宫腔操作、术后月经情况、术后输卵管开口情况。其中年龄、术后输卵管开口情况、术后月经恢复情况、其他宫腔操作史是术后妊娠率的独立危险因素,AUC分别为0.566、0.632、0.572、0.655。 4.术后总体复发率为49.54%(108/218),轻度粘连的复发率为36.84%,(7/19),中度粘连的复发率为47.06%(80/170),重度粘连的复发率为72.41%(21/29)。在术后3月内复发率高于术后4～6月及7～12月,不同粘连程度在不同时间段的复发率无统计学意义。单因素分析中有意义的指标有术前病程、月经情况(术前术后)、输卵管开口(术前术后)、宫角(术前术后)、粘连范围、粘连部位、子宫内膜厚度(术前术后)、电切次数。其中病程、术后输卵管开口情况、术后子宫内膜厚度是复发的独立危险因素,AUC分别为0.603、0.636、0.611、0.584。 5.将妊娠独立危险因素构建列线图预测模型,AUC为0.751(95%CI:0.687-0.815),约登指数0.414,其对应的灵敏度为0.724,特异度为0.690,准确度为0.706,截断值0.508。C-index为0.744(95%CI:0.678-0.807),模型拟合优度检验p=0.909,提示模型拟合较好。在15%-72%,74%-84%的风险阈值概率范围内,临床上是获益的。 6.将复发独立危险因素建立列线图,AUC为0.744(95%CI:0.680-0.809),提示模型预测效能较好,约登指数0.366,其对应的灵敏度为0.639,特异度为0.727,准确度为0.683,截断值0.515。C-index为0.751(95%CI:0.685-0.811),模型拟合优度检验p=0.804,提示模型拟合良好。在25%-89%的风险阈值概率范围内,临床上是获益的。 结论:***术后患者的妊娠率较低,在术后7～12月可能是妊娠的最佳时期,术后妊娠不良结局多见于稽留流产。 ***术后患者的复发率较高,术后3月内早期行宫腔镜检查可能会降低复发率,改善远期复发的严重程度。 3.年龄大于35岁、术后月经恢复较差、术前病程>1年、术后输卵管开口越少、多次行TCRA及其他宫腔操作的患者应为高危患者,可增加术后措施及随访提高妊娠率、减少复发率。 4.妊娠、复发预测模型具有较好的预测效能和临床价值,优于目前常用评分标准,可为患者的个体化治疗提供指导。

关键词： 宫腔粘连   纤维化   嵌合抗原受体T细胞   成纤维细胞活化蛋白   外泌体  

摘要： 一、研究目的 宫腔粘连（intrauterine adhesion,IUA）是一种以子宫内膜纤维化为主要病理特征的生殖系统疾病。临床上,宫腔操作可导致子宫内膜基底层受损,上皮细胞再生受阻,而纤维结缔组织增生,子宫腔或子宫颈因纤维粘连而部分或完全关闭,严重影响患者的生殖健康。目前,IUA手术治疗只能从物理层面消除粘连,复发率较高。为实现子宫内膜的功能性恢复,还需要探索IUA治疗新方法。在前期工作中,课题组利用自主构建的工程化免疫细胞组库在IUA小鼠模型体内进行筛选,确定成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activated protein,FAP）为潜在治疗靶点,并制备了能够同时以高亲和力结合人鼠FAP抗原的单克隆抗体C21D5。FAP是活化成纤维细胞的特异性标志物,基于单克隆抗体C21D5的sc Fv序列,能够构建FAP靶向性的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）,在对T细胞进行工程化后,得到FAP靶向性CAR-T（FAP-CAR-T）细胞。FAP-CAR-T细胞能够直接识别和结合靶细胞表面的FAP,杀伤靶细胞。此外,课题组在2019年发现并报道,CAR-T细胞来源的外泌体同样携带特异性CAR,并具备亲本CAR-T细胞类似的生物靶向性和细胞杀伤活性,并且,相比于CAR-T细胞,CAR外泌体作用更加温和,不会引发炎性细胞因子的释放。因此,FAP-CAR-T细胞来源的外泌体可能对FAP阳性成纤维细胞有靶向杀伤作用,能够用于子宫内膜纤维化的治疗。 在本研究中,首先构建了FAP-CAR-T细胞,并对其体外靶细胞杀伤和体内抗纤维化作用进行了评估,然而,实验结果表明,FAP-CAR-T细胞治疗会引发小鼠体内细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome,CRS）,导致小鼠死亡。接着,制备了FAP-CAR-T细胞来源的外泌体（FAP-CAR-Exos）,探究FAP-CAR-Exos在体外对FAP阳性NIH 3T3成纤维细胞的杀伤活性,以及在IUA小鼠模型中对子宫内膜纤维化的治疗作用,为基于CAR的免疫靶向疗法在IUA及其他纤维化疾病中的治疗研究提供新的依据。 二、研究方法 ***-CAR-T细胞构建 基于C21D5单克隆抗体sc Fv序列,设计FAP-CAR基因序列,插入p MP71-EGFP逆转录病毒载体,构建FAP-CAR-p MP71-EGFP重组质粒;利用HEK 293T细胞进行逆转录病毒的包装,并浓缩病毒;利用免疫磁珠法分选小鼠脾脏CD4+T和CD8+T细胞,并调整细胞比例为1:1;利用逆转录病毒感染T细胞,制备FAP-CAR-T稳转细胞株。 ***-CAR-T细胞对靶细胞的体外杀伤、对IUA小鼠的体内治疗作用研究 10 ng/m L TGF-β1刺激NIH 3T3成纤维细胞,将FAP-CAR-T细胞与FAP阳性NIH 3T3成纤维细胞共孵育;检测T细胞活化分子CD25、CD69的表达;Cr51释放法检测梯度效靶比下FAP-CAR-T细胞对FAP阳性NIH 3T3成纤维细胞的体外杀伤。 机械损伤法构建IUA小鼠模型,经尾静脉注射FAP-CAR-T细胞,剂量为1×10～6个/只;记录48 h内小鼠体重变化和生存率;获取小鼠外周血,ELISA检测IL-2、IL- 6水平;获取小鼠子宫组织,利用HE和Masson染色观察宫腔粘连和子宫内膜纤维化情况;流式细胞术检测子宫内膜组织FAP阳性细胞数量;利用IL-6抗体治疗CRS,经尾静脉同时注射FAP-CAR-T细胞和IL-6抗体,剂量分别为1×10～6个/只和10 mg/kg;记录48 h内小鼠体重变化和生存率;获取小鼠子宫组织,利用HE和Masson染色观察宫腔粘连和子宫内膜纤维化情况;流式细胞术检测小鼠子宫内膜组织FAP阳性细胞数量和外周血FAP-CAR-T细胞数量。 ***-CAR-Exos制备和鉴定 扩大培养FAP-CAR-T细胞,采用超速离心法从培养上清中富集制备FAP-CAR-Exos;在透射电子显微镜下观察外泌体形态;利用纳米颗粒跟踪分析技术检测外泌体粒径大小和颗粒浓度;采用western blot鉴定外泌体标志物及FAP-CAR表达情况;利用竞争法ELISA鉴定FAP-CAR-Exos对FAP的靶向结合活性。 ***-CAR-Exos对靶细胞的体外杀伤、对IUA小鼠的体内治疗作用研究 Cr51释放法检测梯度外泌体总蛋白浓度下,FAP-CAR-Exos对FAP阳性NIH 3T3成纤维细胞的体外杀伤情况。 机械损伤法构建IUA小鼠模型,将小鼠分为四组,高剂量治疗组于IUA造模后第7天开始,高剂量预防组于IUA造模当天开始,分别每间隔一天经尾静脉注射150mg/kg FA

关键词： GNMT   IUA   纤维化   TGF-β1/Smad3  

摘要： 目的:研究甘氨酸N-甲基转移酶(Glycine N-methyltransferase,GNMT)对宫腔粘连(Intrauterine adhesion,IUA)纤维化的影响及其相关机制。 方法:体外实验:利用TGF-β1构建人子宫内膜间质细胞(transformed human endometrial stromal cells,THESCs)纤维化模型,使用TGF-β1处理稳定转染过表达GNMT慢病毒的THESCs,RT-q PCR检测TGF-β1诱导THESCs纤维化后各组细胞CollagenⅠ、CollagenⅢ、FN的m RNA水平;Western blot检测各组细胞CollagenⅠ、CollagenⅢ、FN、p-Smad3、Smad3蛋白水平;通过TGF-β1/Smad信号通路激活剂(SRI-011381)激活TGF-β1/Smad3信号通路,Western blot检测TGF-β1/Smad3信号通路及纤维化关键分子蛋白表达情况。体内实验:1.构建SD大鼠IUA模型,收集IUA组与假手术(Sham)组大鼠子宫组织进行转录组测序,利用RT-q PCR、Western blot、免疫荧光检测IUA组和Sham组大鼠子宫组织中GNMT的表达水平。2.利用腺相关病毒构建GNMT过表达SD大鼠IUA模型,通过RT-q PCR检测CollagenⅠ、CollagenⅢ、FN m RNA的表达情况,Western blot检测CollagenⅠ、CollagenⅢ、FN、TGF-β1、p-Smad3、Smad3蛋白水平;HE染色观察各组子宫内膜腺体数量;Masson染色分析各组子宫内膜纤维化面积。 结果:与对照组相比,IUA大鼠GNMT m RNA和蛋白表达水平下降。过表达GNMT可显著降低TGF-β1诱导的THESCs纤维化模型及IUA大鼠子宫组织CollagenⅠ、CollagenⅢ、FN m RNA及蛋白水平,并抑制TGF-β1/Smad3信号通路激活;此外,HE和Masson染色显示过表达GNMT可显著增加IUA大鼠子宫内膜腺体数量并减轻纤维化程度。 结论:过表达GNMT通过调控TGF-β1/Smad3信号通路抑制宫腔粘连纤维化,进而达到治疗IUA的作用。