关键词:
宫腔粘连
丹参酮Ⅱ A
早孕蜕膜干细胞
TGF-β1/Smad3
miR-29a
摘要:
目的
宫腔粘连(Intrauterineadhesion,IUA)是由于妊娠或非妊娠子宫的创伤,导致子宫内膜基底层受损,使宫腔部分或全部闭塞从而导致月经异常、不孕或反复流产等。其本质是内膜纤维化。作为一种常见的妇科病,其发病率在我国居高不下,特别是近年来随着性意识的开放,许多妇女选择终止妊娠,由此导致宫腔粘连的发病率逐年上升。本研究通过机械搔刮法建立大鼠的宫腔粘连模型,同时对人体正常的蜕膜组织分离早孕蜕膜干细胞,通过分别给予丹参酮Ⅱ A、早孕蜕膜干细胞与两者的联合治疗,探寻丹参酮ⅡA联合早孕蜕膜干细胞对宫腔粘连的治疗作用,对改善宫腔纤维化及内膜容受性的影响。试图阐明丹参酮ⅡA联合干细胞可能通过影响miR-29a,进而影响TGF-β/Smad3通路,改善宫腔纤维化的作用,从而为中西医防治宫腔粘连提供理论及实验基础。
方法
通过伦理审查后,采集正常早孕蜕膜标本,使用胶原酶法分离早孕蜕膜间充质干细胞,并使用流式细胞实验检测干细胞CD73、CD90及CD105等表面标记物的表达。在体实验,选用成年雌性Speague-Dawley大鼠6只,其中模型组3只麻醉后采用机械搔刮法建立大鼠宫腔粘连模型,使用苏木精—伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)及Masson染色法验证造模是否成功。后利用机械搔刮法建立宫腔粘连大鼠模型。使用45只成年雌鼠分为5组,随机分为对照组、模型组、丹参酮ⅡA组、干细胞组及联合治疗组(丹参酮ⅡA+干细胞),在干预后3天、7天、14天分别采集血及子宫组织。使用酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),检测血清中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)及雌激素(Estrogen,E2)水平的变化;利用组织病理学检测不同处理及治疗后病理形态的变化;利用qRT-PCR技术检测子宫组织中miR-29a的变化;使用免疫印迹法(Western blot,WB)法检测组织中TGF-β1、Smad3及MMP-9蛋白的表达变化,明确丹参酮ⅡA和干细胞联合治疗宫腔粘连纤维化的治疗作用。
结果
成功在早孕蜕膜组织上提取出早孕蜕膜间充质干细胞,并通过流式细胞术检测其表面分子标记物CD73、CD90及CD105,证实其为早孕蜕膜干细胞;宫腔粘连大鼠模型可见HE染色模型组宫腔结构紊乱,内膜线不连续,腺泡数量减少及内膜厚度明显下降。此外,Masson染色可见大量蓝绿色纤维组织,证实大鼠宫腔粘连模型造模成功;使用丹参酮Ⅱ A、早孕蜕膜干细胞与联合治疗结束后HE染色可见各治疗组均较模型组有所恢复,其内膜腺体数量、内膜厚度均高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);此外,Masson染色结果显示,与模型组对比,各组的纤维化面积均较模型组减少,联合治疗组的纤维化面积最低,差异有统计学意义(P<0.05);另一方面,ELISA结果提示,各治疗组雌激素含量虽低于对照组,但优于模型组(P<0.05),而血清VEGF含量远低于模型组(P<0.05);使用qRT-PCR技术检测子宫组织miR-29a提示,与模型组和对照组比较,各治疗组miR-29a含量明显升高(P<0.05),且联合治疗组优于其他两组(P<0.05);WB结果提示各治疗组TGF-β1、Smad3及MMP-9蛋白表达均低于模型组,但较对照组仍偏高,差异有统计学意义(P<0.05)。联合治疗组对于TGF-β1、Smad3蛋白表达影响优于干细胞组和丹参酮ⅡA组,有明显统计学意义(P<0.05)。
结论
综上所述,miR-29a为一常见RNA小分子,其含量在正常状态下并不高,而在宫腔粘连病变时,由于TGF-β/Smad通路蛋白影响,其进一步下降,而在药物干预后,其明显升高,特别是联合治疗组,提示丹参酮ⅡA联合干细胞对于宫腔粘连的治疗作用,可能是通过提升miR-29a,影响TGF-β/Smad通路而起作用。总而言之,我们的研究揭示并证明了丹参酮ⅡA联合干细胞对于宫腔粘连纤维化大鼠具有治疗作用。文末,通过相应的网络药理学,提出了丹参酮可能参与的分子机制,为未来研究指明了一定的方向。