关键词:
地格达-4提取物
非酒精性脂肪肝病
入血成分
脂质代谢组学
拆方研究
摘要:
目的:本研究旨在阐明地格达-4(Digeda-4,DGD-4)提取物防治非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的药效物质基础和作用机制,以及揭示DGD-4中君药肋柱花对NAFLD主要病理特征起到的主导作用和其他三味药在该方中的辅助作用。
方法:
1.70%乙醇回流提取DGD-4,得到DGD-4乙醇提取物后通过UHPLC-QE-Orbitrap-MS对DGD-4提取物化学成分进行定性定量分析。根据检测到的化学成分含量,大于1%的化学成分作为DGD-4提取物主要化学成分,结合网络药理学初步预测DGD-4提取物治疗NAFLD的有效成分、核心靶点和通路。
2.通过泰洛沙泊(Tyloxapol,TY)诱导建立急性NAFLD小鼠模型,运用生化水平分析法、酶联免疫吸附法、肝脏组织病理学染色观察DGD-4提取物对NAFLD治疗作用,蛋白印迹法验证网络药理学预测的核心靶点和通路的准确性。
3.通过游离脂肪酸(Fee fatty acids,FFA)诱导建立L02脂质积蓄细胞模型,运用酶联免疫吸附法和油红O染色法观察DGD-4提取物对L02脂质积蓄细胞模型的改善作用,蛋白印迹法结合PI3K抑制剂LY294002从细胞层面验证网络药理学预测的核心靶点和通路。
4.建立高脂饮食喂养(High-fat diet,HFD)诱导的慢性NAFLD小鼠模型,采用生化水平分析法,酶联免疫吸附法和肝脏组织病理学染色观察DGD-4提取物对慢性NAFLD小鼠的影响,蛋白印迹法再次验证网络药理学预测的核心靶点和通路。
5.采用血清药物化学方法检测DGD-4提取物入血成分,以入血成分为基础分析DGD-4提取物入血成分治疗NAFLD的潜在靶点和通路。
6.基于DGD-4提取物入血成分网络药理学预测的结果和NAFLD自身特点进行肝脏脂质代谢组学和网络药理学联合分析,阐明DGD-4提取物治疗HFD诱导NAFLD小鼠肝脏脂质代谢紊乱的有效成分和分子机制,蛋白印迹法验证核心分子机制。
7.建立TY诱导建立急性NAFLD小鼠模型,采用拆方研究方法将DGD-4拆分为DGD-1(肋柱花)和DGD-3(去肋柱花),研究地格达-4味汤中君药肋柱花治疗NAFLD主要病理特征,如脂质代谢紊乱和肝损伤时发挥的主导作用,以及其他三味辅药在该方中的辅助作用。
结果:
1.从DGD-4提取物中发现了14个含量较高的化合物,认定为DGD-4提取物主要化学成分。通过网络药理学分析发现,DGD-4提取物主要化学成分治疗NAFLD的潜在靶点主要涉及PI3K-AKT信号通路、脂质与动脉粥样硬化通路和AKT1、PIK3R1、CASP3、BCL2、TNF和IL-6等核心靶点。
2.化学试剂所致动物实验研究表明,小鼠DGD-4提取物干预可有效降低TY诱导的NAFLD小鼠肝脏指数和血清ALT、AST、TC和TG水平;改善肝脏脂质积蓄;正向调节炎症因子(IL-6和TNF-α)和氧化应激酶(SOD和MDA);有效抑制细胞凋亡相关蛋白BAX和Caspase-3的表达以及BAX/BCL2比例,上调BCL2的表达;激活脂肪酸代谢相关酶p-AMPK,SIRT1,PGC-1α和PPARα蛋白表达;减少PI3K、AKT和m TOR蛋白磷酸化水平。
***-4提取物可显著减少FFA诱导脂质积蓄细胞模型TC、TG和脂质积蓄,抑制PI3K、AKT和m TOR蛋白磷酸化。通过使用PI3K抑制剂LY294002,发现DGD-4提取物对PI3K通路的抑制作用优于LY294002,且联合使用效果优于单一使用。
4.高脂饮食所致动物实验结果显示,DGD-4提取物显著降低HFD诱导NAFLD模型小鼠血清TC、TG、LDL、AST和ALT水平,提高血清HDL水平;此外,DGD-4提取物治疗不仅抑制了肝脏中的脂肪积累,还逆转了NAFLD模型小鼠体重增加、Lee`s指数、空腹血糖和脂肪组织重量的增加;DGD-4提取物能够有效抑制HFD诱导NAFLD小鼠肝脏p-PI3K、p-AKT和p-m TOR的表达。根据网络药理学及文献研究显示,DGD-4提取物防治NAFLD有效成分为胡黄连苷I、胡黄连苷II、京尼平苷、D-海藻糖、木犀草素、车前子甙、甜菜碱、羟甲香豆素、胆碱和L-苹果酸。
5.通过采用血清药物化学方法共鉴定出50个DGD-4提取物吸收入血的化学成分,包括10个原型化合物和40个代谢物。以吸收到血液中的50个化合物为候选化合物进行网络药理学分析,发现DGD-4提取物吸收入血成分主要通过脂质代谢相关通路治疗NAFLD。
6.肝脏脂质代谢组学分析显示,DGD-4提取物以甘油酯代谢、糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚生物合成、甘油磷脂代谢和鞘磷脂代谢为代谢途径,调节了HFD诱导NAFLD模型小鼠肝组织中DGs、