关键词： 转化生长因子β3   前软骨干细胞   聚乙烯亚胺   干细胞   转染   细胞分化   组织工程   自组装肽   转化生长因子   基因强化基质   基因强化组织工程   支架   基因  

摘要： 目的： 为研究关节软骨与骺板损伤的基因治疗创造条件，构建人转化生长因子β3（TGF-β3）的真核表达载体，并转染大鼠前软骨干细胞（PSCs），以获得组织工程的种子细胞。探讨稳定表达重组TGF-β3对前软骨干细胞（PSCs）增殖及向成软骨方向定向分化的诱导作用。通过将软骨诱导活性的TGF-β3基因非共价结合于自组装多肽凝胶组织工程支架基质材料上，制备具有软骨诱导活性的新型基因活性基质材料（GAM），以促进种子细胞定向分化。对比基因强化组织工程的不同方法研究载基因介质与转基因介质对成软骨诱导分化的体外研究，来评价其成软骨诱导作用。 方法： （1）基因工程的方法重组构建pcDNA3.1（+）-hTGF-β3真核表达载体并鉴定：通过聚合酶链式反应（PCR）扩增编码hTGF-β3的编码序列（cds），在其启动子上游加XhoⅠ酶切位点，终止子下游加BamHⅠ酶切位点，双酶切载体pcDNA3.1（+）和hTGF-β3片段，回收后T4DNA连接酶连接，连接产物转化感受态DH5α，涂板孵育挑取阳性克隆，提取质粒，酶切、测序鉴定。 （2）免疫磁珠法分离纯化大鼠前软骨干细胞：在手术显微镜下（×10倍）钝性分离大鼠La Croix环，采用三步酶消化法获得含有PSCs的混合细胞。48小时后，按操作说明采用免疫磁珠分选系统纯化上述细胞，即可得到FGFR-3阳性细胞。将细胞种入培养瓶中培养。 （3）纳米级的高分子聚合物线性化的聚乙烯亚胺（PEI）共转染转染：pcDNA3.1（+）-hTGF-β3与pcDNA3.1-EGFP，PEI和DNA混合的量的N／P比5左右，48小时候终止转染。 （4）观察和检测瞬时转染后的表达情况：转染后48小时，收获细胞。提取总RNA，逆转录，PCR检测TGF-β3表达情况。收集转染后24hr，48hr，72hr，96hr，120hr时点转染组细胞和未转染组细胞培养上清液，采用双抗体夹心ELISA法，以TGF-β3纯品制作标准曲线，测定转染组与未转染组各代细胞培养上清液中TGF-β3蛋白的浓度。 （5）抗生素筛选稳定表达TGF-β3克隆：48h后终止转染，更换含有G418的培养基进行稳定筛选。至细胞阳性克隆形成后，挑取单克隆并扩大培养。 （6）噻唑蓝（MTT）检测增殖情况：将转染组和未转染组细胞按每孔5.0×10～3的密度接种至96孔板中，分别于0，24，48，72，96h加入浓度为5mg／ml MTT 20μl，置培养箱避光孵育4h，然后弃上清，加入150μl的DMSO。振荡充分溶解后，在酶标仪570nm波长度吸光度值，并绘制生长曲线。 （7）流式细胞术测定转染对PSCs增殖和DNA合成的影响：收集第2代细胞，分为未转染组与转染组，预处理后，上机检测，测定细胞周期，观察G1期、S期、G2期细胞各占的百分比。 （8） qRT-PCR检测成软骨基因表达情况：：收获转染组和未转染组细胞细胞，提取总RNA，逆转录。使用GAPDH作为内参照，实用Sybr Green法进行相对实时定量。相对转录水平通过比较Ct来确定。Y=2-ΔΔCt，ΔΔCt=ΔE-ΔC，ΔE=Ct转染组-CtGAPDH，ΔC=Ct未转染组-CtGAPDH。 （9）免疫组化及western blot的方法比较转染后目的基因和软骨特异性标志物表达的情况：取稳定表达TGFβ3的PSCs和未转染组细胞做爬片，用4℃固定液（丙酮：乙醇1：1）固定20min，免疫组化，HE，番红O等检测。取转染组和未转染组细胞，提取细胞总蛋白质，用BCA法测定样品蛋白浓度，取20ug总蛋白行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后转移至硝酸纤维素膜，剪取相应条带，加入用脱脂奶粉配成的1：200兔抗大鼠Ⅱ型胶原抗体或1：100的兔抗大鼠β-actin多克隆抗体的抗体稀释液，4℃封闭孵育过夜，PBS洗后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1：2000），37℃振荡孵育1h，漂洗后采用化学发光发检测，于暗室中曝光后洗片，扫描，灰度分析。 （10）用固相法合成KLD-12多肽并通过高压液相色谱及质谱仪纯化并鉴定；取0.5％（w／v）多肽在生理溶液条件自组装成多肽凝胶装物质，将TGF-β3质粒与KLD-12多肽间非共价键结合负载质粒并检测其DNA释放能力。 （11）实验分四组，A组取转染TGF-β3细胞与KLD-12混合，B组取PSCs细胞与载基因支架混合，C组取PSCs与KLD-12混合，D组为KLD-12支架。通过噻唑蓝（MTT）法检测细胞生长情况，qRT-PCR法检测成软骨基因表达情况Alcian Blue法检测软骨外基质sGAG含量。 结果

关键词： 子宫内膜异位症   整合素β3   转化生长因子β1   蛋白表达   发病机制  

摘要： 目的：探讨整合素β3(Integrinβ3)和转化生长因子β1(TGFβ1)在子宫内膜异位症中的表达，并探讨二者与该病发病关系及两者的相关性。　　 方法：采用免疫组化染色SP法分别检测Integrinβ3、TGFβ1在病例组子宫内膜异位症(20例在位内膜、20例异位内膜)以及20例对照组正常子宫内膜中的表达。　　 结果：Integrinβ3和TGFβ1在子宫内膜异位症患者的异位内膜与对照组同期正常子宫内膜的表达均有显著性差异(P<0.05)，在子宫内膜异位症患者的在位内膜与异位内膜的表达均有显著性差异(P<0.05)，两因子在各组分布呈相反趋势，但没有统计学意义。　　 结论：子宫内膜异位症患者从子宫内膜到异位病灶，整合素β3和TGFβ1均有明显的变化，这可能与子宫内膜异位症发生、发展有关。

关键词： 牙胚   移植   转化生长因子β3   基质金属蛋白酶2  

摘要： 目的:研究小鼠牙胚移植于口腔黏膜下前后TGF-β3和MMP-2的表达分布,探讨TGF-β3和MMP-2在牙胚钟状晚期以后发育中的调控作用,分析牙胚移植后发育的微观调控机制。 方法: 1.取近交系BALB/C小鼠出生后4天(4 days postnatal,4dpn)、11天(11dpn)、18天(18dpn)的未移植牙胚及移植入口腔黏膜下1周、2周后的牙胚,常规固定、脱钙、包埋、切片,用SP免疫组织化学染色法检测TGF-β3在各牙胚中的表达; 2.取近交系BALB/C小鼠出生后4天(4dpn)、7天(7dpn)、11天(11dpn)、18天(18dpn)的未移植牙胚及移植入口腔黏膜下1周、2周后的牙胚,常规固定、脱钙、包埋、切片,用SP免疫组织化学染色法检测MMP-2在各牙胚中的表达。 结果: ***-β3免疫组织化学染色结果 1.1未移植组:4dpn牙胚成釉细胞层、成牙本质细胞层呈强阳性表达,牙乳头周边区域细胞呈阳性表达,中间区域呈弱阳性表达;11dpn牙胚成釉细胞层呈弱阳性表达,成牙本质细胞层、牙乳头细胞呈阴性表达;18dpn牙胚牙周膜中的血管壁及周围呈强阳性表达,牙本质、牙骨质、牙周膜成纤维细胞呈阴性表达; 1.2移植组:移植后后1周的组织成釉细胞层、成牙本质细胞层呈阴性表达,颈部成牙本质细胞呈阳性表达,牙胚外周上皮组织呈强阳性表达;移植后2周的组织成牙本质细胞及成釉细胞呈阴性表达,仅见周围上皮层呈强阳性表达; ***-2免疫组织化学染色结果 2.1未移植组:4dpn牙胚外釉上皮、星网状层、中间层呈强阳性表达,成牙本质细胞层、前期牙本质、牙乳头呈阳性表达,成釉细胞层呈阴性表达;7dpn牙胚外釉上皮、星网状层、中间层及上皮根鞘处成牙本质细胞呈强阳性表达,牙乳头呈阳性表达,冠部成牙本质细胞及前期牙本质呈弱阳性表达,成釉细胞层呈阴性表达;11dpn牙胚近牙根处牙髓呈阳性表达,前期牙本质呈弱阳性表达,成牙本质细胞、成釉细胞呈阴性表达;18dpn牙胚牙本质、牙骨质、牙周膜均呈阴性表达; 2.2移植组:移植后1周的组织周围上皮呈强阳性表达,成釉细胞、成牙本质细胞及周边牙乳头呈阳性表达;移植后2周的组织周围上皮呈强阳性表达,成纤维细胞、炎性细胞呈阳性表达,牙体组织呈阴性表达。 结论: ***-β3及MMP-2在小鼠牙胚钟状晚期至发育完成过程中的表达具有一定的时空分布性,可能在牙胚的发育中有一定作用,这种作用可能随着牙胚的发育而逐渐减弱。 ***-β3及MMP-2对移植于口腔黏膜下的小鼠牙胚的发育也有一定的调控作用。

关键词： 肝纤维化   干扰素-α   转化生长因子-β1   肝星状细胞   Smad3   Smad7  

摘要： 目的： 肝纤维化是多种慢性肝病共有的组织学变化，肝星状细胞(HSC)的活化和增殖是肝纤维化形成的关键和中心环节。转化生长因子-β1(TGF-β1)是调控肝纤维化发生、发展的核心物质。Smads蛋白是TGF-β信号转导过程中最重要的胞内效应因子，它能将TGF-β信号由胞膜转入核内。Smad3过度表达及Smad7被抑制是肝组织纤维化的主要原因。IFN-α具有抗肝纤维化的作用。至于IFN-α对TGF-β/Smad信号转导通路中Smad蛋白家族是否有影响尚未见报道。本研究通过检测IFN-α对TGF-β1刺激体外培养的HSC表达Smad3与Smad7的动态变化，探讨IFN-α对TGF-β1刺激体外培养的HSC表达Smads蛋白的影响，阐明其抗肝纤维化机制，为临床肝纤维化的药物治疗提供更多的理论依据。 材料与方法： 一、实验材料 1、大鼠肝脏星状细胞株(r-HSC99) 由北京大学人民医院冷希圣教授惠赠，由中国医科大学附属盛京医院感染科研究室保存。r-HSC99是经长期培养，传代后自发产生的，符合HSC的自然特征，是研究肝纤维化理想的实验模型。 2、主要试剂 TGF-β1;重组人干扰素-α2b;β-actin引物、Smad3引物、Smad7引物、逆转录试剂盒;羊抗大鼠Smad3多克隆抗体;羊抗大鼠Smad7多克隆抗体。兔抗山羊IgG抗体。 二、实验方法 体外培养大鼠肝星状细胞系r-HSC99，分为TGF-β1组、TGF-β1+IFN-α组。分别应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法和免疫印迹(Western blotting)方法，测定各组于培养0、2、4、8、16、24小时，HSC表达Smad3、Smad7的mRNA及蛋白变化。 三、统计学处理 应用SPSS13.0软件进行分析，数据以均数±标准差表示，各组之间是否存在显著性差异分析采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。 实验结果： 1、HSC表达Smad3、Smad7 mRNA的结果 0小时的Smad3 mRNA/β-actine值为0.524±0.022，TGF-β1组2、4、8、16、24小时Smad3 mRNA/β-actine值分别为0.591±0.039、0.761±0.023、0.896±0.033、0.779±0.020、0.648±0.037;IFN-α+ TGF-β1组2、4、8、16、24小时Smad3mRNA/β-actine值分别为0.562±0.038、0.593±0.033、0.705±0.031、0.647±0.020、0.579±0.024。在TGF-β1作用下，随着时间的增加，两组Smad3 mRNA表达均增加，在8小时达到高峰，之后开始下降，与0小时相比，Smad3 mRNA在4、8、16、24小时组差异均有统计学意义(P<0.05);IFN-α+TGF-β1组与TGF-β1组按时间相比，IFN-α+ TGF-β1组Smad3 mRNA表达低于TGF-β1组，在4、8、16小时组差异均有统计学意义(P<0.05)。 0小时的Smad7 mRNA/β-actine值为0.513±0.135，TGF-β1组2、4、8、16、24小时Smad7 mRNA/β-actine值分别为0.604±0.034、0.764±0.022、0.855±0.027、0.775±0.032、0.668±0.033;IFN-α+ TGF-β1组2、4、8、16、24小时Smad7mRNA/β-actine值分别为0.672±0.029、0.949±0.038、1.126±0.026、0.933±0.015、0.631±0.088。随着时间的增加，两组Smad7 mRNA表达均增加，在8小时达到高峰，之后开始下降，与0小时相比，Smad7 mRNA在4、8、16小时组差异均有统计学意义(P<0.05);IFN-α+ TGF-β1组与TGF-β1组按时间相比，IFN-α+ TGF-β1组Smad7 mRNA表达高于TGF-β1组，在4、8、16小时组差异均有统计学意义(P<0.05)。 2、HSC表达Smad3、Smad7蛋白的结果 0小时的Smad3蛋白/β-actine值为0.291±0.031，TGF-β1组2、4、8、16、24小时Smad3蛋白/β-actine值分别为0.321±0.055、0.393±0.034、0.569±0.035、0.556±0.034、0.395±0.022;IFN-α+ TGF-β1组2、4、8、16、24小时Smad3蛋白/β-actine值分别为0

关键词： 子宫内膜异位症   整合素β3   转化生长因子β1  

摘要： 目的探讨整合素β3(integrinβ3)和转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGFβ1)在子宫内膜异位症(endometriosis,EM)中的表达,并探讨其与EM发病的关系及两者的相关性。方法采用免疫组织化学染色(SP法)分别检测Integrinβ3、TGFβ1在EM的在位内膜、异位内膜以及在正常子宫内膜中的表达。结果整合素β3和TGFβ1两因子在EM患者的异位内膜与对照组同期正常子宫内膜的表达均有显著性差异(P<0.05),在EM患者的在位内膜与异位内膜的表达均有显著性差异(P<0.05),两因子在各组分布呈相反趋势但没有统计学意义。结论EM患者从子宫内膜到异位病灶,整合素β3表达有下降趋势而TGFβ1表达有上升趋势,两者均有明显的变化,这可能与EM发生、发展和不孕有关。

关键词： 转化生长因子β3   前软骨干细胞   聚乙烯亚胺  

摘要： 目的为骺板损伤的基因治疗创造条件,构建人转化生长因子的真核表达载体,并转染大鼠前软骨干细胞(PSCs),以获得组织工程的种子细胞。方法通过基因工程的方法重组构建pcDNA3.1(+)-hTGF-β3真核表达载体并鉴定,免疫磁珠法分离纯化大鼠前软骨干细胞后,用纳米级的高分子聚合物线性化的聚乙烯亚胺共转染pcDNA3.1(+)-hTGF-β3与pcDNA3.1-EGFP,观察和检测瞬时转染后的表达情况。结果重组质粒经过酶切电泳和测序鉴定证实构建成功,共转染后在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光,RT-PCR和ELISA可以检测到有目的基因的表达。转染后培养液上清中TGF-β3蛋白含量开始上升,在72h达到高峰,以后逐渐下降。结论真核表达载体hTGF-β3的重组质粒构建正确,并成功转染PSCs,为骺板损伤的组织工程学修复提供了新的选择。

关键词： 妊娠期高血压疾病   整合素β3   TGF-β1   免疫组化化学  

摘要： 目的研究转化生长因子-β1(TGF-β1)和整合素β3(Integrinβ3)在妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中的表达,并探讨其与妊娠期高血压疾病发病的关系。方法采用免疫组织化学染色(SP法)分别检测Integrinβ3、TGF-β1在12例妊娠期高血压疾病患者及13例正常妊娠者胎盘组织中的表达。结果妊娠期高血压疾病组胎盘Integrinβ3表达明显高于正常妊娠组(P<0.01)。妊娠期高血压疾病组胎盘TGF-β1表达亦明显高于正常妊娠组(P<0.01)。结论与正常妊娠组比较妊娠期期高血压疾病患者胎盘组织integrinβ3、TGF-β1的表达明均显增高。表明integrinβ3、TGF-β1可能参与妊娠期高血压疾病的发生和发展。

关键词： 软骨分化   骨髓基质干细胞   转化生长因子-β3  

摘要： 目的观察丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号途径中细胞外信号调节的激酶ERK途径在转化生长因子（TGF）-β3诱导的骨髓基质干细胞（MSCs）向软骨分化的过程中的作用。方法在体外培养大鼠的MSCs，在含有TGF-β3的诱导培养基中向软骨方向诱导分化，在诱导分化的不同时间点，分别用Western blot测定ERK1／2的表达和磷酸化。确定ERK1／2在分化过程中的变化，同时测定在分化的过程中MSCs与软骨分化相关基因的表达，之后用ERK1／2的抑制剂U0126，观察ERK1／2信号传导通路阻断后对软骨分化的影响。结果在TGF-β3促使MSCs向软骨方向分化的过程中，ERK1／2参与了细胞的分化和相关软骨基质的合成，ERK1／2抑制剂的使用削弱和减缓了上述过程的发生。结论ERK1／2途径在软骨分化过程中起重要作用。

关键词： 消癥煎膏   直肠给药   子宫肌瘤   转化生长因子-β3  

摘要： 目的研究消癥煎膏对大鼠子宫肌瘤以及子宫肌瘤中TGF-β3的影响。方法造模大鼠60只,随机分成5组,每组12只:实验组消癥煎膏分高、中、低3个剂量组,直肠给药;中桂组,予桂枝茯苓胶囊溶液灌服,每次0.5 m l/kg;模型组。另设空白组12只,每天灌服0.9%生理盐水,0.5 m l/kg/次,以上各组均给药3次/d,共4周。停药后第1天内处死大鼠,立即取标本实验研究。结果治疗组大鼠子宫重量明显减轻,宫颈和宫体处最大直径显著缩小,与模型组比治疗组子宫系数降低明显;实验组3个剂量的TGF-β3水平与模型组比较P<0.05,有显著意义;中桂组与模型组比较,P<0.05;模型组与空白组比较,P<0.01,有非常显著意义。结论消癥煎膏能使子宫肌瘤缩小,明显降低TGF-β3表达,抑制子宫肌瘤细胞增殖,使肌瘤缩小,因此推测其内可能含有TGF-β抗体类物质在起作用。

关键词： 大鼠肾小球系膜细胞   转化生长因子β1   信号转导通路   高糖状态   蛋白表达   活化   细胞转化生长因子β   细胞内信号转导  

摘要： JAK—STAT通路是近年发现的一组信号转导通路．能介导多种细胞因子和生长因子的细胞内信号转导过程。有研究提示JAK2-STAT3通路可能与系膜细胞的增殖、肥大及细胞外基质分泌有关。本研究旨在探讨高糖培养下大鼠肾小球系膜细胞JAK2-STAT3信号转导通路的活性变化及用AG-490（tyrphostin B42，JAK—STAT通路特异性阻断剂）抑制此通路活化对大鼠肾小球系膜细胞转化生长因子β1（TGF—β1）、纤连蛋白（FN）表达的影响，为进一步探讨JAK—STAT信号转导通路与糖尿病肾病发病机制的关系提供新的思路。