关键词：
骨髓间充质干细胞
宫腔粘连
移植
雌激素
摘要：
研究背景 宫腔粘连（intrauterine adhesions, IUA）又称Asherman综合征,1894年由Fritsch最先描述,1948年Asherman首次详细报道,将其定义为：由于子宫内膜损伤导致子宫内膜纤维化,宫腔部分或全部闭塞,继而引起月经过少、闭经、不孕或反复流产。在继发性闭经患者中IUA发病率占5.1%,女性不孕症中IUA发病率占4.8%,而流产后刮宫的IUA发病率高达37.6%。近年来由于频繁的宫腔操作及宫腔镜手术的普及,IUA的发病率和检出率逐渐上升,而且发病年龄呈年轻化趋势,已成为女性继发不孕的第二大病因。尽管临床医生不断寻求新的治疗方案,IUA的治愈率和妊娠率仍无明显改善,且复发率较高（轻度IUA患者治疗后复发率为33.3%,重度IUA患者治疗后复发率更是高达66.7%）,由此引起的不孕以及反复流产、早产、前置胎盘、胎盘粘连或植入等产科并发症严重威胁着女性的生殖健康。 IUA的防治多年来一直困扰着临床医生,其高发病率及其所导致的女性生育功能损害已成为临床上亟待解决的问题。目前临床上针对IUA的治疗旨在恢复宫腔形态,防止粘连复发,促进损伤子宫内膜修复再生,恢复正常生育功能。治疗IUA的3个重要步骤是宫腔镜下宫腔粘连分离术、术中放置宫内节育器以及术后应用雌孕激素,但存在着治疗周期长、治愈率低下、粘连易复发、妊娠率低、大剂量雌激素应用增加患者乳腺和子宫内膜肿瘤风险等问题,而且严重的肌性或结缔组织性IUA中子宫内膜基底层已被破坏,对雌孕激素反应较差。 迄今为止,国内外学者对IUA的发病机制进行了大量研究,一致认为子宫内膜修复障碍可能是IUA形成的主要机制。如流产后刮宫或其它宫腔操作后,由于一些病理因素,使子宫内膜修复发生障碍,结果导致瘢痕形成、粘连发生。近年来,国内外学者相继用不同研究方法证实了子宫内膜干细胞的存在,为与子宫内膜增生或修复异常相关的各种妇科疾病发病机制提供了新见解,如：子宫内膜癌和子宫内膜异位症等,可能与子宫内膜干细胞的异常分化和增殖有关;而不明原因的子宫内膜薄和宫腔粘连可能与子宫内膜干细胞的减少或缺失有关。 骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）是一类具有多向分化潜能的成体干细胞,是目前组织工程中理想的干细胞来源。BMSCs因具有自我更新、多潜能分化、取材方便、能够自体移植避免免疫排斥和伦理问题等特点,已引起了广泛的关注,尤其是在修复损伤组织方面。移植BMSCs可用于治疗多种损伤性疾病,如心肌梗塞、扩张性心肌病造成的心肌损伤;修复急性肾损伤引起的内皮细胞和肾小管细胞,改善肾功能;亦可修复骨、软骨和肌腱缺损。但BMSCs在IUA所致的子宫内膜损伤中的治疗潜能未见相关报道,如果BMSCs能成功应用于IUA的治疗,修复损伤的子宫内膜,必将为IUA的治疗开辟新的领域。 因此,本研究在建立BMSCs体外分离、培养、扩增体系的基础上,对BMSCs进行荧光标记。检测BMSCs在体外一定培养条件下向子宫内膜上皮细胞和／或间质细胞分化的能力及其可能的机制。进一步建立新西兰大白兔宫腔粘连动物模型,将体外扩增的兔BMSCs,标记后直接注射至双侧子宫肌壁间,观察BMSCs在子宫组织的存活和迁移,观察移植后子宫内膜形态学的变化,检测子宫组织和子宫内膜腺上皮特异性标记物基因水平和蛋白表达的改变。初步研究骨髓间充质干细胞移植和雌激素治疗在修复子宫内膜损伤中可能的作用及机制,为探索新的宫腔粘连的治疗方向提供理论依据。 第一章新西兰大白兔骨髓间充质干细胞的体外分离、培养、鉴定及标记 目的： 建立幼年雌性新西兰大白兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离,培养方法,研究其生物学特性和表型特征;用荧光染料对BMSCs进行标记,并观察其对细胞形态,凋亡和增殖活性等生物学特征的影响。 方法： 1.在无菌条件下取出兔股骨和胫骨,采用全骨髓贴壁细胞分离法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基培养BMSCs。待细胞铺满瓶底的80%以上,按照1：2～1：3传代培养。 2.采用流式细胞仪检测细胞表面CD44、CD45和CD90的表达,进行鉴定。 3.采用PKH26对BMSCs进行荧光标记,检测即时标记率,通过Annexin-V法检测凋亡率、CCK-8法检测BMSCs的增殖能力,绘制生长曲线,以明确PKH26标记对体外培养BMSCs生物学特性的影响;通过流式细胞仪检测PKH26标记对兔BMSCs表面CD44、CD45和CD90表达的影响。 结果： 1.体外原代培养的BMSCs接种24h后部分贴壁,呈短小梭形或多角形;72h后
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