关键词： 软骨   材料   水凝胶   转化生长因子β3   海藻酸钠水凝胶   软骨缺损   软骨组织工程  

摘要： 背景:已经有大量研究报道转化生长因子β3与藻酸盐、间充质干细胞复合修复软骨缺损的动物实验,但是关于转化生长因子β3与海藻酸钠水凝胶复合间充质干细胞修复软骨损伤的研究较少。目的:对比海藻酸钠水凝胶与负载转化生长因子β3的海藻酸钠水凝胶分别复合骨髓间充质干细胞修复骨缺损的效果。方法:体外分离培养兔骨髓间充质干细胞备用;制备转化生长因子β3海藻酸钠水凝胶复合物;移植前,将骨髓间充质干细胞悬液与水凝胶等体积混合。取48只新西兰大白兔制备膝关节软骨缺损,随机分3组:损伤组不作任何处理,对照组植入海藻酸钠水凝胶与骨髓间充质干细胞悬液,观察组植入转化生长因子β3海藻酸钠水凝胶复合物与骨髓间充质干细胞悬液。术后12周时取材,分别进行大体、组织学观察、Ⅱ型胶原免疫组化染色与RT-PCR检测。结果与结论:(1)大体观察:术后12周时,损伤组缺损部位由大量肉芽组织填充,对照组由半透明状软骨样组织填充,观察组由新生组织填满;(2)组织学观察:术后12周苏木精-伊红染色与番红O染色可见,损伤组缺损部位被较多的纤维组织填充,中央部位存在较大的缝隙;对照组可见较多的软骨样组织与成纤维组织,表面欠规则,材料大部分降解,材料周围由大量的骨小梁包绕;观察组可见大量的软骨样组织,表面较光滑且结构较致密,类似于周围正常软骨组织;(3)Ⅱ型胶原免疫组化染色:损伤组仅见极其微弱的阳性染色,对照组、观察组可见阳性染色,并且观察组的阳性着色程度明显强于对照组;(4)RT-PCR检测:对照组再生软骨组织的Ⅱ型胶原、Sox9、糖胺多糖mRNA表达均低于观察组(P<0.05);(5)结果表明:负载转化生长因子β3的海藻酸钠水凝胶-骨髓间充质干细胞复合物可促进关节软骨缺损的修复,提升关节软骨基因的表达。

关键词： 鼻窦炎   炎症   转化生长因子β3   组织重塑  

摘要： 目的 探究2型和非2型慢性鼻窦炎不伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps,CRSsNP)患者的临床特征及组织重塑差异。方法 收集26例CRSsNP患者鼻窦黏膜组织和临床资料,回访患者复发情况。根据组织内白细胞介素5(IL-5)表达将CRSsNP分为2型和非2型两组。天狼猩红染色检测CRSsNP组织的胶原沉积情况。RT-qPCR和Luminex检测转化生长因子β1(TGF-β1)、TGF-β2和TGF-β3的mRNA和蛋白表达情况,明确IL-5与CRSsNP组织重塑的相关性。结果 与非2型CRSsNP相比,2型CRSsNP合并过敏的比例(21.05% vs 71.43% P=0.061)、术前Lund-Mackay CT评分(13.00±4.40 vs 8.50±4.19,P<0.05)、组织内IL-5[(120.23±83.93)pg/ml vs(4.95±2.75)pg/ml,P<0.001]、TGF-β3[(315.0±304.7)pg/ml vs(93.93±132.4)pg/ml,P<0.05]显著升高。活化的TGF-β3与IL-5表达水平呈正相关(r=0.6813,P<0.05)。此外,2型CRSsNP总胶原沉积程度更高,Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维表达面积百分比较非2型CRSsNP均增加。结论 与非2型CRSsNP患者相比,2型CRSsNP患者临床症状和组织重塑更严重,组织重塑与2型炎症反应呈正相关,揭示以2型炎症为靶点的治疗方案可适用于2型CRSsNP患者。

关键词： 瘢痕疙瘩   微RNA-133a-3p   转化生长因子-β_(1)   增殖   凋亡  

摘要： 目的探讨微RNA(miR)-133a-3p靶向调控转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))/Smad3对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法选择2020年2月至2021年2月焦作市人民医院皮肤科收治的瘢痕疙瘩患者29例为研究对象,手术切取瘢痕疙瘩组织及其周围正常皮肤组织,分离培养瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)和正常皮肤组织成纤维细胞(NF)。取对数生长期KF细胞,随机分为空白对照组、miR-阴性对照(NC)组、miR-133a-3p组、miR-133a-3p+pcDNA3.1组、miR-133a-3p+pcDNA3.1-TGF-β_(1)组;空白对照组细胞不做任何转染,miR-NC组细胞转染miR-NC,miR-133a-3p组细胞转染miR-133a-3p mimic,miR-133a-3p+pcDNA3.1组细胞共转染miR-133a-3p mimic和pcDNA3.1,miR-133a-3p+pcDNA3.1-TGF-β_(1)组细胞共转染miR-133a-3p mimic和pcDNA3.1-TGF-β_(1)。实时荧光定量聚合酶链反应法检测组织和细胞中miR-133a-3p和Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(collagen Ⅲ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA的表达,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡情况。应用TargetScan数据库通过生物信息分析预测miR-133a-3p与TGF-β_(1)的3′非翻译区(3′-UTR)存在结合位点,构建含有预测结合位点的野生型(Wt)和突变型(Mt)TGF-β_(1)3′-UTR片段的荧光素酶报告基因载体,分别将用脂质体2000包裹的Wt TGF-β_(1)或Mt TGF-β_(1)报告基因载体与miR-133a-3p mimics或miR-NC共转染入KF细胞,将转染后的细胞设为miR-NC+Wt TGF-β_(1)组、miR-133a-3p+Wt TGF-β_(1)组、miR-NC+Mt TGF-β_(1)组、miR-133a-3p+Mt TGF-β_(1)组,双荧光素酶检测试剂盒检测4组细胞双荧光素酶活性。Western blot检测空白对照组、miR-NC组、miR-133a-3p组KF细胞中TGF-β_(1)、Smad3蛋白的相对表达量。结果瘢痕疙瘩组织中miR-133a-3p相对表达量显著低于正常皮肤组织(t=18.988,P<0.05)。KF细胞中miR-133a-3p相对表达量显著低于NF细胞(t=18.679,P<0.05)。miR-133a-3p组细胞中miR-133a-3p相对表达量显著高于空白对照组和miR-NC组,CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA mRNA相对表达量显著低于空白对照组和miR-NC组(P<0.05);空白对照组与miR-NC组细胞中miR-133a-3p和CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。miR-133a-3p组细胞凋亡率显著高于空白对照组和miR-NC组,细胞增殖活力显著低于空白对照组和miR-NC组(t=13.912、14.227、-8.020、-6.947,P<0.05);空白对照组与miR-NC组细胞凋亡率、细胞增殖活力比较差异无统计学意义(t=-0.607、0.448,P>0.05)。miR-133a-3p+Wt TGF-β_(1)组细胞相对荧光素酶活性显著低于miR-NC+Wt TGF-β_(1)组、miR-NC+Mt TGF-β_(1)组、miR-133a-3p+Mt TGF-β_(1)组(t=-15.729、-19.490、-16.186,P<0.05)。miR-NC+Wt TGF-β_(1)组、miR-NC+Mt TGF-β_(1)组、miR-133a-3p+Mt TGF-β_(1)组细胞相对荧光素酶活性两两比较差异均无统计学意义(t=-0.596、0.847、0.842,P>0.05)。KF细胞中Smad3和TGF-β_(1)蛋白相对表达量显著高于NF细胞(t=5.758、9.027,P<0.05)。miR-133a-3p组细胞中Smad3和TGF-β_(1)蛋白相对表达量显著高于miR-NC组(t=-4.913、-8.314,P<0.05)。miR-133a-3p+pcDNA3.1-TGF-β_(1)组细胞中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA相对表达量和细胞增殖活力显著高于miR-133a-3p组和miR-133a-3p+pcDNA3.1组,细胞凋亡率显著低于miR-133a-3p转染组和miR-133a-3p+pcD

关键词： miR-142-3p   转化生长因子-β受体1   子痫前期   侵袭   转移  

摘要： 目的探讨微小RNA(miR)-142-3p靶向转化生长因子-β受体1(TGF-βR1)对滋养细胞侵袭、迁移的影响,阐明miR-142-3p与TGF-βR1基因的靶向关系及其作用机制。方法以HTR-8/SVneo为研究对象,分为NC组(未进行任何处理)、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-142-3p组(转染miR-142-3p mimics)。四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖能力;Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力;实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞中miR-142-3p、TGF-βR1 mRNA表达水平;Western blot检测细胞TGF-βR1、磷酸化Smad同源物2(p-Smad2)和磷酸化Smad同源物3(p-Smad3)表达水平。生物信息预测miR-142-3p与TGF-βR1的靶向作用关系,并使用荧光素酶报告实验验证。结果与NC组、miR-NC组比较,miR-142-3p组细胞p-Smad2、p-Smad3蛋白、mRNA水平明显升高(P<0.01)。与NC组、miR-NC组比较,48h和72h时,miR-142-3p组细胞增殖能力明显降低(P<0.01)。与NC组、miR-NC组比较,miR-142-3p组细胞侵袭及迁移能力明显降低(P<0.01)。与si-NC组比较,48h和72h时,si-TGF-βR1组细胞增殖能力明显升高(P<0.01)。与si-NC组比较,si-TGF-βR1组细胞侵袭及迁移能力明显升高(P<0.01)。双荧光素酶报告基因检测结果提示TGF-βR1为miR-142-3p的靶基因。结论过表达miR-142-3p可能通过抑制TGF-βR1/Smad通路抑制滋养层细胞的增殖、侵袭和迁移。

关键词： 人牙髓干细胞   转化生长因子-β_(3)成骨向分化   Smad蛋白  

摘要： 目的探讨转化生长因子-β_(3)(transforming growth factor-β_(3),TGF-β_(3))体外诱导人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)成骨向分化的效果及可能机制。方法采用免疫荧光技术观察原代hDPSCs基质细胞抗原STRO-1的免疫荧光染色情况,应用流式细胞仪检测原代hDPSCs细胞CD90、CD73、CD105表达情况,鉴别是否为hDPSCs。应用倒置显微镜观察培养第1~7天hDPSCs形态变化。原代hDPSCs传代培养至第3代对数生长期,随机分为空白组、实验组、对照组,空白组继续在常规培养基中培养,实验组在常规培养基中加入80μg/L TGF-β_(3)后培养,对照组在常规培养基中加入10 mmol/Lβ-甘油磷酸盐、100 nmol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸后培养。培养第7天,采用实时荧光定量PCR法检测3组细胞TGF-βⅠ型受体(TGF-βreceptor typeⅠ,TGF-βRⅠ)、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA相对表达量,采用Western blot法检测3组细胞骨钙素(osteocalcin,OCN)、Runx-2、TGF-βRⅠ、Smad2/Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Smad4蛋白相对表达量;培养第14、21天,采用茜素红染色观察3组钙化结节情况。结果原代hDPSCs基质细胞抗原STRO-1免疫荧光染色呈阳性,hDPSCs细胞表面CD90、CD73、CD105阳性表达率分别为93.4%、98.2%、89.1%;鉴定原代细胞为hDPSCs。第3代hDPSCs培养第1~3天,细胞多呈不规则多角形、梭形或三角形;培养第4~7天,细胞逐渐呈长条状梭形。培养第7天,实验组细胞TGF-βRⅠ、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA相对表达量(1.69±0.25、1.84±0.15、1.73±0.29、1.79±0.25)均高于空白组(1.02±0.30、1.02±0.30、1.00±0.25、1.01±0.26)(P<0.05),Smad2、Smad4 mRNA相对表达量均高于对照组(1.41±0.11、1.33±0.12)(P<0.05),TGF-βRⅠ、Smad3 mRNA相对表达量与对照组(1.50±0.12、1.43±0.24)比较差异均无统计学意义(P>0.05);对照组细胞TGF-βRⅠmRNA相对表达量高于空白组(P<0.05),Smad2、Smad3、Smad4 mRNA相对表达量与空白组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。实验组细胞Runx-2、OCN、TGF-βRⅠ、Smad2/Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Smad4蛋白相对表达量均高于空白组(P<0.05),Runx-2、OCN、Smad4蛋白相对表达量均高于对照组(P<0.05),TGF-βRⅠ、Smad2/Smad3、p-Smad2、p-Smad3与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05);对照组细胞Runx-2、TGF-βRⅠ、Smad2/Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Smad4蛋白相对表达量均高于空白组(P<0.05),OCN蛋白相对表达量与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。培养第14天,实验组、对照组出现多个大小不等的红色沉积物;培养第21天,实验组、对照组红色沉积物增多,成骨向分化程度增高,实验组矿化结节数量多于空白组、对照组。结论TGF-β_(3)可在体外有效促进hDPSCs的成骨向分化,其机制可能是通过提高SMAD2、SMAD4基因表达促进成骨蛋白OCN、Runx-2表达。

关键词： 干细胞   外周血源性间充质干细胞   细胞因子   转化生长因子β3   重复测量   软骨组织工程   Ⅱ型胶原   聚集蛋白聚糖   软骨修复  

摘要： 背景:随着软骨组织工程技术的发展,国内外已有应用外周血源性间充质干细胞修复软骨缺损的体外培养及动物实验,并取得了不错的进展,转化生长因子β3常被用于细胞体外培养以诱导间充质干细胞成软骨分化。但在实验应用中,很少涉及转化生长因子β3量效探讨,涉及量效的细胞培养实验又经常误用单因素方差分析或t检验来分析这类资料。目的:采用重复测量方法分析转化生长因子β3诱导外周血源性间充质干细胞成软骨分化的量效关系,以期获得较佳的转化生长因子β3用量,获得较好的成软骨分化效果。方法:动员、提取、培养滇南小耳猪外周血源性间充质干细胞,分别加入含不同质量浓度转化生长因子β3(25-500μg/L)的成软骨诱导液进行成软骨诱导分化,对照组不作诱导处理,培养第2,4,6,8,10,12,14天,CCK-8法检测各组细胞增殖情况;培养第3,7,14,21天,收集各组细胞培养上清,ELISA法检测Ⅱ型胶原水平;培养第21天,进行甲苯胺蓝染色观察聚集蛋白聚糖表达;培养第21天,进行免疫细胞化学染色观察Ⅱ型胶原表达。结果与结论:在25-500μg/L范围内,转化生长因子β3质量浓度在40μg/L时外周血源性间充质干细胞生长增殖能力最强,转化生长因子β3质量浓度在40,80μg/L时更容易促进外周血源性间充质干细胞成软骨分化。

关键词： 心肌梗死   心肌纤维化   转化生长因子-β1   成纤维细胞   整联蛋白  

摘要： 转化生长因子-β1(TGF-β1)是重要的促纤维化细胞因子，发挥作用前为无活性的潜活形式。骨膜蛋白作为由肌成纤维细胞所产生的基质蛋白，可以独立于TGF-β1引发与细胞表面的整联蛋白结合引发细胞内Smad3磷酸化，从而促进肌成纤维细胞表面整联蛋白的表达、成纤维细胞的趋化与激活及增加心肌间质硬度以诱导潜活形式的TGF-β1活化，TGF-β1的过度分泌与激活可以维持肌成纤维细胞的活性，从而促进心肌梗死后心肌纤维化。本文从骨膜蛋白诱导Smad3磷酸化的角度出发，探讨对潜活形式的TGF-β1的激活以促进心肌梗死后心肌纤维化的机制。

关键词： 人源诱导式多能干细胞   骨髓来源间充质干细胞   人源诱导式多能干细胞来源的多能前体干细胞   软骨分化   软骨肥大   转化生长因子β3  

摘要： 目的:利用诱导式多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的多能分化潜力,将其诱导分化成具有间充质干细胞(Mesenchymal stromal cells,MSCs)特性的多能前体细胞(multipotent progenitor cells,MPCs),并通过三维细胞培养的方式进一步优化诱导式多能干细胞来源的多能前体细胞(iPSC-MPCs,iMPCs)的成软骨分化方案。通过体外培养、小鼠皮下包埋以及大鼠膝关节原位修复实验对比iMPCs与人骨髓来源的间充质干细胞(human bone marrow derived mesenchymal stromal cells,h BMMSCs)在形成透明软骨样组织上的差异,明确更优的细胞来源。最后探讨两种细胞在软骨诱导过程中对不同生长因子反应差异的潜在机理。方法:首先将iPSCs在含玻连蛋白(Vitronectin)涂层的六孔板上进行扩增培养。使用间充质诱导培养基(ACF Mesenchymal Induction Medium)直接将其分化为具有间充质干细胞特性的iMPCs。接着在细胞培养瓶中传代培养至更高代数的细胞。其中选取第三代(Passage 3,P3)、第五代(P5)及第七代(P7)的iMPCs进行接下来的实验。另外,使用传统方法提取的h BMSCs作为阳性对照组,表征间充质干细胞特性。通过细胞形态学观察,流式细胞术,细胞集落实验,三谱系分化组织学染色(茜素红染色(成骨象),阿尔新兰染色(成软骨象)和油红染色(成脂肪象))验证iMPCs的间充质干细胞表型。接着,在二维细胞培养瓶内收集相应代数的细胞制作成用于三维培养的细胞小球,分化诱导7,14,21天,用于进一步的分析。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-q PCR),组织学染色以及免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)对软骨形成相关和肥大形成相关的基因及蛋白进行检测和分析。随后,相同的三维培养方法分别将iMPCs与MSCs做成细胞小球,在不同的成软骨分化培养基中进行分化培养,通过RNA测序(RNA-sequencing)、RT-q PCR、硫酸化糖胺聚糖含量测定(GAG assay)、组织学及IHC以及进一步的体内实验(包括2周和3周的小鼠皮下包埋和8周的大鼠软骨缺损原位修复实验)对形成的软骨样组织进行表征。最后,在三维分化培养细胞小球的过程中选取不同时间点提取样本进行蛋白印迹法实验(Western blot,WB),分析转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGFβ)下游Smad通路信号分子的活化情况,并通过RT-q PCR进一步验证Smad通路下游基因的表达情况。随后,使用小分子抑制剂LDN193189明确Smad通路中Smad1/5在促iMPCs软骨分化过程中的决定性作用,通过RT-q PCR及组织学染色进行验证。提取初始状态的两种不同细胞,通过单细胞测序以及蛋白印迹法分析其TGFβ相关受体的分布及表达情况,进一步探讨TGFβ在两种细胞中差异表现的潜在机制。结果:人源诱导多能干细胞来源的多能前体细胞(hiPSCs-derived multipotent progenitor cells,iMPCs)的分化培养及特性在培养及分化iPSCs的过程中,细胞形态从最初的圆形(iPSCs阶段)到多边形(iMPCs-P0)再到纺锤状(iMPCs-P3-7)。流式细胞术证实了iMPCs具有间充质干细胞的表面标志物的表达(包括CD73+,CD90+,CD105+,CD45-,CD34-,CD31-)。同时从茜素红、阿尔新蓝、油红染色结果上显示iMPCs具有三系分化的能力,并在第3、5、7代iMPCs的染色结果以及细胞集落实验结果上的得出iMPCs具有传代衰老的表型。优化人源诱导式多能干细胞来源的多能前体细胞的成软骨诱导分化方案生成透明软骨样软骨组织随后,在优化iMPCs三维软骨诱导方案的结果中可见,在含有骨形态蛋白-6(bone morphogenetic protein 6,BMP6)和TGFβ3的成软骨分化培养基中培养21天的细胞小球具有相对最高的软骨相关基因(SOX9,ACAN,COL2)的表达以及最低的肥大相关基因(RUNX2,ALP,COL10,MMP13)的表达。组织学染色(番红/速绿染色)显示BMP4组,BMP4+TGFβ3组以及BMP6+TGFβ3组均有着较好的软骨基质生成的结果。而免疫组织化学的结果(COL2染色)显示BMP6+TGFβ3组具有最高的COL2沉积以及最低的肥大相关蛋白

关键词： 间充质干细胞   转化生长因子β3   成软骨细胞分化   嗅粘膜间充质干细胞   骨髓间充质干细胞  

摘要： 目的:探索在转化生长因子β3(transforming growth factorβ3,TGF-β3)刺激作用下骨髓间充质干细胞(bone marrow–mesenchymal stem cells,BM-MSCs)和嗅黏膜间充质干细胞(olfactory ecto-mesenchymal stem cells,OE-MSCs)成软骨分化能力的差异,为修复关节软骨损伤提供新的种子细胞。方法:(1)通过组织块贴壁法从SD大鼠双侧鼻中隔嗅黏膜分离出OE-MSCs,通过全骨髓贴壁法从SD大鼠双下肢股骨和胫骨骨髓腔分离出BM-MSCs,分别培养并传至第三代备用。(2)利用倒置相差显微镜观察细胞形态及排列生长情况。(3)采用茜素红S染色、油红O染色和阿尔新蓝染色分别检测细胞成骨、成脂及成软骨诱导分化情况。(4)采用CCK-8和划痕实验检测细胞的增殖与迁移能力。(5)RT-q PCR检测成软骨细胞相关基因COL2A1、SOX-9、Aggrecan的转录水平变化。(6)western blot检测成软骨细胞相关蛋白的相对表达水平。结果:(1)分离的OE-MSCs和BM-MSCs在细胞形态上符合MSCs的特征。(2)均具有成骨、成脂及成软骨多向分化潜能。(3)OE-MSCs的增殖和迁移能力明显强于BM-MSCs。(4)TGF-β3刺激下成软骨分化培养可见OE-MSCs和BM-MSCs形成半透明白色薄膜。(5)在转录水平上,TGF-β3可以增强BM-MSCs和OE-MSCs成软骨分化的COL2A1、Aggrecan基因的表达。不同是在成软骨分化中BM-MSCs中的SOX-9基因表达变化迟于OE-MSCs。总体上TGF-β3刺激的OE-MSCs组中成软骨相关基因COL2A1、SOX-9、Aggrecan的表达水平普遍高于BM-MSCs组。(6)在蛋白翻译水平上,TGF-β3刺激下BM-MSCs和OE-MSCs的Aggrecan表达差异出现相对较晚,而SOX-9和COL2A1在刺激第7天时表达水平即被增强。在BM-MSCs组中的Aggrecan和SOX-9的表达水平低于OE-MSCs组,然而COL2A1的表达情况相反,BM-MSCs组中更明显。结论:(1)OE-MSCs与BM-MSCs均具有间充质干细胞特性,在增殖和迁移能力上前者明显强于后者。(2)TGF-β3对OE-MSCs与BM-MSCs都有成软骨分化刺激作用,且前者表现优异。OE-MSCs也可能作为未来关节软骨修复策略的潜在候选者。

关键词： 牛   前体脂肪细胞   转化生长因子   增殖   分化  

摘要： 脂肪组织由大量的脂肪细胞参与组成,前体脂肪细胞的增殖和分化过程决定了机体脂肪组织的沉积量。适量肌内脂肪沉积是影响牛肉品质的关键因素,与肉牛生产效益密切相关。因此,研究调控牛脂肪细胞增殖与分化相关基因的功能及其机制对肉牛产业发展有着重要的意义。据报道转化生长因子-β3(transforming growth factor-beta 3,TGF-β3)和骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)基因能参与调控细胞增殖与分化过程,但有关TGF-β3和BMP-2基因对牛脂肪细胞增殖与分化影响的研究尚不多见。本实验室前期的研究结果显示,TGF-β3和BMP-2基因在牛的脂肪组织和成熟脂肪细胞中高表达,在牛前体脂肪细胞增殖和分化过程中TGF-β3和BMP-2基因的表达量发生显著变化。上述结果提示TGF-β3和BMP-2基因可能在牛前体脂肪细胞的增殖和分化过程中发挥重要作用。为进一步探明TGF-β3和BMP-2基因的细胞学功能,本研究以牛的前体脂肪细胞为体外研究材料,利用外源重组蛋白、特异性受体抑制剂和小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)等研究了TGF-β3和BMP-2基因在牛脂肪细胞增殖与分化过程中的表达规律,明确了TGF-β3和BMP-2基因在脂肪细胞增殖与分化中的作用,揭示了TGF-β3和BMP-2基因调控脂肪细胞增殖与分化的相关分子机制,以期在基因层面为调控牛脂肪沉积奠定理论基础。本研究分为五部分: ***-β3和BMP-2基因在牛不同组织及脂肪细胞中的表达模式分析 为探明TGF-β3和BMP-2基因在不同组织及脂肪细胞分化过程中的表达模式,本章选取4头24月龄西门塔尔公牛作为试验动物。动物屠宰后迅速采集肌内脂肪、皮下脂肪、心、肝、脾、肺、肾、肌肉等组织,并分离皮下前体脂肪细胞建立体外细胞增殖与分化模型。利用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-q PCR),免疫组化和油红O染色等试验技术检测了TGF-β3和BMP-2基因在不同组织及脂肪细胞中的表达,验证了体外细胞增殖与分化模型的可靠性。结果显示,TGF-β3和BMP-2基因在牛的各组织中均有表达,并在皮下脂肪组织中高表达。免疫组化试验结果确认了TGF-β3和BMP-2蛋白在脂肪组织中表达。分离的原代前体脂肪细胞生长状态良好,细胞边界清晰,形态表现为成纤维状,诱导分化第8天时油红O染色后可见大量脂滴形成,表现出成熟脂肪细胞特性。诱导分化过程中,TGF-β3及其受体基因在诱导分化前表达量高,分化第0 d时达到峰值,诱导分化后其表达显著降低(P<0.01)并在整个分化过程中保持一个低的表达水平;BMP-2及其受体基因则在分化前期和末期表达量较高,在分化中期处于一个低的表达水平。综上所述,本研究建立了体外前体脂肪细胞增殖与分化模型,揭示了TGF-β3和BMP-2基因在不同组织和脂肪细胞增殖与分化过程中的表达规律,为后续研究奠定了基础。 ***-β3和BMP-2重组蛋白对牛前体脂肪细胞增殖与分化的影响 脂肪细胞的增殖与分化涉及一个复杂的多基因调控网络,本研究旨在探明TGF-β3和BMP-2在牛前体脂肪细胞增殖与分化过程中的作用。分别添加TGF-β3和BMP-2外源重组蛋白处理牛的前体脂肪细胞,利用CCK8、RT-q PCR、Western blot和油红O染色等试验技术研究了外源重组蛋白处理对脂肪细胞增殖与分化的影响。结果显示,TGF-β3和BMP-2重组蛋白处理显著促进了牛前体脂肪细胞的增殖(P<0.01),其中10 ng/m L TGF-β3和100 ng/m L BMP-2促进效果最佳。分化早期TGF-β3重组蛋白处理减少了脂滴形成数量,显著降低脂肪细胞的脂质积累(P<0.01)及分化后24 h和8 d时成脂分化关键基因过氧化物酶体增殖物活化受体γ(peroxisome proliferatorctivated receptor gamma,PPARγ),CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein alpha,c/EBPα)和脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)的表达(P<0.01);而分化中期BMP-2重组蛋白处理增加了脂滴形成数量,促进了脂肪细胞的脂质积累(P<0.01),显著提高了脂肪细胞分化8 d时成脂分化关键基因PPARγ(P<0.01)和FABP4(P<0.05)的表达。上述研究结果表明TGF-β3能促进牛前体脂肪细胞增殖,抑制其分化,而BMP-2能促进牛前体脂肪细胞的增殖和分化。 3.干扰TGF-β3和BMP-2基因对牛前体脂肪细胞增殖