关键词： 转化生长因子β3   毕赤酵母   分泌表达   组成型   纯化  

摘要： 目的:转化生长因子β3（transforming growth factor beta 1,TGF-β3）是TGF-β家族的一员,具有广泛的细胞生物学活性,如促进细胞生长、分化、迁移、凋亡、细胞外基质的产生和免疫。但与其它家族成员TGF-β1和TGF-β2不同的是,TGF-β3主要在胚胎发育期高表达,并在胚胎发育中发挥重要作用。肝、肺、心脏等主要脏器组织的纤维化在临床上严重威胁患者生命健康,体表创伤愈合过程过度瘢痕形成也严重影响颜面美观和正常功能发挥,并造成患者心理负担。TGF-β1可促进成纤维细胞向肌成纤维细转化、刺激胶原蛋白分泌,在组织纤维化和瘢痕形成中扮演重要角色,而TGF-β3则可促进创伤无瘢痕愈合,在临床和日常医学美容中具有重要应用价值。因此,建立绿色、廉价、且高效的制备工艺对于TGF-β3在临床应用开发具有很重要的意义。TGF-β的3个家族成员具有较高的结构相似性和序列同源性,成熟蛋白均为同源二聚体。TGF-β3前体共412个氨基酸,由23个氨基酸组成的信号肽、277个氨基酸的潜伏期相关肽（latency-associated peptide,LAP）和112个氨基酸的成熟肽等三个区段组成,其中,74、135、142、293位氨基酸为糖基化位点。成熟的TGF-β3蛋白结构为同源二聚体,由二个相同单体肽链通过一对链间二硫键连接组成。TGF-β3成熟肽单体有9个高度保守的半胱氨酸,其中8个半胱氨酸形成4对单体分子内二硫键,剩下的一个半胱氨酸形成连接另一个单体的单体间二硫键。由于TGF-β3结构复杂,通过基因工程手段实现高效制备TGF-β3蛋白存在较大困难。目前,TGF-β3蛋白均有在原核和真核中的表达系统中表达的相关研究,但原核宿主细胞因缺乏完善的翻译后加工机制,表达产物常以包涵体的形式存在。由于结构复杂,TGF-β3包涵体蛋白的体外复性存在较大困难,难以获取有活性的hTGF-β3蛋白。TGF-β3最常见的真核表达载体是CHO（中国仓鼠卵巢细胞）表达系统,但以前体形式表达的产物以成熟的二聚体和带有LAP的融合蛋白二种形式存在,影响了下游分离纯化工艺效率,试剂级的TGF-β3制品均以二种结构形式的混合物存在。毕赤酵母表达系统是成熟的真核表达系统,拥有较为完善的翻译后加工修饰功能,可以通过简单无机盐培养基实现高密度发酵,并能高效分泌表达外源蛋白,是TGF-β3理想的工业化生产宿主系统。有人利用毕赤酵母甲醇诱导表达系统构建过另一个家族成员TGF-β1的突变体分泌表达系统,该突变体为参与链间二硫键形成的半胱氨酸置换突变,表达产物为单体,但仍然拥有具有应用价值的生物学活性。本研究拟利用不依赖甲醇诱导的毕赤酵母组成分泌型表达系统建立人TGF-β3（human TGF-β3,hTGF-β3）的绿色、高效、廉价的生产工艺,为hTGF-β3的进一步研究开发打下基础。研究内容与方法:1.表达系统构建策略（1）构建三种结构形式表达产物的工程菌一种是直接由酿酒酵母α因子信号肽（MFα）牵引hTGF-β3成熟肽分泌表达,另外一类是利用LAP的辅助折叠和运输功能,构建MFα牵引的LAP与hTGF-β3融合蛋白分泌表达。为了提高成熟肽回收效率、并获得N端天然的hTGF-β3,在LAP与成熟肽之间设置一个肠激酶识别位点（EK）,分泌产物结构形式为LAP-EK-TGF-β3。考虑到天然的LAP序列中存在糖基化位点,并且第293位的潜在位点紧靠肠激酶识别位点,多糖链有可能掩盖蛋白酶的识别序列,所以在LAP与EK之间设置一个由（Gly4Ser）3组成的柔性Linker,其结构形式为LAP-Linker-EK-TGF-β3。（2）采用组成型启动子构建不依赖甲醇诱导的绿色生产系统目前毕赤酵母表达系统大多采用甲醇诱导型,该类诱导型依赖有毒的甲醇做碳源和诱导剂,容易造成环境和产品甲醇污染。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAP）是毕赤酵母系统较为强大的组成型启动子,能够介导目的基因高水平表达,且表达能力高于受甲醇严格高效调控的醇氧化酶1（alcohol oxidase 1,AOX1）启动子。而且该启动子在发酵表达时采用甘油或葡萄糖等无毒性物质作为唯一碳源,不需要甲醇诱导,避免了在生产过程中大量甲醇利用所造成的污染及危险,而且表达量高,发酵工艺简单,更加适用于大规模生产。（3）采用纯天然N末端设计将目的基因克隆在p GAPzαA载体α-factor信号肽下游,最终融合蛋白表达产物一共包括信号肽、蛋白酶识别序列,酶切位点和目的蛋白,所以通常分泌产物在目的蛋白N端引入的多余氨基酸会在一定程度上影响重组蛋白的活性。因此,直接分泌表达hTGF-β3的构建利用信号肽内部的Xho I、Xba I位点来克隆

关键词： 骨   材料   支架   转化生长因子β3   3D生物打印   软骨损伤   脂肪间充质干细胞   招募   迁移  

摘要： 背景:通过募集内源性干细胞原位再生软骨损伤的治疗策略,是未来软骨组织工程研究的新方向。目的:构建既能募集干细胞又能促进其黏附和增殖,且有利于新生组织成熟的组织工程软骨复合支架。方法:将脱细胞软骨细胞外基质(extracellular matrix,ECM)与甲基丙烯酸酯化明胶(methacrylated gelatin,GelMA)混合配制光敏性生物墨水,利用3D生物打印技术分别制备单纯聚己内酯[poly(Ɛ-caprolactone),PCL]支架、PCL/GelMA/ECM支架。将转化生长因子β3(transforming growth factorβ3,TGF-β3)负载于生物墨水中制备PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架,检测其缓释性能。从形态学、组织学、生物化学、生物力学等角度评价PCL/GelMA/ECM支架的物理化学性质。利用CCK-8法检测PCL/GelMA/ECM支架的细胞毒性。将脂肪间充质干细胞接种于PCL/GelMA/ECM支架上,1,4,7 d后,共聚焦显微镜下观察细胞活性,扫描电镜观察细胞黏附。将PCL/GelMA/ECM支架植入SD大鼠皮下,组织学观察炎性细胞浸润与支架降解。利用Transwell小室实验检测PCL/GelMA/ECM支架、PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架对脂肪间充质干细胞迁移的影响,以单独培养的细胞为阴性对照。结果与结论:①PCL/GelMA/ECM支架呈现三维立体多孔网状结构,无细胞成分,含有Ⅱ型胶原和糖胺聚糖等软骨特异性成分,支架弹性模量为(14.24±2.44)MPa;②PCL/GelMA/ECM支架无明显的细胞毒性;③脂肪间充质干细胞紧密贴附于PCL/GelMA/ECM支架上,细胞活性良好,可分泌细胞外基质;④PCL/GelMA/ECM支架植入大鼠皮下1周后有轻度急性炎症反应,3周后炎性反应减轻,并可见逐步支架降解;⑤PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架具有良好的缓释性能,可持续释放TGF-β3达60 d;⑥相对于阴性对照组,PCL/GelMA/ECM支架、PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架均可促进脂肪间充质干细胞的迁移,其中以PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架促迁移作用更显著;⑦结果表明,3D打印PCL/GelMA/ECM/TGF-β3支架可促进脂肪间充质干细胞的增殖、黏附与迁移。

关键词： 成纤维细胞   转化生长因子β_(1)   艾拉莫德   肺纤维化  

摘要： 目的研究艾拉莫德是否能够抑制TGF-β_(1)诱导的人肺成纤维细胞(HLFs)活化及胶原分泌。方法在体内,建立小鼠肺纤维化模型,分为3组:正常对照组、博莱霉素组和博莱霉素+艾拉莫德组,苏木精-伊红(HE)染色观察肺形态,马松染色观察肺内胶原积累程度,组织免疫荧光检测肺内肌成纤维细胞标志蛋白纤维连接蛋白(fibronectin)和平滑肌22蛋白(SM22),氯胺-T法检测肺组织羟脯氨酸含量。在体外,用原代人肺成纤维细胞(pHLFs)进行细胞实验评估艾拉莫德对TGF-β_(1)刺激的影响,分为4组:正常对照组、艾拉莫德组、TGF-β_(1)组、TGF-β_(1)+艾拉莫德组,流式细胞术检测细胞的凋亡情况,实时荧光定量(qRT)-PCR检测细胞Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的mRNA表达水平,蛋白质印迹法和细胞免疫荧光检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、fibronectin、p-Smad2和p-Smad3以及转录辅助激活因子p300的蛋白水平。数据均采用单因素方差分析,两两比较用LSD-t检验或Kruskal-Wallis检验。结果羟脯氨酸含量:正常对照组为(0.552±0.075)μg/mg,博莱霉素组为(1.293±0.081)μg/mg,博莱霉素+艾拉莫德组(0.833±0.053)μg/mg(F=169.672,P<0.01),艾拉莫德降低了小鼠肺组织羟脯氨酸含量,减少了肺内胶原积累,从而降低了博莱霉素诱导的肺纤维化程度,改善了小鼠肺部病理改变。在细胞实验中,艾拉莫德对细胞凋亡比例差异无统计学意义(F=0.83,P=0.54);Ⅰ型胶原蛋白mRNA相对表达量:正常对照组为(100.4±1.2),TGF-β_(1)组为(299.0±13.0),TGF-β_(1)+艾拉莫德组(202.5±7.0)(F=468.7,P<0.01);Ⅲ型胶原蛋白mRNA相对表达量:正常对照组为(99.8±1.9),TGF-β_(1)组为(350.6±8.0),TGF-β_(1)+艾拉莫德组(220.3±9.9)(F=468.7,P<0.01);α-SMA蛋白相对表达量:正常对照组为(0.193±0.038),TGF-β_(1)组为(0.530±0.061),TGF-β_(1)+艾拉莫德组为(0.410±0.065)(F=35.620,P<0.01);Fibronectin蛋白相对表达量:正常对照组为(0.200±0.020),TGF-β_(1)组为(0.700±0.020),TGF-β_(1)+艾拉莫德组为(0.410±0.066)(F=123.326,P<0.01);p-Smad3蛋白相对表达量:正常对照组为(0.120±0.020),TGF-β_(1)组为(0.573±0.586),TGF-β_(1)+艾拉莫德组为(0.327±0.252)(F=92.987,P<0.01);p300蛋白相对表达量:正常对照组为(0.180±0.055),TGF-β_(1)组为(0.923±0.025),TGF-β_(1)+艾拉莫德组(0.650±0.050)(F=207.676,P<0.01)。艾拉莫德显著降低TGF-β_(1)诱导的Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的mRNA表达水平,抑制α-SMA、Fibronectin、p300蛋白表达,以及Smad2、Smad3蛋白的磷酸化。结论艾拉莫德能够经Smad3/p300通路抑制TGF-β_(1)介导的人肺成纤维细胞活化及胶原分泌,它可能作为一种有效的抗纤维化药物用于延缓PF的进展。

关键词： 膝骨关节炎   针灸   骨桥蛋白   基质金属蛋白酶-3   转化生长因子β1  

摘要： 目的探究不同针灸方法对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)大鼠骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响。方法将60只健康SD大鼠随机分为正常组、模型组、针刺组、火针组、温针组、电针组,每组10只。除正常组外,其余大鼠采用木瓜蛋白酶关节腔注射法构建KOA大鼠模型。正常组与模型组均不采取任何方法治疗。针刺组、火针组、温针组、电针组大鼠均选取内膝眼、外膝眼、阴陵泉穴,分别采用单纯针灸针进行针刺、火针、温针、电针进行治疗。评估各组膝关节严重程度指数(Lequesne MG),检测并比较治疗后KOA大鼠痛阈值、外周血和关节滑液OPN、MMP-3、TGF-β1表达水平。结果造模后,模型组、针刺组、火针组、温针组、电针组Lequesne MG评分均高于正常组,差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗后,针刺组、火针组、温针组、电针组Lequesne MG评分均低于本组治疗前,差异有统计学意义(P<0.05),且针刺组、火针组、温针组、电针组Lequesne MG评分均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05),其中温针组、电针组Lequesne MG评分均低于针刺组,差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗后,模型组痛阈值均低于正常组、针刺组、火针组、温针组、电针组,差异有统计学意义(P<0.05);且电针组痛阈值均高于正常组、模型组、针刺组、火针组、温针组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组和针刺组、火针组、温针组、电针组外周血OPN、MMP-3、TGF-β1 mRNA相对表达量均高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);针刺组、火针组、温针组、电针组外周血OPN、MMP-3、TGF-β1 mRNA相对表达量均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组和针刺组、火针组、温针组、电针组外周血OPN、TGF-β1水平均高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);模型组、针刺组、火针组外周血MMP-3水平均高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);且针刺组、火针组、温针组、电针组外周血OPN、MMP-3、TGF-β1水平均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组和针刺组、火针组、温针组、电针组关节滑液OPN、MMP-3、TGF-β1 mRNA相对表达量均高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);针刺组、火针组、温针组、电针组关节滑液OPN、MMP-3、TGF-β1 mRNA相对表达量均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组和针刺组、火针组、温针组、电针组关节滑液OPN、MMP-3均高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);模型组、针刺组、火针组关节滑液TGF-β1水平均高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);且针刺组、火针组、温针组、电针组关节滑液OPN、MMP-3、TGF-β1水平均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论不同针灸方法对KOA大鼠均有疗效,其机制可能与下调外周血和关节滑液OPN、MMP-3、TGF-β1的表达有关。其中电针法具有更好的镇痛功效,温针法和电针法能够更好地抑制外周血MMP-3以及关节滑液TGF-β1的表达。

关键词： 软骨疾病   转化生长因子β3   间质干细胞   转染   角蛋白质类   组织支架   疾病模型,动物   兔  

摘要： 目的通过构建新西兰种大白兔的软骨缺损模型,探讨角蛋白支架联合转化生长因子-β3(TGF-β3)基因过表达载体质粒转染的骨髓间充质干细胞(BMSC)复合物对软骨缺损的修复作用。方法构建大白兔的软骨缺损模型;将新西兰大白兔随机分为模型组(A组)、支架组(B组)、联合BMSC组(C组)和联合过表达质粒转染BMSC组(D组),每组5只,B组软骨缺损处填充角蛋白支架,C组软骨缺损处填充角蛋白支架联合BMSC复合物,D组软骨缺损处填充角蛋白支架联合TGF-β3基因过表达载体转染的BMSC复合物。利用苏木精-伊红(HE)染色、番红-固绿染色和免疫组织化学染色检测各组大白兔缺损软骨修复情况,并且利用改良O′Driscoll评分系统评估HE染色结果,利用改良Mankin评分系统评估番红-固绿染色结果。结果HE染色和番红-固绿染色结果显示,D组软骨缺损基本愈合,愈合处多为软骨组织。A组、B组、C组和D组O′Driscoll评分比较差异有显著性(F=9.342,P<0.05),其中D组O′Driscoll评分明显低于其他组(q=2.018~2.498,P<0.05);A组、B组、C组和D组Mankin评分比较差异均具有显著性(F=8.549,P<0.05);其中D组Mankin评分明显高于其他组(q=2.237~3.457,P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示,C组和D组软骨缺损处填充物均可见Ⅱ型胶原蛋白表达,D组表达量更多。结论角蛋白支架联合TGF-β3基因过表达载体质粒转染的BMSC复合物可以促进缺损软骨的修复。

关键词： MC3T3-E1细胞   转化生长因子β   骨形成蛋白2   成骨   细胞增殖   细胞分化  

摘要： 背景:生长因子是骨组织形成、改建、修复的关键要素之一,多种生长因子联合诱导骨干细胞成骨分化相较于单一生长因子具有一定的优势,但是何种类型的联合、什么样的浓度组合才能发挥最佳的诱导作用?目前该方向研究较少。目的:探索转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导对小鼠MC3T3-E1细胞增殖和分化的影响。方法:将不同质量浓度的转化生长因子β和骨形成蛋白2与小鼠MC3T3-E1细胞混合诱导培养,共设置6个组,含1个对照组和5个实验组。在不同时间点进行检测,MTT法检测细胞的增殖情况;实时定量RT-PCR检测Runx2、骨钙素基因表达;碱性磷酸酶染色观察成骨细胞活性及功能状态;茜素红染色观察钙结节形成的数量。结果与结论:①转化生长因子β和骨形成蛋白2单独或联合使用时,都可以明显促进小鼠MC3T3-E1细胞增殖,促进Runx2、骨钙素基因的表达,增加碱性磷酸酶活性及矿化能力(P<0.05);②两者联合使用时,在实验浓度范围内促成骨效果与浓度正相关,低浓度的联合能达到或优于单独使用的效果,联合质量浓度为1μg/L转化生长因子β+100μg/L骨形成蛋白2是最优组;③提示转化生长因子β和骨形成蛋白2单独或联合诱导均能明显促进小鼠MC3T3-E1细胞增殖分化及成骨作用,二者联合诱导在增殖、分化的不同阶段既各自侧重又相互协同;在此次实验浓度范围内,1μg/L转化生长因子β+100μg/L骨形成蛋白2联合组为最优促进效果。

关键词： 流产,自然   孕酮   转化生长因子-β   妊娠结局   受试者工作特征曲线   共刺激分子可溶性B7-H3  

摘要： 目的探讨血清孕酮、转化生长因子-β(TGF-β)、共刺激分子可溶性B7-H3(sB7-H3)在自发性流产(SA)病人中的表达及预测价值。方法选取周口市西华县妇幼保健院2015年5月至2018年1月妊娠者240例作为研究对象,根据妊娠情况分为SA病人35例作为观察组,正常妊娠者205例作为对照组。妊娠第6周、第7周、第10周、第12周检测对比两组血清孕酮、TGF-β、sB7-H3水平,logistic回归分析SA影响因素,Pearson相关系数分析血清孕酮、TGF-β、sB7-H3间相关性,受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析血清孕酮、TGF-β、sB7-H3对SA的预测价值。结果两组年龄、既往流产史、甲状腺功能差异有统计学意义(P<0.05);观察组妊娠第7周、第10周、第12周孕酮(26.38±4.12)μg/L、(28.13±5.66)μg/L、(30.16±6.16)μg/L、TGF-β(4407.60±710.38)ng/L、(5801.20±953.25)ng/L、(6531.52±1,280.92)ng/L、sB7-H3(901.52±250.56)ng/L、(1308.27±339.78)ng/L、(1718.03±417.38)ng/L水平低于对照组(29.84±5.28)μg/L、(33.29±6.38)μg/L、(38.95±8.88)μg/L、(5151.07±780.19)ng/L、(6776.44±995.61)ng/L、(8032.10±1500.17)ng/L、(1176.17±281.44)ng/L、(1675.91±378.75)ng/L、(2183.08±470.18)ng/L(P<0.05);年龄≥30岁、既往流产史、甲状腺功能异常、血清孕酮、TGF-β、sB7-H3是SA发生的独立危险因素(P<0.05);血清TGF-β与sB7-H3呈正相关,孕酮与TGF-β、sB7-H3呈正相关(P<0.05);ROC曲线显示,第7周血清孕酮预测SA的AUC值最高0.864,大于TGF-β、sB7-H3。结论SA病人血清孕酮、TGF-β、sB7-H3呈低表达,因子间协同作用可能是造成流产的主要原因,临床加强高危SA病人上述因子监测,对超早期干预、改善妊娠结局具有重要意义。

关键词： 骨   生长因子   成骨   成骨细胞   细胞增殖   碱性磷酸酶   基因  

摘要： 背景:转化生长因子β3对成骨细胞增殖和成骨能力的影响相关研究甚少。目的:观察不同质量浓度的转化生长因子β3对成骨细胞生长增殖和成骨能力的影响。方法:采用课题组前期方法改良酶消化法分离获得新西兰幼兔颅盖骨成骨细胞,差速贴壁法纯化并鉴定。将成骨细胞分为对照组和实验组,对照组为常规培养的成骨细胞,实验组为分别含0.1,1,10,100μg/L的转化生长因子β3培养。各组每天观察细胞生长情况;培养1,3,5,7,9,11,13 d采用MTT法检测各组细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线;培养1,3,5,7,9,11,13,15 d检测各组碱性磷酸酶水平;培养第7,14天用RT-qPCR法检测各组胶原蛋白1A1、Runx-2和骨钙素基因表达情况;培养21d茜素红染色法检测各组细胞矿化能力。实验方案经新疆医科大学第一附属医院动物实验伦理委员会批准。结果与结论:①成功分离培养、纯化并鉴定成骨细胞;②10μg/L转化生长因子β3组细胞增殖活性明显高于对照组(P<0.05);10,100μg/L转化生长因子β3组碱性磷酸酶水平高于对照组(P<0.05);③10μg/L转化生长因子β3组胶原蛋白1A1、Runx-2和骨钙素基因表达量始终高于对照组(P<0.05),100μg/L转化生长因子β3组胶原蛋白1A1,Runx-2和骨钙素基因表达量在第7天时高于对照组(P<0.05);④10,100μg/L转化生长因子β3组矿化结节较对照组大且多,其中10μg/L转化生长因子β3组的矿化结节数明显多于对照组(P<0.05);⑤结果说明,转化生长因子β3在10-100μg/L范围内可促进成骨细胞的增殖和成骨能力,其中10μg/L质量浓度的转化生长因子β3效果最佳。

关键词： 骨髓间充质干细胞   干细胞膜片   转化生长因子β3   抗坏血酸   成软骨分化  

摘要： 目的:探索转化生长因子β3(TGF-β3)诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞膜片成软骨分化的潜能。方法:体外分离培养兔骨髓间充质BMSCs细胞,用含抗坏血酸培养基构建干细胞膜片,添加TGF-β3对干细胞膜片成软骨诱导分化。光镜、HE染色和Masson染色观察细胞形态、大体结构及组织学改变,阿利新蓝染色、Ⅱ型胶原(ColⅡ)免疫组化染色和RT-qPCR检测成软骨标志物ColⅡ和蛋白聚糖(PG)的mRNA表达及蛋白合成情况。结果:TGF-β3诱导成软骨分化14 d,镜下间充质干细胞生长良好,可用镊子钳夹起膜片状结构,可卷缩成团再展开成膜。HE染色显示细胞质及细胞外基质成分均被染成粉红色,其胞核为蓝色,细胞间呈分层状排列结构。Masson染色可见胞核染成蓝黑色,其细胞质染成粉红色,周围包绕着大量染成蓝色的胶原成分。阿利新蓝染色与ColⅡ免疫组化染色均为阳性,对照组阴性。实验组高表达软骨细胞特异性ColⅡ和PG的mRNA(P<0.05)。结论:抗坏血酸诱导构建的干细胞膜片经TGF-β3诱导,能成功向软骨分化及构建软骨细胞膜片。

关键词： 骨形态生产蛋白-7   转化生长因子β3   间充质干细胞   软骨  

摘要： 目的:探讨体外骨形态生产蛋白-7(BMP-7)联合转化生长因子β3(TGF-β3)在诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞及软骨中的作用。方法:在完全培养基中加入不同浓度的BMP-7和TGF-β3(10 ng/mL∶10 ng/mL,25 ng/mL∶25 ng/mL,50 ng/mL∶50 ng/mL,100 ng/mL∶100 ng/mL)制成分化培养基,分别记为低浓度、中低浓度、中浓度和高浓度组,完全培养基作为对照组。每组分别用上述不同浓度分化培养基培养4×10~4个比格犬股骨骨髓间充质干细胞,悬浮沉淀细胞团,并定期更换分化培养基。分别于7、14、21、28、35、42 d观察细胞团分化及聚集成团情况。随后多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片后行HE染色,阿利辛蓝染色,免疫荧光染色。结果:比格犬骨髓间充质干细胞生长情况良好,对照组及不同浓度分化培养基的干细胞在第7天均未见细胞聚集,在第14天,中浓度和高浓度组干细胞聚集成团,而对照组、低浓度组和中低浓度干细胞呈散在点状结构,未见明显聚集成团;在第21、28、35、42天,中浓度和高浓度组聚集成团的结构大小未见明显变化,呈乳白色胶状,结构更为紧密,且富有弹性,高浓度组聚集成团结构直径大于中浓度组(1.2 mm vs.0.6 mm),而对照组、低浓度组和中低浓度组干细胞仍呈分散状态,未见聚集成团。经HE染色、阿利辛蓝染色、免疫荧光反应证实聚集成团的结构表达丰富的酸性粘多糖和II型胶原蛋白。免疫荧光反应定量结果显示干细胞的值为(1.126±0.030),诱导细胞的值为(23.211±0.816),软骨细胞的值为(9.669±0.278),各组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:BMP-7和TGF-β3联合作用能有效诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞及软骨。