关键词： 肾小管上皮细胞转分化   转化生长因子β1   甲状旁腺激素   激素诱导   肾间质纤维化   肌成纤维细胞   TGF-β   纤维化作用  

摘要： 甲状旁腺激素（PTH）能够诱导体外培养的人肾小管上皮细胞转分化成肌成纤维细胞、并促进致纤维化的细胞因子转化生长因子β1（TGF-β1）表达上调，因此，PTH可能是造成肾间质纤维化的重要因素之一。1，25（OH）2D3具有防治肾间质纤维化的潜能。本研究探讨1，25（OH）2D3抗肾间质纤维化作用的机制。

关键词： 慢性肾功能衰竭   复方   转化生长因子β1   Smad2   Smad3   大鼠  

摘要： 目的:观察参芪解毒汤对腺嘌呤诱导的慢性肾衰大鼠肾脏组织转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、Smad2和Smad3蛋白表达的影响,探讨参芪解毒汤治疗慢性肾衰竭(chronic renal failure,CRF)的作用机制。方法:将90只健康Wistar雄性大鼠随机分成正常对照组、模型组、氯沙坦组、低剂量参芪解毒汤组、中剂量参芪解毒汤组和高剂量参芪解毒汤组。腺嘌呤灌胃复制慢性肾衰大鼠模型,检测造模后血浆肌酐(creati-nine,Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平判断造模是否成功。治疗8周后,检测血浆Cr、BUN、三酰甘油(triacylglycerol,TAG)、胆固醇(cholesterol,Chol)和白蛋白(albuminous,ALB)水平,HE染色观察大鼠肾脏组织病理学变化,蛋白印迹法检测肾组织TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白的表达情况。结果:与治疗前相比,氯沙坦组和低、中、高剂量参芪解毒汤组Cr、BUN水平明显降低(P<0.01);治疗后,各治疗组Cr、BUN和Chol水平低于模型组(P<0.01,P<0.05),ALB水平高于模型组(P<0.01)。病理结果显示,各治疗组大鼠的肾组织病理损伤明显轻于模型组。蛋白印迹法检测提示各治疗组肾组织TGF-β1、Smad2和Smad3的蛋白表达低于模型组(P<0.01)。结论:参芪解毒汤通过抑制TGF-β1/Smads信号传导通路发挥抗肾脏纤维化作用,减缓CRF进程。

关键词： 滋养细胞   侵袭   转化生长因子   血管内皮生长因子  

摘要： 目的:观察白细胞介素等多种细胞因子对绒癌细胞系表达转化生长因子-β3及血管内皮生长因子的影响。方法:将JEG-3细胞分别予12.5ng/mL白细胞介素-2、10ng/mL白细胞介素-3、50u/mL白细胞介素-6、5ng/mL白细胞介素-8、10ng/mL白细胞介素-10、10ng/mL白细胞介素-15、10ng/mL表皮生长因子、10ng/mL粒-巨噬细胞集落刺激因子、10ng/mL巨噬细胞集落刺激因子处理24h后,采用RT-PCR方法检测JEG-3绒癌细胞系中转化生长因子-β3及血管内皮生长因子的转录表达。结果:白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-6、白细胞介素-8、巨噬细胞集落刺激因子对转化生长因子-β3和血管内皮生长因子均表现出诱导表达的作用,表皮生长因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子仅诱导转化生长因子-β3的表达,白细胞介素-10则仅诱导血管内皮生长因子的表达,而白细胞介素-15则对JEG-3细胞表达转化生长因子-β3和血管内皮生长因子均无显著影响。结论:在调节滋养层细胞侵入的复杂细胞因子网络中,各种细胞因子之间存在相互影响。

关键词： 前软骨干细胞   转化生长因子β3   细胞外基质   自组装肽纳米凝胶  

摘要： 目的探讨软骨组织工程方法中修复软骨缺损理想的种子细胞和支架材料。方法免疫磁珠分离纯化新生大鼠前软骨干细胞(PSCs),分别采用KLD-12自组装肽纳米凝胶三维培养(实验组)和普通培养瓶平面培养(对照组),用转化生长因子β3(TGFβ-3)诱导两组PSCs向软骨细胞特性方向分化。利用RT-PCR、免疫组化等方法测定其向软骨细胞特性方向分化过程中特异性细胞外基质Ⅱ型胶原(collagenⅡ)和聚集蛋白聚糖(aggrecan)表达的情况。结果RT-PCR和免疫组化检测结果表明KLD-12自组装肽纳米凝胶组细胞在诱导7、14 d后均有collagenⅡ和aggrecan表达,且RT-PCR检测结果表明KLD-12自组装肽凝胶组细胞的collagenⅡ和aggrecan mRNA表达水平较对照组高,其差异有统计学意义(均P<0.05)。结论TGFβ-3诱导后的PSCs可向成软骨方向分化,诱导后的PSCs与KLD-12自组装肽凝胶复合有望构建组织工程化软骨,KLD-12自组装肽纳米凝胶是较好的软骨组织工程细胞支架。

关键词： 转化生长因子β3   瘢痕形成   创面愈合   TGF-β1   细胞生长因子   TGF-β2   细胞间基质   哺乳类动物  

摘要： TGF—β是指能调节细胞增殖、分化、细胞间基质蛋白表达的一类多功能细胞生长因子，其特征性表现是能可逆地抑制多种细胞的生长增殖。TGF-β至少有6种亚型，各亚型之间有64％～82％的同源性。目前在哺乳类动物中检测到TGF-β1、TGF-β2、TGF—β3种亚型，由于高度保守且对受体的亲和力各不相同，

关键词： 软骨   分化   骨髓基质细胞   基因克隆   生长转化因子-β3  

摘要： 目的 构建潜在相关肽（LAP）为潜伏位点,基质金属蛋白酶（MMP）切位点为导向位点,转化生长因子（TGF）-β3活性部分（mTGF-β3）为治疗位点的具有靶向治疗作用的新型TGF-β3融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3,并转染大鼠来源的骨髓基质干细胞（MSCs）,并检验其特异性的靶向治疗作用.方法 将人工合成的编码MMP酶切位点氨基酸的正反义DNA序列经基因重组定向克隆插入真核表达载体pIRES-EGFP中,获得pIRES-EGFP-MMP重组体,用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）从大鼠胚胎组织中获取TGF-β3的LAP（781 bp）段和TGF-β3的活性片段mTGF-β3（313bp）,分别插入pIRES-EGFP-MMP中MMP的上游和下游,获得pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3重组质粒.然后将其转染入大鼠来源的MSCs,将转染后的MSCs在有MMP-1和无MMP-1的条件下进行球团培养,分别于第7、14、21天检测胶原2（COLⅡ）,Aggrecan（Agc）和TIPM的表达.结果 经过测序和酶切鉴定,构建pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3质粒;转染MSCs后,我们成功获得了LAP-MMP-mTGF-β3融合蛋白（39 kDa）的表达,并验证了其只有在MMP酶环境中才能被激活生成具有生物学效应的特异性的mTGF-β3二聚体（22.2 kDa）;球团培养中,MMP酶存在的条件下第21天COLⅡ、Agc、TIPM的相对表达量分别为1.45±0.07、1.61±0.09、1.80±0.08,无MMP酶存在的条件下第21天COLⅡ、Agc、TIPM的相对表达量分别为0.42±0.09、0.38±0.15、0.27±0.07.结论 构建了一种新型具有靶向治疗作用的融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3.

关键词： 前软骨干细胞   转化生长因子β3   细胞外基质   自组装肽凝胶  

摘要： 目的利用前软骨干细胞（PSCs）作为软骨缺损修复的种子细胞并在KLD-12自组装肽纳米纤维凝胶中培养,以探讨软骨组织工程方法中修复软骨缺损理想的种子细胞和支架材料。方法免疫磁珠分离纯化新生大鼠PSCs,分别采用KLD-12自组装肽纳米纤维凝胶三维培养（实验组）和普通培养瓶平面培养（对照组）,用转化生长因子β3（TGF-β3）诱导两组PSCs向软骨细胞特性方向分化。利用RT-PCR、免疫组化等方法测定其向软骨细胞特性方向分化过程中特异性细胞外基质II型胶原（Collagen II）和聚集蛋白聚糖（Aggrecan）表达的情况。结果逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫组化结果表明KLD-12自组装肽纳米纤维凝胶组细胞在诱导7、14d后均有Collagen II和Aggrecan表达,且RT-PCR结果表明KLD-12自组装肽凝胶组细胞的Collagen II和Aggrecan mRNA表达水平较培养瓶组高,其差异有统计学意义（均p<0.05）。结论TGF-β3诱导后的PSCs可向成软骨方向分化,诱导后的PSCs与KLD-12自组装肽凝胶复合有望构建组织工程化软骨,KLD-12自组装肽纳米纤维凝胶是较好的软骨组织工程细胞支架。

关键词： 认知障碍   氧化应激   超微结构   Smad   认知功能障碍   海马组织   星形胶质细胞   TGFβ/Smad信号途径   糖基化终末产物   糖基化终末产物受体   星形胶质细胞   β-淀粉样蛋白前体蛋白  

摘要： 糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种常见的代谢性疾病,常伴发严重的微血管并发症,如肾衰竭、视网膜病变、周围神经病变等。近些年研究表明高血糖可以累及中枢神经系统,称为“糖尿病脑病”,其通常表现为认知功能的障碍和神经电生理的异常,同时伴有神经生化、神经结构和脑的退行性改变。目前,研究发现控制欠佳的糖尿病可以增加血管性痴呆和阿尔茨海默病的发病风险,导致学习和记忆障碍。但由于诊断DE仍缺乏明确的标准,因此很难被确诊,而“糖尿病性认知障碍”更容易被接受,对其病理生理机制的深入研究,已成为糖尿病并发症领域的研究热点之一。 Smad蛋白家族是TGF-β超家族细胞内信号转导过程中极其重要的介导分子,主要介导TGF-β1的生物学信息。Smad蛋白家族分为3个不同的亚族：受体调节型Smad蛋白(R-Smads,包括Smad2和Smad3)、共调节型Smad蛋白(Co-Smads,包括Smad4)和抑制性蛋白(I-Smads,包括Smad6和Smad7)。Smad2/3磷酸化与Smad4形成异聚复合体,将信号从胞浆转移到细胞核中,与其它转录协同因子和抑制因子共同调节下游靶基因的转录。TGF-β1/Smad通路参与胚胎发育、间质纤维化、肿瘤发生发展和炎症修复反应等诸多生物学过程,该通路的异常激活与诸多糖尿病相关并发症的病因密切相关,且此通路在β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein, APP)和β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)的转录调控中具有重要作用。因此,探讨TGF-β1/Smad2/3通路调控星形胶质细胞的生物学行为并促进糖尿病认知功能障碍的发生发展,有助于阐明其病理生理机理,并为临床上寻找新的治疗靶标提供坚实的理论依据。 本研究拟通过观察糖尿病大鼠的认知功能状态及Smad蛋白在糖尿病大鼠海马组织星形胶质细胞中的确切表达情况,并通过AGEs干预原代培养大鼠星形胶质细胞,进一步研究TGF-β1/Smad2/3通路在糖尿病性认知功能障碍发生发展过程中的功能角色,探讨其可能的病理生理机制。实验共分为三个部分：第一部分,观察糖尿病大鼠认知功能状态以及海马组织的超微结构；第二部分,观察pSmad2、pSmad3在糖尿病认知功能障碍大鼠海马组织星形胶质细胞中的表达水平以及GFAP、TGF-β1等的表达水平；第三部分,通过AGEs干预原代培养大鼠星形胶质细胞,不同时间点、不同浓度观察pSmad2、pSmad3、TGF-β1及目标蛋白APP、Aβ的表达水平,应用通路抑制剂干预,观察pSmad2和APP蛋白的表达水平。 第一部分糖尿病大鼠的认知功能状态及组织病理结构的观察 目的：研究糖尿病大鼠发病早期的认知功能状态和氧化应激相关酶类的活性水平,观察海马组织的病理变化。 方法：通过腹腔注射STZ(60mg·kg-1)制作糖尿病大鼠模型,72h后测定尾静脉末梢血糖≥16.7mmol·L-1为诱导糖尿病模型成功。将造模成功的大鼠随机分成4周DM和8周DM,正常对照组随机分成4周CON和8周CON,各组大鼠10只。于糖尿病发病8周时,利用Morris水迷宫实验检测其学习和记忆能力。实验连续5天,每天训练1次,每次将大鼠面向池壁从不同的四个方向作为入水点,观察并记录大鼠寻找并爬上平台所需的时间(逃避潜伏期)及距离。第5天实验结束后撤除平台,进行探索实验检测大鼠对原平台的记忆,测量其在60s内跨过原平台所在象限的时间占总时间的比例(Platform%)。Morris水迷宫实验结束后,腹主动脉采血,断头取脑,迅速留取双侧海马组织,测定大鼠血浆及海马组织中SOD、GSH-Px活性和MDA含量水平,并应用HE染色光镜和透射电镜观察海马组织结构的病理变化。 结果：在Morris水迷宫实验中,糖尿病大鼠在发病8周时出现认知功能障碍,逃避潜伏期(P<0.01)、游出距离显著大于CON(P<0.01),探索实验中Platform%显著低于CON(P<0.01)。DM大鼠血浆SOD(108.64±25.20 vs.209.10±28.06,P<0.01)、GSH-Px(280.69±33.64 vs.395.29±52.56,P<0.01)活性明显下降,与CON相比差异显著。而MDA水平较CON显著升高(7.21±1.33 vs.3.22±0.78,P<0.01)。海马组织SOD(10.85±2.11 Vs.20.05±4.17,P<0.01)、GSH-Px(19.85±3.96 vs.29.00±4.26,P<0.01)活性明显下降,MDA水平显著升高(5.08±0.78 vs.2.7±1.04,P<0.01),与CON相比差异显著。透射电镜观察下,CON大鼠海马

关键词： 四氯二苯对二恶英   地塞米松   腭裂   转化生长因子-β3   受体活化样激酶5  

摘要： 目的建立四氯二苯对二恶英(TCDD)和地塞米松(DEX)联合诱导C57BL/6J小鼠腭裂模型,并在腭发育关键时期检测转化生长因子-β3(TGF-β3)和受体活化样激酶5(Alk5)基因的表达,探讨TCDD和DEX联合诱导胎鼠腭裂与TGF-β3和Alk5的相关性。方法在小鼠GD10～GD12,实验组小鼠连续3d胃饲TCDD和腹腔注射DEX,空白对照组不做处理,于GD17.5体视显微镜下检测各组腭裂发生率,并于GD13.5、GD14.5、GD15.5分别剪取胎鼠腭突提取RNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测TGF-β3和Alk5基因表达。结果采用TCDD和DEX联合致畸,可诱导C57BL/6J胎鼠形成100%腭裂,建立了一种稳定适合分子生物学研究的腭裂动物模型。GD13.5时TGF-β3和Alk5基因表达水平在实验组与空白对照组之间差异均无统计学意义(P>0.05),在GD14.5、GD15.5实验组TGF-β3表达均降低(P<0.05),而Alk5表达均升高(P<0.05)。结论 TCDD和DEX联合作用可诱导C57BL/6J胎鼠形成稳定腭裂,在腭融合关键时期诱导TGF-β3表达下降,Alk5表达升高,与腭裂的发生具有一定的相关性。

关键词： 骨髓间充质干细胞   心肌素   平滑肌细胞   转化生长因子β3  

摘要： 间充质干细胞(MSCs)作为组织工程中最具优势的种子细胞,具有强的自我更新能力和多向分化潜能。本论文以骨髓间充质干细胞(BMMSCs)作为研究细胞分化信号转导的对象,发现转录因子心肌素(myocardin)在转化生长因子β3(TGF-β3)诱导的骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞(SMCs)分化中具有重要作用,并且深入研究了TGF-β3和myocardin诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化的分子机制。我们对诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞的定向分化及其分子机制的研究,为临床提供种子细胞治疗血管损伤修复奠定了实验基础。 TGF-β3是一种多功能的生物活性调节因子,广泛调控细胞增殖与分化等过程。使用TGF-p3处理骨髓间充质干细胞,RT-PCR和免疫细胞化学结果显示平滑肌细胞标志物,包括平滑肌肌浆球蛋白重链(SMMHC)x SM22α、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),都显著增高。这些结果说明TGF-β3可以诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化。 Myocardin是血清反应因子(SRF)的辅助激活转录因子,它在平滑肌细胞分化中起着重要的作用。利用RT-PCR和Western blotting的方法检测了转录因子myocardin在此分化过程中的表达情况,结果发现转录因子myocardin的mRNA和蛋白水平上调。同时将myocardin转染至骨髓间充质干细胞中,RT-PCR结果显示SMMHC、SM22α、 a-SMA都显著增高,荧光素酶活性实验证明在间充质干细胞中1myocardin可以激活SM22a启动子。进一步利用myocardin缺失转录激活域的真核表达质粒myocardinATAD竞争性抑制内源myocardin的功能,发现myocardin功能缺失后,TGF-p3不能诱导骨髓间充质细胞分化。这些结果说明1myocardin可以诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化,TGF-β3信号通路依赖或部分依赖于myocardin。 为深入研究TGF-β3和myocardin诱导的骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化的分子机制,利用RT-PCR方法检测TGF-β3通路的下游信号分子Smad2/3的mRNA水平,结果Smad2/3的mRNA水平显著升高,并且在TGF-β3刺激30分钟时Smad2/3迅速地发生磷酸化。荧光素酶活性实验进一步证明,Smad2能够与myocardin协同增加SM22α的启动子活性,而Smad3不具备这种能力。在缺失内源myocardin功能的骨髓间充质干细胞中,TGF-β3和其相关转录因子Smad2失去了对平滑肌分化标志物的上调功能。细胞周期抑制因子Rb、p16、 p21参与myocardin和TGF-β3诱导的骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化过程。