关键词:
宫腔粘连
脂肪间充质干细胞
再生医学
绿色荧光蛋白
子宫内膜容受性
摘要:
宫腔粘连(intrauterine adhesions,IUAs)是指在子宫内膜受到创伤后导致的子宫腔部分或全部消失。该病的发生主要是在子宫内膜(基底层)受到机械损伤、感染或子宫畸形矫治术后因严重内膜损伤而难以修复,引起宫腔粘连及部分或全部宫腔的消失。胎盘残留和重复人工流产后发生率近40%。尽管青少年的性开放程度在提高,但相对薄弱的避孕意识及避孕措施不到位使得年轻女性的非意愿妊娠率明显增加,加之无痛技术的推广和普及导致重复的宫腔操作也增多,继而加重内膜的损伤并使IUAs愈演愈烈,当然宫腔镜的广泛应用也使宫腔粘连的发现率明显提高。IUAs可引起月经异常、腹痛、不孕及辅助生殖时受精卵植入困难、反复流产等问题,它已成为严重影响生育年龄女性生殖预后及生活质量的顽症之一,目前尚缺乏行之有效的治疗方法。当前针对IUAs的治疗措施主要为宫腔镜下粘连分离,术后应用激素、放置节育器或其他支撑材料、置入生物胶等手段以防止粘连再形成,但重度IUAs治疗后再复发率仍高达20%60%。因此,急需探索新的方法以重建和修复IUAs患者的子宫内膜,降低复发率,改善患者妊娠结局及月经状况。生理状态下育龄女性的子宫内膜随着月经周期的变化不断发生增殖、分泌和脱落的循环。那么,正常子宫内膜为什么能够不断完成和重复无瘢痕再生呢?专家们提出了在子宫内膜基底层可能存在干/祖细胞的观点。Chan等首次在人子宫内膜基底层中分离并培养出了上皮细胞和间质细胞两类具有克隆能力的细胞,印证了子宫内膜中存在成体干细胞的假说。随后,也有学者从分别处于生育期、围绝经期和口服避孕药期间女性的子宫内膜中分离出极少量的上皮细胞和间质细胞的集落生成单位,进一步证实了子宫内膜存在干/祖细胞的理论。Taylor HS在骨髓移植受者体中发现了与供者HLA型别相符的由骨髓干细胞分化而来的子宫内膜细胞,证实了子宫内膜细胞可以由非子宫源性的干细胞分化而来,开启了再生医学修复子宫内膜损伤的新篇章。再生医学中关于子宫内膜损伤修复的细胞来源主要集中于骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞或月经血来源的子宫内膜干细胞,但这些干细胞来源数量少或存在伦理争议,或收集程序工艺繁琐,污染概率大,效率差,不能满足治疗需求。而同为成体干细胞的脂肪来源间充质干细胞,因其来源广泛,更易实现自体移植,以最大限度的减少伦理争议及免疫排斥,已成为子宫内膜修复与重建的优势干细胞来源。因此本研究选用自带标记的绿色荧光蛋白转基因大鼠来源的脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells from green fluorescent protein transgenic rat,GFP-ASCs)作为研究工具,检测GFP-ASCs的增殖及多向分化潜能,随细胞传代的变化检测绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达及衰减;并通过构建大鼠宫腔粘连模型,将体外培养的GFP-ASCs通过原位移植或复合小肠黏膜下基质(small intestinal submucosa,SIS)等方式移植,观察子宫内膜修复的病理形态学变化、容受性改善及GFP-ASCs对修复的影响。也初步探讨了TGF-β1/Smad3通路在宫腔粘连形成和GFP-ASCs修复内膜中的作用机制,期望为IUAs的治疗探索出新的方法和方向。第一部分大鼠GFP-ASCs分离、培养基及鉴定目的:分离、培养GFP-ASCs,检测表面标记物及多向分化潜能,评价GFP表达的稳定性。方法:1在无菌条件下,取绿色荧光转基因SD大鼠腹股沟脂肪,Ⅰ型胶原酶消化法分离GFP-ASCs,传代、纯化、培养。2流式细胞学检测第3代ASCs表面标记分子的表达情况,如CD29、CD44、CD90、CD105、CD45、CD34。并进行成脂、成骨诱导培养,茜素红及油红O染色鉴定诱导分化情况。3将不同代数的GFP-ASCs进行爬片培养,在融合度约为50%时,用4%多聚甲醛固定,DAPI染核后,荧光显微镜观察荧光标记情况。4利用MTT检测不同浓度和时长GFP-ASCs复合SIS培养的活性变化。结果:1原代培养的GFP-ASCs约24 h可贴壁,呈多角形或小梭形;72 h几乎全部贴壁,呈现长梭形,散在的细胞集落形成;7~9d后融合度达到90%左右,可进行传代,之后根据细胞融合度进行传代,第2代以后细胞形态趋于稳定,呈纤维细胞样漩涡状生长。2流式细胞学检测检测结果:CD29(+)、CD44(+)、CD90(+)、CD105(+)、CD34(±)及CD45(—),其表达率依次为99.99%、97.48%、99.91%、100%、58.05%、0.79%。3原代、第1、2、3代GFP-ASCs在荧光显微镜下可见细胞贴壁、生长状态良好,形态清晰,整个细胞呈绿色荧光,以细胞核最为明显,轮廓清楚,随