关键词:
IUA
NUS1
EMT
miR-466
AKT/NFκβ信号通路
摘要:
研究背景宫腔粘连(Intrauterine Adhesion,IUA)又称Asherman综合征,是指子宫内膜基底层损伤,导致子宫腔或宫颈管部分甚至全部闭塞。主要病因为子宫内膜创伤、宫腔感染等引起子宫内膜纤维化。近年来,IUA发病率高达2.2%-3.0%。宫腔镜下分离宫腔粘连是临床上治疗IUA的基本方案。然而,IUA的复发率仍高达3.1%-23.5%,已严重影响育龄妇女的生殖健康。所以,预防复发是治疗IUA的关键。因此,探索IUA的分子生物学机制,寻找有效抑制子宫内膜纤维化的方法,预防宫腔粘连的形成及复发迫在眉睫。子宫内膜上皮细胞逐渐转化为间质细胞(epithelial-mesenchymal transition,EMT),同时大量纤维沉积在内膜表面,子宫内膜功能层受损,最终导致宫腔粘连形成。因此,EMT在宫腔粘连的发生发展中至关重要。NUS1即神经轴突生长抑制因子 B 受体(neurite out-growth inhibitor-B receptor,NgBR),是神经轴突生长抑制因子B(neurite outgrowth inhibitor-B,Nogo-B)氨基端的特异性受体。已有研究证实,NUS1在多种疾病中异常表达,且在炎性细胞中也高表达。NUS1对不同疾病的作用机制各不相同,可以通过促进细胞上皮-间质转化、促进血管形成、促进脂代谢等途径发挥其生物学作用。其中研究较多的是NUS1可促进EMT的作用。但NUS1是否能影响宫腔粘连的发生发展,国内外尚无确切的报道。microRNA(miRNA)是一种单链非编码小分子RNA。某些miRNA的失调与特定的疾病形成、发展紧密相关,因此,非编码RNA可作为临床诊断的新型标志物或用于开发新型药物发挥其重要作用。miRNA广泛存在于组织和体液之中,近年来,有研究发现炎症和感染患者中存在miRNA的表达异常。越来越多的证据表明,多种miRNA的异常调节与宫腔粘连密切相关,如miR-29b、miR-1291等。已有研究表明,miR-466与骨肉瘤、直肠癌、宫腔粘连等多种疾病相关联。同时,基因数据库预测miR-466与NUS1两者之间有高度的靶向特异性。然而miR-466与NUS1在宫腔粘连中的作用及其机制尚不明确。IUA涉及多种信号通路,包括AMPKα、NFκβ、Notch/TGF-β1通路等。根据文献报道,NUS1可以通过多种信号通路来参与细胞EMT,其中,研究较多的是AKT/NFκβ信号通路。本论文从人体组织、细胞和动物三个方面,通过观察NUS1的差异表达、EMT、下游通路蛋白以及细胞生物学功能的变化,探究NUS1和miRNA-466在宫腔粘连中的分子生物学机理,以期为宫腔粘连的预防和治疗提供临床参考。第一部分NUS1在宫腔粘连中的表达和生物学功能研究目的:旨在研究NUS1在宫腔粘连患者及正常对照子宫内膜组织中的表达情况,以及探讨其可能的生物学功能。方法:采用HE染色和免疫组化法观察人宫腔粘连组织和正常子宫内膜组织形态以及NUS1蛋白染色,并采用RT-qPCR和Western blot方法分析NUS1 mRNA及其蛋白在两组宫腔组织中的表达情况;H8和Endl/E6E7细胞转染质粒成功后,采用MTT、克隆集落实验、流式细胞实验、tranwell小室法来评估不同NUS1质粒对细胞功能的影响,采用Western blot法观察EMT蛋白的表达变化。结果:***染色,镜下见IUA组子宫内膜结构不规则,成纤维细胞数量增加,子宫间质胶原纤维面积比率增加,且腺体数目减少;免疫组织化学染色,NUS1蛋白主要在细胞胞质中表达,且在宫腔粘连组织中染色强阳性;RT-qPCR、Western blot法检测,与正常子宫内膜组织比较,NUS1 mRNA及蛋白的表达均明显升高(p<0.05)。*** 2000法转染NUS1过表达、敲降及空白对照和载体质粒于H8和Endl/E6E7细胞。与对照组比较,NUS1过表达组细胞活性及增殖能力均显著增加,而敲降质粒组细胞功能明显减弱(p<0.05);流式细胞实验结果显示NUS1过表达组诱导促进细胞的G1期向S期转换,细胞凋亡率明显下降(p<0.05);而NUS1敲降质粒抑制细胞的G1期向S期转换,细胞凋亡率明显升高(p<0.05);与对照组比较,过表达NUS1质粒组细胞迁移能力明显增加,而敲降质粒组细胞迁移能力明显下降(p<0.05)。*** Blot方法检测EMT相关蛋白,过表达NUS1质粒作用于两种细胞后,上皮细胞相关蛋白E-cadherin蛋白明显降低,而间质相关蛋白Vimentin蛋白明显升高,敲降NUS1质粒则作用相反(p<0.05)。结论:***1在人宫腔粘连组织中异常高表达。***1可能参与人上皮细胞H8和