关键词： 肝硬化   转化生长因子β3   基质金属蛋白酶类   重组腺相关病毒  

摘要： 目的通过重组2型腺相关病毒（rAAV2）和基因转导，探讨转化生长因子β3（TGFβ3）对肝纤维化大鼠肝脏组织MMP-9、MMP-2、TIMP-1和Ⅰ型胶原表达的影响。方法将实验大鼠随机分为正常对照组、模型组、阴性对照组和TGFβ3干预组。用40％的四氯化碳（CCl4）复制大鼠肝纤维化模型。在CCl4诱导前1周，将rAAV2-TGFβ3注入大鼠尾静脉。造模8周后处死大鼠，取肝脏组织做HE染色观察肝脏组织学改变；免疫组织化学染色观察MMP-9、MMP-2、TIMP-1和Ⅰ型胶原的表达，并对其阳性面积比进行半定量分析。结果TGFβ3干预组与模型组和阴性对照组比较，肝脏组织炎性浸润明显减轻，纤维间隔增生减少，MMP-9的表达明显增加（q=23．664、27．746，P值均〈0．01），Ⅰ型胶原（q=5．503、5．251，P值均〈0．01）和TIMP-1（q=5．800、8．608，P值均〈0．01）的表达明显下降，但MMP-2表达的差异无统计学意义（q=2．108、0．996，P值均〉0．05）。结论rAAV2-TGFβ3可通过抑制大鼠肝脏组织内TIMP-1和Ⅰ型胶原的表达，促进MMP-9的表达，增加胶原纤维的降解，减轻肝脏组织学损伤和纤维化程度。

关键词： 骨髓间充质干细胞   藻酸盐   软骨分化   软骨组织工程  

摘要： 目的探讨β3转化生长因子（TGF-β3）在诱导骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向软骨细胞分化中胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的作用以及在软骨组织工程中的应用。方法在体外用TGF—β3或（和）IGF-1诱导藻酸钠微球中的MSCs向软骨细胞定向分化，免疫组织化学、逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖（aggrecan）的表达，Western印迹法检测Sox9蛋白的表达，激光共聚焦显微镜和扫描电镜观察该软骨细胞在壳聚糖支架上的生长。结果TGF-β3。能诱导藻酸钠微球中的MSCs表达软骨特异性的Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和Sox9，IGF-1能显著性地增强这种作用（P〈0．05）。Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和Sox9之间的相关系数分别为0．95和0．91。诱导的软骨细胞能在壳聚糖支架上黏附、迁徙、增殖。结论在TGF-β3诱导MSCs分化成软骨细胞地过程中，IGF-1可能通过促进Sox9的表达起到协同作用。诱导分化后的软骨细胞与壳聚糖复合支架表现出良好的组织相容性。

关键词： 转化生长因子β   干细胞   转染   细胞分化  

摘要： 目的探讨稳定表达重组转化生长因子-β3（hTGF-β3）对前软骨干细胞（precartilaginous stem cells，PSCs）增殖及向成软骨方向定向分化的诱导作用。方法免疫磁珠法分离纯化得到新生大鼠PSCs后，用线性化的聚乙烯亚胺转染pcDNA3．1（＋）-hTGF-β3到体外单层培养的PSCs中，抗生素筛选使其稳定表达。采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）、流式细胞术（FCM）测定转染对PSCs增殖和DNA合成的影响，实时定量RT-PCR、免疫组化及Western blot方法比较转染后目的基因和软骨特异性标志物表达的情况。结果hTGF-β3在分离纯化的PSCs中稳定表达。与未转染组细胞相比，转染后细胞DNA合成增多，增殖速度加快。PCR和免疫组化学结果表明，转染后软骨标志物基因上调明显，分泌软骨多糖基质及Ⅱ型胶原蛋白也明显增加。结论通过hTGF-β3基因强化的PSCs可以稳定表达高效的hTGF-β3蛋白，从而促进PSCs的增殖并向成软骨方向分化，为软骨缺损的高效修复提供了新的思路。

关键词： 成纤维细胞   Smad3   转化生长因子β1   RNA干扰   Ⅰ型胶原  

摘要： 目的观察siRNA-Smad3对TGF-β1诱导的肌成纤维细胞(C2C12)分泌Ⅰ型胶原的影响。方法用不同浓度的TGF-β1(0、1、5和10ng/mL)干预C2C12细胞24h,200pmol/L siRNA-smad3转染C2C12细胞24h,用ELISA和RT-PCR方法测定Ⅰ型胶原蛋白和mRNA表达。结果0、1、5和10ng/mL TGF-β1干预C2C12细胞,Ⅰ型胶原蛋白(ng/mL)检测结果分别为(616±16),(713±19),(783±23),(853±17),Ⅰ型胶原mRNA表达(Ⅰ型胶原/β-actin光密度比值)分别为(0.93±0.08),(1.83±0.17),(2.50±0.29),(2.94±0.14),三组间相互比较P均<0.01。200pmol/L siRNA-Smad3转染C2C12细胞24h后,用5ng/mL TGF-β1分别干预24h后检测Ⅰ型胶原蛋白:实验组、空白对照组、内对照组分别为(413±20)、(473±29)、(571±29)ng/mL;Ⅰ型胶原mRNA表达分别为(0.78±0.17)、(0.86±0.10)、(1.85±0.19)。内对照组表达增强(与实验组比较P<0.05)。结论TGF-β1促进C2C12细胞Ⅰ型胶原合成与mRNA表达呈剂量依赖性;siRNA阻断Smad3表达,抑制了TGF-β1促进Ⅰ型胶原合成与mRNA表达的作用。

关键词： 干扰素-α   转化生长因子-β1   Smad3   Smad7   肝纤维化  

摘要： 目的 肝纤维化是多种慢性肝病共有的组织学变化,肝星状细胞(HSC)的活化和增殖是肝纤维化形成的关键和中心环节。转化生长因子-β(TGF-β)是调控肝纤维化发生、发展的核心物质。Smads蛋白是TGF-β信号转导过程中最重要的胞内效应因子,它能将TGF-β信号由胞膜转入核内。Smad3过度表达及Smad7被抑制是肝组织纤维化的主要原因。IFN-α具有抗肝纤维化的作用。至于IFN-α对TGF-β/Smad信号转导通路中Smad蛋白家族是否有影响尚未见报道。本研究通过检测IFN-α对TGF-β刺激体外培养的HSC表达Smad3与Smad7的动态变化,探讨IFN-α对TGF-β刺激体外培养的HSC表达Smads蛋白的影响,阐明其抗肝纤维化机制,为临床肝纤维化的药物治疗提供更多的理论依据。 材料与方法 一、实验材料 1、大鼠肝脏星状细胞株(r-HSC99) 由北京大学人民医院冷希圣教授惠赠,由中国医科大学附属盛京医院感染科研究室保存。r-HSC99是经长期培养,传代后自发产生的,符合HSC的自然特征,是研究肝纤维化理想的实验模型。 2、主要试剂 TGF-β;重组人干扰素-α2b;β-actin引物、Smad3引物、Smad7引物、逆转录试剂盒;羊抗大鼠Smad3多克隆抗体;羊抗大鼠Smad7多克隆抗体。兔抗山羊IgG抗体。 二、实验方法 体外培养大鼠肝星状细胞系r-HSC99,分为TGF-β组、TGF-β+IFN-α组。分别应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法和免疫印迹(Western blotting)方法,测定各组于培养0、2、4、8、16、24小时,HSC表达Smad3、Smad7的mRNA及蛋白变化。 三、统计学处理 应用SPSS13.0软件进行分析,数据以均数±标准差表示,各组之间是否存在显著性差异分析采用LSD-t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。 实验结果 1、HSC表达Smad3、Smad7 mRNA的结果 0小时的Smad3 mRNA/β-actine值为0.524±0.022,TGF-β组2、4、8、16、24小时Smad3 mRNA/β-actine值分别为0.591±0.039、0.761±0.023、0.896±0.033、0.779±0.020、0.648±0.037;IFN-α+TGF-β组2、4、8、16、24小时Smad3mRNA/β-actine值分别为0.562±0.038、0.593±0.033、0.705±0.031、0.647±0.020、0.579±0.024。在TGF-β作用下,随着时间的增加,两组Smad3 mRNA表达均增加,在8小时达到高峰,之后开始下降,与0小时相比,Smad3 mRNA在4、8、16、24小时组差异均有统计学意义(P＜0.05);IFN-α+TGF-β组与TGF-β组按时间相比,IFN-α+TGF-β组Smad3 mRNA表达低于TGF-β组,在4、8、16小时组差异均有统计学意义(P＜0.05)。 0小时的Smad7 mRNA/β-actine值为0.513±0.135,TGF-β组2、4、8、16、24小时Smad7 mRNA/β-actine值分别为0.604±0.034、0.764±0.022、0.855±0.027、0.775±0.032、0.668±0.033;IFN-α+TGF-β组2、4、8、16、24小时Smad7mRNA/β-actine值分别为0.672±0.029、0.949±0.038、1.126±0.026、0.933±0.015、0.631±0.088。随着时间的增加,两组Smad7 mRNA表达均增加,在8小时达到高峰,之后开始下降,与0小时相比,Smad7 mRNA在4、8、16小时组差异均有统计学意义(P＜0.05);IFN-α+TGF-β组与TGF-β组按时间相比,IFN-α+TGF-β组Smad7 mRNA表达高于TGF-β组,在4、8、16小时组差异均有统计学意义(P＜0.05)。 2、HSC表达Smad3、Smad7蛋白的结果 0小时的Smad3蛋白/β-actine值为0.291±0.031,TGF-β组2、4、8、16、24小时Smad3蛋白/β-actine值分别为0.321±0.055、0.393±0.034、0.569±0.035、0.556±0.034、0.395±0.022;IFN-α+TGF-β组2、4、8、16、24小时Smad3蛋白/β-actine值分别为0.307±0.072、0.390±0.029、0.451±0.027、0.433±0.0220.330±0.026。在TGF-β作用下,随着时间的增加,两组Smad3蛋白表达均增加,在8小时达到高峰,之后开始下降,与0小时相比,Sma

关键词： 肝纤维化   转化生长因子-3   基因转导   组织病理   抗肝纤维化作用  

摘要： 目的:转化生长因子-3(TGF-3)是TGF-β家族的一员，近年来发现它在促进创面愈合和减轻瘢痕形成的过程中发挥重要作用。细胞外基质(ECM)的沉积增多或(和)降解减少是瘢痕组织形成的中心机制。肝纤维化的形成机制与其相似，但是TGF-3的抗肝纤维化作用则未见报道。因此，本实验通过基因转导，将2型重组腺相关病毒携带转化生长因子-3(rAAV2-TGF3)基因，观察其对肝纤维化大鼠肝脏组织病理学和I型胶原、MMP-9、MMP-2和TIMP-1表达的影响。　　 方法:(1)构建并验证rAAV2-TGβ3。(2)实验大鼠随机分为四组：TGF-3干预组、模型组、正常对照组和阴性对照组。用40[％]的四氯化碳(CCl4)诱导大鼠肝纤维化模型。在CCl4诱导前一周，将rAAV2-TGFβ3注入大鼠尾静脉，造模8周后处死大鼠，取肝脏组织做HE染色观察肝脏组织学改变;masson染色和免疫组织化学染色观察胶原纤维的变化和I型胶原、MMP-9、MMP-2和。TIMP-1的表达，并对其阳性面积比进行半定量分析。　　 结果:(1)HE染色：TGF-3干预组与模型组和阴性对照组相比，肝组织炎症浸润明显减轻，纤维间隔增生减少。(2)masson染色：大鼠胶原纤维主要分布在血管和汇管区及狄氏间隙。正常对照组、模型组、阴性对照组和TGF-3干预组的胶原纤维含量分别为(O.017±O.015)、(O.132±O.022)、(O.123±O.015)、(O.077±O.015)。与模型组和阴性对照组比较，TGF-3干预组大鼠肝脏组织内的胶原纤维含量明显下降(P均

关键词： 转化生长因子β3   前软骨干细胞   聚乙烯亚胺   干细胞   转染   细胞分化   组织工程   自组装肽   转化生长因子   基因强化基质   基因强化组织工程   支架   基因  

摘要： 目的： 为研究关节软骨与骺板损伤的基因治疗创造条件，构建人转化生长因子β3（TGF-β3）的真核表达载体，并转染大鼠前软骨干细胞（PSCs），以获得组织工程的种子细胞。探讨稳定表达重组TGF-β3对前软骨干细胞（PSCs）增殖及向成软骨方向定向分化的诱导作用。通过将软骨诱导活性的TGF-β3基因非共价结合于自组装多肽凝胶组织工程支架基质材料上，制备具有软骨诱导活性的新型基因活性基质材料（GAM），以促进种子细胞定向分化。对比基因强化组织工程的不同方法研究载基因介质与转基因介质对成软骨诱导分化的体外研究，来评价其成软骨诱导作用。 方法： （1）基因工程的方法重组构建pcDNA3.1（+）-hTGF-β3真核表达载体并鉴定：通过聚合酶链式反应（PCR）扩增编码hTGF-β3的编码序列（cds），在其启动子上游加XhoⅠ酶切位点，终止子下游加BamHⅠ酶切位点，双酶切载体pcDNA3.1（+）和hTGF-β3片段，回收后T4DNA连接酶连接，连接产物转化感受态DH5α，涂板孵育挑取阳性克隆，提取质粒，酶切、测序鉴定。 （2）免疫磁珠法分离纯化大鼠前软骨干细胞：在手术显微镜下（×10倍）钝性分离大鼠La Croix环，采用三步酶消化法获得含有PSCs的混合细胞。48小时后，按操作说明采用免疫磁珠分选系统纯化上述细胞，即可得到FGFR-3阳性细胞。将细胞种入培养瓶中培养。 （3）纳米级的高分子聚合物线性化的聚乙烯亚胺（PEI）共转染转染：pcDNA3.1（+）-hTGF-β3与pcDNA3.1-EGFP，PEI和DNA混合的量的N／P比5左右，48小时候终止转染。 （4）观察和检测瞬时转染后的表达情况：转染后48小时，收获细胞。提取总RNA，逆转录，PCR检测TGF-β3表达情况。收集转染后24hr，48hr，72hr，96hr，120hr时点转染组细胞和未转染组细胞培养上清液，采用双抗体夹心ELISA法，以TGF-β3纯品制作标准曲线，测定转染组与未转染组各代细胞培养上清液中TGF-β3蛋白的浓度。 （5）抗生素筛选稳定表达TGF-β3克隆：48h后终止转染，更换含有G418的培养基进行稳定筛选。至细胞阳性克隆形成后，挑取单克隆并扩大培养。 （6）噻唑蓝（MTT）检测增殖情况：将转染组和未转染组细胞按每孔5.0×10～3的密度接种至96孔板中，分别于0，24，48，72，96h加入浓度为5mg／ml MTT 20μl，置培养箱避光孵育4h，然后弃上清，加入150μl的DMSO。振荡充分溶解后，在酶标仪570nm波长度吸光度值，并绘制生长曲线。 （7）流式细胞术测定转染对PSCs增殖和DNA合成的影响：收集第2代细胞，分为未转染组与转染组，预处理后，上机检测，测定细胞周期，观察G1期、S期、G2期细胞各占的百分比。 （8） qRT-PCR检测成软骨基因表达情况：：收获转染组和未转染组细胞细胞，提取总RNA，逆转录。使用GAPDH作为内参照，实用Sybr Green法进行相对实时定量。相对转录水平通过比较Ct来确定。Y=2-ΔΔCt，ΔΔCt=ΔE-ΔC，ΔE=Ct转染组-CtGAPDH，ΔC=Ct未转染组-CtGAPDH。 （9）免疫组化及western blot的方法比较转染后目的基因和软骨特异性标志物表达的情况：取稳定表达TGFβ3的PSCs和未转染组细胞做爬片，用4℃固定液（丙酮：乙醇1：1）固定20min，免疫组化，HE，番红O等检测。取转染组和未转染组细胞，提取细胞总蛋白质，用BCA法测定样品蛋白浓度，取20ug总蛋白行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后转移至硝酸纤维素膜，剪取相应条带，加入用脱脂奶粉配成的1：200兔抗大鼠Ⅱ型胶原抗体或1：100的兔抗大鼠β-actin多克隆抗体的抗体稀释液，4℃封闭孵育过夜，PBS洗后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1：2000），37℃振荡孵育1h，漂洗后采用化学发光发检测，于暗室中曝光后洗片，扫描，灰度分析。 （10）用固相法合成KLD-12多肽并通过高压液相色谱及质谱仪纯化并鉴定；取0.5％（w／v）多肽在生理溶液条件自组装成多肽凝胶装物质，将TGF-β3质粒与KLD-12多肽间非共价键结合负载质粒并检测其DNA释放能力。 （11）实验分四组，A组取转染TGF-β3细胞与KLD-12混合，B组取PSCs细胞与载基因支架混合，C组取PSCs与KLD-12混合，D组为KLD-12支架。通过噻唑蓝（MTT）法检测细胞生长情况，qRT-PCR法检测成软骨基因表达情况Alcian Blue法检测软骨外基质sGAG含量。 结果

关键词： 子宫内膜异位症   整合素β3   转化生长因子β1   蛋白表达   发病机制  

摘要： 目的：探讨整合素β3(Integrinβ3)和转化生长因子β1(TGFβ1)在子宫内膜异位症中的表达，并探讨二者与该病发病关系及两者的相关性。　　 方法：采用免疫组化染色SP法分别检测Integrinβ3、TGFβ1在病例组子宫内膜异位症(20例在位内膜、20例异位内膜)以及20例对照组正常子宫内膜中的表达。　　 结果：Integrinβ3和TGFβ1在子宫内膜异位症患者的异位内膜与对照组同期正常子宫内膜的表达均有显著性差异(P<0.05)，在子宫内膜异位症患者的在位内膜与异位内膜的表达均有显著性差异(P<0.05)，两因子在各组分布呈相反趋势，但没有统计学意义。　　 结论：子宫内膜异位症患者从子宫内膜到异位病灶，整合素β3和TGFβ1均有明显的变化，这可能与子宫内膜异位症发生、发展有关。

关键词： 牙胚   移植   转化生长因子β3   基质金属蛋白酶2  

摘要： 目的:研究小鼠牙胚移植于口腔黏膜下前后TGF-β3和MMP-2的表达分布,探讨TGF-β3和MMP-2在牙胚钟状晚期以后发育中的调控作用,分析牙胚移植后发育的微观调控机制。 方法: 1.取近交系BALB/C小鼠出生后4天(4 days postnatal,4dpn)、11天(11dpn)、18天(18dpn)的未移植牙胚及移植入口腔黏膜下1周、2周后的牙胚,常规固定、脱钙、包埋、切片,用SP免疫组织化学染色法检测TGF-β3在各牙胚中的表达; 2.取近交系BALB/C小鼠出生后4天(4dpn)、7天(7dpn)、11天(11dpn)、18天(18dpn)的未移植牙胚及移植入口腔黏膜下1周、2周后的牙胚,常规固定、脱钙、包埋、切片,用SP免疫组织化学染色法检测MMP-2在各牙胚中的表达。 结果: ***-β3免疫组织化学染色结果 1.1未移植组:4dpn牙胚成釉细胞层、成牙本质细胞层呈强阳性表达,牙乳头周边区域细胞呈阳性表达,中间区域呈弱阳性表达;11dpn牙胚成釉细胞层呈弱阳性表达,成牙本质细胞层、牙乳头细胞呈阴性表达;18dpn牙胚牙周膜中的血管壁及周围呈强阳性表达,牙本质、牙骨质、牙周膜成纤维细胞呈阴性表达; 1.2移植组:移植后后1周的组织成釉细胞层、成牙本质细胞层呈阴性表达,颈部成牙本质细胞呈阳性表达,牙胚外周上皮组织呈强阳性表达;移植后2周的组织成牙本质细胞及成釉细胞呈阴性表达,仅见周围上皮层呈强阳性表达; ***-2免疫组织化学染色结果 2.1未移植组:4dpn牙胚外釉上皮、星网状层、中间层呈强阳性表达,成牙本质细胞层、前期牙本质、牙乳头呈阳性表达,成釉细胞层呈阴性表达;7dpn牙胚外釉上皮、星网状层、中间层及上皮根鞘处成牙本质细胞呈强阳性表达,牙乳头呈阳性表达,冠部成牙本质细胞及前期牙本质呈弱阳性表达,成釉细胞层呈阴性表达;11dpn牙胚近牙根处牙髓呈阳性表达,前期牙本质呈弱阳性表达,成牙本质细胞、成釉细胞呈阴性表达;18dpn牙胚牙本质、牙骨质、牙周膜均呈阴性表达; 2.2移植组:移植后1周的组织周围上皮呈强阳性表达,成釉细胞、成牙本质细胞及周边牙乳头呈阳性表达;移植后2周的组织周围上皮呈强阳性表达,成纤维细胞、炎性细胞呈阳性表达,牙体组织呈阴性表达。 结论: ***-β3及MMP-2在小鼠牙胚钟状晚期至发育完成过程中的表达具有一定的时空分布性,可能在牙胚的发育中有一定作用,这种作用可能随着牙胚的发育而逐渐减弱。 ***-β3及MMP-2对移植于口腔黏膜下的小鼠牙胚的发育也有一定的调控作用。