关键词：
转化生长因子β3
毕赤酵母
分泌表达
组成型
纯化
摘要：
目的:转化生长因子β3（transforming growth factor beta 1,TGF-β3）是TGF-β家族的一员,具有广泛的细胞生物学活性,如促进细胞生长、分化、迁移、凋亡、细胞外基质的产生和免疫。但与其它家族成员TGF-β1和TGF-β2不同的是,TGF-β3主要在胚胎发育期高表达,并在胚胎发育中发挥重要作用。肝、肺、心脏等主要脏器组织的纤维化在临床上严重威胁患者生命健康,体表创伤愈合过程过度瘢痕形成也严重影响颜面美观和正常功能发挥,并造成患者心理负担。TGF-β1可促进成纤维细胞向肌成纤维细转化、刺激胶原蛋白分泌,在组织纤维化和瘢痕形成中扮演重要角色,而TGF-β3则可促进创伤无瘢痕愈合,在临床和日常医学美容中具有重要应用价值。因此,建立绿色、廉价、且高效的制备工艺对于TGF-β3在临床应用开发具有很重要的意义。TGF-β的3个家族成员具有较高的结构相似性和序列同源性,成熟蛋白均为同源二聚体。TGF-β3前体共412个氨基酸,由23个氨基酸组成的信号肽、277个氨基酸的潜伏期相关肽（latency-associated peptide,LAP）和112个氨基酸的成熟肽等三个区段组成,其中,74、135、142、293位氨基酸为糖基化位点。成熟的TGF-β3蛋白结构为同源二聚体,由二个相同单体肽链通过一对链间二硫键连接组成。TGF-β3成熟肽单体有9个高度保守的半胱氨酸,其中8个半胱氨酸形成4对单体分子内二硫键,剩下的一个半胱氨酸形成连接另一个单体的单体间二硫键。由于TGF-β3结构复杂,通过基因工程手段实现高效制备TGF-β3蛋白存在较大困难。目前,TGF-β3蛋白均有在原核和真核中的表达系统中表达的相关研究,但原核宿主细胞因缺乏完善的翻译后加工机制,表达产物常以包涵体的形式存在。由于结构复杂,TGF-β3包涵体蛋白的体外复性存在较大困难,难以获取有活性的hTGF-β3蛋白。TGF-β3最常见的真核表达载体是CHO（中国仓鼠卵巢细胞）表达系统,但以前体形式表达的产物以成熟的二聚体和带有LAP的融合蛋白二种形式存在,影响了下游分离纯化工艺效率,试剂级的TGF-β3制品均以二种结构形式的混合物存在。毕赤酵母表达系统是成熟的真核表达系统,拥有较为完善的翻译后加工修饰功能,可以通过简单无机盐培养基实现高密度发酵,并能高效分泌表达外源蛋白,是TGF-β3理想的工业化生产宿主系统。有人利用毕赤酵母甲醇诱导表达系统构建过另一个家族成员TGF-β1的突变体分泌表达系统,该突变体为参与链间二硫键形成的半胱氨酸置换突变,表达产物为单体,但仍然拥有具有应用价值的生物学活性。本研究拟利用不依赖甲醇诱导的毕赤酵母组成分泌型表达系统建立人TGF-β3（human TGF-β3,hTGF-β3）的绿色、高效、廉价的生产工艺,为hTGF-β3的进一步研究开发打下基础。研究内容与方法:1.表达系统构建策略（1）构建三种结构形式表达产物的工程菌一种是直接由酿酒酵母α因子信号肽（MFα）牵引hTGF-β3成熟肽分泌表达,另外一类是利用LAP的辅助折叠和运输功能,构建MFα牵引的LAP与hTGF-β3融合蛋白分泌表达。为了提高成熟肽回收效率、并获得N端天然的hTGF-β3,在LAP与成熟肽之间设置一个肠激酶识别位点（EK）,分泌产物结构形式为LAP-EK-TGF-β3。考虑到天然的LAP序列中存在糖基化位点,并且第293位的潜在位点紧靠肠激酶识别位点,多糖链有可能掩盖蛋白酶的识别序列,所以在LAP与EK之间设置一个由（Gly4Ser）3组成的柔性Linker,其结构形式为LAP-Linker-EK-TGF-β3。（2）采用组成型启动子构建不依赖甲醇诱导的绿色生产系统目前毕赤酵母表达系统大多采用甲醇诱导型,该类诱导型依赖有毒的甲醇做碳源和诱导剂,容易造成环境和产品甲醇污染。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAP）是毕赤酵母系统较为强大的组成型启动子,能够介导目的基因高水平表达,且表达能力高于受甲醇严格高效调控的醇氧化酶1（alcohol oxidase 1,AOX1）启动子。而且该启动子在发酵表达时采用甘油或葡萄糖等无毒性物质作为唯一碳源,不需要甲醇诱导,避免了在生产过程中大量甲醇利用所造成的污染及危险,而且表达量高,发酵工艺简单,更加适用于大规模生产。（3）采用纯天然N末端设计将目的基因克隆在p GAPzαA载体α-factor信号肽下游,最终融合蛋白表达产物一共包括信号肽、蛋白酶识别序列,酶切位点和目的蛋白,所以通常分泌产物在目的蛋白N端引入的多余氨基酸会在一定程度上影响重组蛋白的活性。因此,直接分泌表达hTGF-β3的构建利用信号肽内部的Xho I、Xba I位点来克隆
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