关键词： Smuff   2   P13K抑制剂   肾小管   上皮细胞  

摘要： 目的探讨体外条件下转化生长因子β1(TGF-β1)对人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)表达Smad泛素化调节因子2(Smurf2)的诱导情况,以及PI3K抑制剂LY294002对其的影响。方法应用RT-PCR法检测Smurf2 mRNA的表达,应用Western印迹法检测Smurf2蛋白的表达。结果HK-2细胞有基础量的Smurf2 mRNA和蛋白的表达,TGF-β1呈时间和剂量依赖性增加HK-2细胞Smurf2 mRNA和蛋白的表达(P<0.01)。PI3K抑制剂LY294002呈剂量依赖性抑制TGF-β1(100pM)所诱导的HK-2细胞Smurf2 mRNA和蛋白的表达(P<0.01)。结论在体外,TGF-β1可能通过PI3K/AKT通路诱导HK-2细胞Smurf2 mRNA和蛋白的表达。PI3K抑制剂LY294002可抑制Smurf2 mRNA和蛋白的表达。

关键词： 肺移植   细支气管炎,闭塞性   移植,异位   信号传导  

摘要： 目的探讨肺移植术后闭塞性细支气管炎的发生机理及转化生长因子(TGF)β1/Smad3信号传导途径在此病理过程中的意义。方法闭塞性细支气管炎动物模型采用 Smad3野生型和基因敲除小鼠进行的同种异体气管异位移植,免疫组织化学检测肌纤维母细胞分化的标志物——α平滑肌肌动蛋白(αSMA)的存在及差异。采用原代培养 Smad3野生型和敲除型气管纤维母细胞,经 TGF-β1处理,通过免疫荧光、Western 印迹和 DNA 凝胶电泳迁移率检测手段,检测 Smad3蛋白的激活。并用免疫荧光染色检测细胞骨架聚合能力和αSMA 分子的不同表达;Western 印迹和 RT-PCR法检测αSMA 在转录和蛋白水平的差异。结果在发生闭塞性细支气管炎的受累气道中,发现有肌纤维母细胞的存在,且其在 Smad3野生型中的数量明显多于敲除型(t=2.125,P=0.040)。对纤维母细胞进行的离体研究发现,TGF-β1诱导 Smad3激活,表现为蛋白磷酸化、细胞核转位和 DNA 结合增加。在 Smad3野生型的纤维母细胞,TGF-β1引起细胞骨架聚合能力增强、αSMA 在转录和蛋白水平的表达增强,即向肌纤维母细胞的分化增加;而在缺乏 Smad3的纤维母细胞中,TGF-β1诱导的肌纤维母细胞分化明显减少(t=2.080,P=0.027;t=1.982,P=0.032)。结论 TGF-β1主要通过激活Smad3依赖性信号传导途径,来促使纤维母细胞向肌纤维母细胞的转化和αSMA 蛋白的增加,最终导致闭塞性细支气管炎的发展。

关键词： 转化生长因子β   原位杂交   牙胚   发育  

摘要： 目的:探讨转化生长因子β3(TGFβ3)mRNA在小鼠磨牙牙胚发育过程中的表达及其意义。方法:制备小鼠磨牙各发育阶段标本,用原位杂交分析TGFβ3mRNA在牙胚中的表达与分布。结果:TGFβ3mRNA在小鼠磨牙牙胚不同发育阶段呈时间-空间特异性模式表达。TGFβ3mRNA在蕾状期和帽状期的上皮强表达,在牙胚发育晚期的成牙本质细胞和成釉细胞的表达随细胞分化程度而增强。结论:TGFβ3mRNA在牙形态发生过程中可能通过自分泌和旁分泌机制协同调控上皮-间充质相互作用及成牙本质细胞和成釉细胞的分化。

关键词： 贫血,再生障碍性   骨髓   间质干细胞   转化生长因子分化β   Smad3蛋白质   成脂分化  

摘要： 目的研究骨髓间充质干细胞(MSC)中转化生长因子β1(TGF-β1)与Smad3的表达下调与再生障碍性贫血(再障)发生的可能关系。方法取20例重型再障患者骨髓MSC,分离制备出Flk1+CD34–MSC后进行以下试验:①体外定向诱导MSC向脂肪细胞分化,倒置显微镜观察成脂分化情况,油红O染色法鉴定脂肪细胞,用实时荧光定量PCR检测分化过程中脂蛋白酯酶(LPL)基因的表达;②用蛋白质印迹法检测MSC中TGF-β1及Smad3的表达,用ELISA检测MSC分泌TGF-β1的能力;③观察不同剂量(0、5、10、15、20ng/ml)TGF-β1对再障患者骨髓MSC成脂分化和增殖的影响。以7名健康成人的骨髓MSC相应检测为对照。结果再障患者骨髓MSC经4d培养后即分化为脂肪细胞,而健康成人骨髓MSC中仅见少量细胞出现脂肪滴。再障患者MSC培养4和8d时LPL基因表达水平分别为0.091±0.028、0.142±0.033,均高于健康成人骨髓MSC(分别为0.021±0.011及0.049±0.010,均P<0.01);而TGF-β1及Smad3表达水平明显低于健康成人骨髓MSC,TGF-β1分泌水平(3.4μg/L±0.9μg/L)也明显低于健康成人骨髓MSC(11.6μg/L±1.2μg/L,P<0.01)。在向脂肪细胞分化过程中,仅加入5ng/ml的TGF-β1即可明显抑制再障患者骨髓MSC向脂肪细胞定向诱导分化,同时促进其增殖。结论再障患者骨髓MSC中TGF-β1及Smad3表达水平的显著下调可能参与了再障的部分发病环节。

关键词： 人胚肺成纤维细胞   腺病毒3I、7b   转化生长因子-β1   酶联免疫吸附试验   原位杂交  

摘要： 目的探讨3I、7b型腺病毒型感染对体外培养的人胚肺成纤维细胞转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA及其蛋白表达的影响。方法以3I、7b型腺病毒分别攻击体外培养的人胚肺成纤维细胞,另设正常细胞组。采用酶联免疫吸附试验及原位杂交法检测各组细胞TGF-β1蛋白及TGF-β1mRNA表达。结果3I、7b型病毒感染组较正常细胞组TGF-β1蛋白及mRNA表达均明显增强(Pa<0.01),而3I、7b型病毒感染组间比较无显著性差异(Pa>0.05)。结论肺成纤维细胞和TGF-β1可能参与腺病毒肺炎的发病过程。

关键词： inflammation   myofibroblast   pulmonary fibrosis   Smad3   tissue repair   transforming growth factor-beta (TGF-beta)  

摘要： Transient adencivinds-mriediated gene transfer of active TGF-beta 1 (transforming growth factor-beta 1) induces severe and progressive fibrosis in rodent lung without apparent inflammation. Alternatively, transfer of IL-1 beta (interleukin 1 beta) induces marked tissue injury and inflammation, which develops into progressive fibrosis, associated with an increase in TGF1 beta concentrations in lung fluid and tissue. Both vector treatments induce a fibrotic response involving myofibroblasts and progressive matrix deposition starting at the peri-bronchial site of expression and extending over days to involve the entire lung and pleural surface. Administration of the TGF-beta 1 vector to the pleural space induces progressive pleural fibrosis, which minimally extends into the lung parenchyma. The mechanisms involved in progressive fibrosis need to account for the limitation of fibrosis to specific organs (lung fibrosis and not liver fibrosis or vice versa) and the lack of effect of anti-inflammatofy treatments in regulating progressive fibrosis. TGF-beta 1 is a key cytokine in the process of fibrogenesis, using intracellular signalling pathways involving the ALKS receptor and signalling molecules Smac2 and Smad3. Transient gene transfer of either TGF beta 1 or IL-1 beta to Smad3-null mouse lung provides little evidence of progressive fibrosis and no fibrogenesis-associated genes are induced. These results suggest that mechanisms of progressive fibrosis involve factors presented within the context of the matrix that define the microenvironment for progressive matrix deposition.

关键词： 转化生长因子β   细胞极性   紧密连接部   Par-3   上皮细胞转分化  

摘要： 目的观察转化生长因子（TGF）β1诱导的正常大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E）转分化（EMT）过程中细胞极性蛋白Par-3的表达及上调Par-3蛋白表达对TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程的影响。方法应用TGF-β1（10μg／L）刺激NRK52E细胞，采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光方法分别检测E-钙黏蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Par-3 mRNA和蛋白的表达；应用Lipofectmine 2000将pKH3-HA-Par-3质粒瞬时转染NEK52E细胞，采用Western印迹观察上调表达Par-3对上述指标的影响。结果TGF-β1刺激后，NRK52E细胞α-SMA蛋白和mRNA水平上调，E-cadherin蛋白和mRNA的表达下调；Par-3蛋白表达呈时间依赖模式下调，72h TGF-β1刺激组与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。但Par-3 mRNA水平在各时间点差异均无统计学意义（P〉0．05）。脂质体转染外源性质粒pKH3-HA-Par-3上调表达Par-3可显著抑制TGF-β1诱导NRK52E细胞α-SMA蛋白的上调表达；逆转E-cadherin蛋白的下调表达。结论在TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程中细胞极性Par-3蛋白表达下调，基因转染上调表达Par-3可部分减轻EMT的程度，提示Par-3蛋白在TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和肾脏纤维化中可发挥保护性作用。

关键词： 转化生长因子β1   Smad3   骨髓间充质干细胞   细胞分化   组织工程  

摘要： 目的:探讨转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad3信号促进大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)成骨分化的机制。方法:常规细胞培养、免疫细胞化学染色观察TGF-β1作用下MSC中Smad3的表达情况;脂质体介导稳定转染Smad3中部分C端功能域突变体(Smad3△C),间接免疫荧光试验鉴定;采用RT-PCR检测转染细胞中碱性磷酸酶(ALP)和核心结合因子(cbfa1)mRNA的表达,用Gomori钙钴法定性检测ALP,用对硝基苯磷酸盐(PNP)法检测细胞ALP活性,观察Smad3△C对MSC成骨分化的影响。结果:MSC细胞表达Smad3,受TGF-β1刺激后,呈现出即刻由细胞质向细胞核转位的趋势。稳定转染细胞中c-Myc抗原阳性表达;受TGF-β1刺激后,MSC和空载体对照MSC(V-MSC)中ALP染色呈强阳性反应,而Smad3△C-MSC中阳性率仅为34.9%(P<0.01);MSC和V-MSC中ALP、cbfa1 mRNA的表达水平以及ALP活性明显高于Smad3△C-MSC(P<0.05或P<0.01),而MSC和V-MSC之间无显著性差异(P>0.05)。结论:MSC中的Smad3是作为TGF-β1信号转导通路下游转导介质而存在的;通过Smad3选择性调节,具有多重生物学效应的TGF-β才得以实现其促进MSC成骨分化的功能。

关键词： 腺病毒科   转化生长因子β   瘢痕,肥大性   伤口愈合  

摘要： 目的:观察腺相关病毒载体介导转化生长因子β3在防治增生性瘢痕愈合中的作用。方法:实验于2005-07/2006-10在青岛大学医学院创伤骨科研究所和中心实验室完成。①实验方法:通过改进的Morris法建立兔耳增生性瘢痕模型,术后将携带转化生长因子β3的腺相关病毒颗粒转染于增生性瘢痕愈合创面处。②实验评估:观察创面愈合情况,应用反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学染色法检测创面愈合组织中转化生长因子β3的表达;应用免疫印迹法检测主胶原Ⅰ,Ⅲ型胶原含量;应用氯胺-T法检测羟脯氨酸含量;评价腺相关病毒载体介导转化生长因子β3在防治增生性瘢痕愈合中的生物学效应。结果:①术后6个月,对照组瘢痕较前仍稍有增生,颜色淡红,质地硬。腺相关病毒载体介导转化生长因子β3转染组愈合创面稍突出皮面,颜色接近肤色,质地接近周围皮肤。②腺相关病毒载体介导转化生长因子β3转染组TGFβ3基因反转录-聚合酶链反应电泳条带亮度明显高于对照组。③腺相关病毒载体介导转化生长因子β3转染组创面愈合组织中羟脯氨酸的含量逐渐降低。至术后3个月,两组创面愈合组织中羟脯氨酸含量始于稳定,腺相关病毒载体介导转化生长因子β3转染组低于对照组(109.57±9.13,285.92±10.63)μg/g(t=2.98,P<0.05)。④免疫印迹检测显示腺相关病毒载体介导转化生长因子β3转染组创面愈合组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原构成比中Ⅲ型胶原的比例高于对照组。结论:①腺相关病毒载体可介导目的基因转化生长因子β3高效转染增生性瘢痕创面并有效防治增生性瘢痕愈合。②其作用可能是通过抑制创面愈合组织中羟脯氨酸的合成以及提高Ⅰ型和Ⅲ型胶原构成比中Ⅲ型胶原的比例实现的。

关键词： 淋巴   肾炎,间质性   纤维化   转化生长因子β1   Smad  

摘要： 目的探讨肾淋巴循环障碍对大鼠肾小管间质纤维化的作用及其与TGF-β1、Smad2/3表达变化的关系。方法雄性Wistar大鼠48只,随机分为淋巴循环障碍模型组和假手术对照组各24只。分别在术后1、2、4、8周每组各处死6只。测定尿蛋白量（24h）和Scr。PAS和Masson染色观察肾组织病理改变。用实时PCR检测TGF-β1、Smad2/3、Ⅰ型胶原（ColⅠ）mRNA的表达量。用免疫组化和（或）Western印迹方法检测肾组织ColⅠ、TGF-β1、Smad2/3和磷酸化Smad2/3（p-Smad2/3）的蛋白表达量及主要表达部位。结果模型组大鼠尿蛋白显著增加,随着时间推移肾功能逐渐减退,并出现明显的组织病理改变,小管间质损伤指数明显高于对照组（P＜0．05或P＜0．01）,并随时间延长而逐渐加重。肾组织中ColⅠ、TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3的蛋白和（或）基因表达水平也明显增高（P＜0．01）,且主要表达在肾小管上皮细胞及肾间质。结论肾淋巴循环障碍可导致大鼠肾脏功能及小管间质的损害,并随着时间的延长而加重。其作用机制可能与激活TGF-β-Smad途径,导致肾小管间质纤维化有关。