关键词： 认知障碍   氧化应激   超微结构   Smad   认知功能障碍   海马组织   星形胶质细胞   TGFβ/Smad信号途径   糖基化终末产物   糖基化终末产物受体   星形胶质细胞   β-淀粉样蛋白前体蛋白  

摘要： 糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种常见的代谢性疾病,常伴发严重的微血管并发症,如肾衰竭、视网膜病变、周围神经病变等。近些年研究表明高血糖可以累及中枢神经系统,称为“糖尿病脑病”,其通常表现为认知功能的障碍和神经电生理的异常,同时伴有神经生化、神经结构和脑的退行性改变。目前,研究发现控制欠佳的糖尿病可以增加血管性痴呆和阿尔茨海默病的发病风险,导致学习和记忆障碍。但由于诊断DE仍缺乏明确的标准,因此很难被确诊,而“糖尿病性认知障碍”更容易被接受,对其病理生理机制的深入研究,已成为糖尿病并发症领域的研究热点之一。 Smad蛋白家族是TGF-β超家族细胞内信号转导过程中极其重要的介导分子,主要介导TGF-β1的生物学信息。Smad蛋白家族分为3个不同的亚族：受体调节型Smad蛋白(R-Smads,包括Smad2和Smad3)、共调节型Smad蛋白(Co-Smads,包括Smad4)和抑制性蛋白(I-Smads,包括Smad6和Smad7)。Smad2/3磷酸化与Smad4形成异聚复合体,将信号从胞浆转移到细胞核中,与其它转录协同因子和抑制因子共同调节下游靶基因的转录。TGF-β1/Smad通路参与胚胎发育、间质纤维化、肿瘤发生发展和炎症修复反应等诸多生物学过程,该通路的异常激活与诸多糖尿病相关并发症的病因密切相关,且此通路在β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein, APP)和β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)的转录调控中具有重要作用。因此,探讨TGF-β1/Smad2/3通路调控星形胶质细胞的生物学行为并促进糖尿病认知功能障碍的发生发展,有助于阐明其病理生理机理,并为临床上寻找新的治疗靶标提供坚实的理论依据。 本研究拟通过观察糖尿病大鼠的认知功能状态及Smad蛋白在糖尿病大鼠海马组织星形胶质细胞中的确切表达情况,并通过AGEs干预原代培养大鼠星形胶质细胞,进一步研究TGF-β1/Smad2/3通路在糖尿病性认知功能障碍发生发展过程中的功能角色,探讨其可能的病理生理机制。实验共分为三个部分：第一部分,观察糖尿病大鼠认知功能状态以及海马组织的超微结构；第二部分,观察pSmad2、pSmad3在糖尿病认知功能障碍大鼠海马组织星形胶质细胞中的表达水平以及GFAP、TGF-β1等的表达水平；第三部分,通过AGEs干预原代培养大鼠星形胶质细胞,不同时间点、不同浓度观察pSmad2、pSmad3、TGF-β1及目标蛋白APP、Aβ的表达水平,应用通路抑制剂干预,观察pSmad2和APP蛋白的表达水平。 第一部分糖尿病大鼠的认知功能状态及组织病理结构的观察 目的：研究糖尿病大鼠发病早期的认知功能状态和氧化应激相关酶类的活性水平,观察海马组织的病理变化。 方法：通过腹腔注射STZ(60mg·kg-1)制作糖尿病大鼠模型,72h后测定尾静脉末梢血糖≥16.7mmol·L-1为诱导糖尿病模型成功。将造模成功的大鼠随机分成4周DM和8周DM,正常对照组随机分成4周CON和8周CON,各组大鼠10只。于糖尿病发病8周时,利用Morris水迷宫实验检测其学习和记忆能力。实验连续5天,每天训练1次,每次将大鼠面向池壁从不同的四个方向作为入水点,观察并记录大鼠寻找并爬上平台所需的时间(逃避潜伏期)及距离。第5天实验结束后撤除平台,进行探索实验检测大鼠对原平台的记忆,测量其在60s内跨过原平台所在象限的时间占总时间的比例(Platform%)。Morris水迷宫实验结束后,腹主动脉采血,断头取脑,迅速留取双侧海马组织,测定大鼠血浆及海马组织中SOD、GSH-Px活性和MDA含量水平,并应用HE染色光镜和透射电镜观察海马组织结构的病理变化。 结果：在Morris水迷宫实验中,糖尿病大鼠在发病8周时出现认知功能障碍,逃避潜伏期(P<0.01)、游出距离显著大于CON(P<0.01),探索实验中Platform%显著低于CON(P<0.01)。DM大鼠血浆SOD(108.64±25.20 vs.209.10±28.06,P<0.01)、GSH-Px(280.69±33.64 vs.395.29±52.56,P<0.01)活性明显下降,与CON相比差异显著。而MDA水平较CON显著升高(7.21±1.33 vs.3.22±0.78,P<0.01)。海马组织SOD(10.85±2.11 Vs.20.05±4.17,P<0.01)、GSH-Px(19.85±3.96 vs.29.00±4.26,P<0.01)活性明显下降,MDA水平显著升高(5.08±0.78 vs.2.7±1.04,P<0.01),与CON相比差异显著。透射电镜观察下,CON大鼠海马

关键词： 四氯二苯对二恶英   地塞米松   腭裂   转化生长因子-β3   受体活化样激酶5  

摘要： 目的建立四氯二苯对二恶英(TCDD)和地塞米松(DEX)联合诱导C57BL/6J小鼠腭裂模型,并在腭发育关键时期检测转化生长因子-β3(TGF-β3)和受体活化样激酶5(Alk5)基因的表达,探讨TCDD和DEX联合诱导胎鼠腭裂与TGF-β3和Alk5的相关性。方法在小鼠GD10～GD12,实验组小鼠连续3d胃饲TCDD和腹腔注射DEX,空白对照组不做处理,于GD17.5体视显微镜下检测各组腭裂发生率,并于GD13.5、GD14.5、GD15.5分别剪取胎鼠腭突提取RNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测TGF-β3和Alk5基因表达。结果采用TCDD和DEX联合致畸,可诱导C57BL/6J胎鼠形成100%腭裂,建立了一种稳定适合分子生物学研究的腭裂动物模型。GD13.5时TGF-β3和Alk5基因表达水平在实验组与空白对照组之间差异均无统计学意义(P>0.05),在GD14.5、GD15.5实验组TGF-β3表达均降低(P<0.05),而Alk5表达均升高(P<0.05)。结论 TCDD和DEX联合作用可诱导C57BL/6J胎鼠形成稳定腭裂,在腭融合关键时期诱导TGF-β3表达下降,Alk5表达升高,与腭裂的发生具有一定的相关性。

关键词： 骨髓间充质干细胞   心肌素   平滑肌细胞   转化生长因子β3  

摘要： 间充质干细胞(MSCs)作为组织工程中最具优势的种子细胞,具有强的自我更新能力和多向分化潜能。本论文以骨髓间充质干细胞(BMMSCs)作为研究细胞分化信号转导的对象,发现转录因子心肌素(myocardin)在转化生长因子β3(TGF-β3)诱导的骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞(SMCs)分化中具有重要作用,并且深入研究了TGF-β3和myocardin诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化的分子机制。我们对诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞的定向分化及其分子机制的研究,为临床提供种子细胞治疗血管损伤修复奠定了实验基础。 TGF-β3是一种多功能的生物活性调节因子,广泛调控细胞增殖与分化等过程。使用TGF-p3处理骨髓间充质干细胞,RT-PCR和免疫细胞化学结果显示平滑肌细胞标志物,包括平滑肌肌浆球蛋白重链(SMMHC)x SM22α、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),都显著增高。这些结果说明TGF-β3可以诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化。 Myocardin是血清反应因子(SRF)的辅助激活转录因子,它在平滑肌细胞分化中起着重要的作用。利用RT-PCR和Western blotting的方法检测了转录因子myocardin在此分化过程中的表达情况,结果发现转录因子myocardin的mRNA和蛋白水平上调。同时将myocardin转染至骨髓间充质干细胞中,RT-PCR结果显示SMMHC、SM22α、 a-SMA都显著增高,荧光素酶活性实验证明在间充质干细胞中1myocardin可以激活SM22a启动子。进一步利用myocardin缺失转录激活域的真核表达质粒myocardinATAD竞争性抑制内源myocardin的功能,发现myocardin功能缺失后,TGF-p3不能诱导骨髓间充质细胞分化。这些结果说明1myocardin可以诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化,TGF-β3信号通路依赖或部分依赖于myocardin。 为深入研究TGF-β3和myocardin诱导的骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化的分子机制,利用RT-PCR方法检测TGF-β3通路的下游信号分子Smad2/3的mRNA水平,结果Smad2/3的mRNA水平显著升高,并且在TGF-β3刺激30分钟时Smad2/3迅速地发生磷酸化。荧光素酶活性实验进一步证明,Smad2能够与myocardin协同增加SM22α的启动子活性,而Smad3不具备这种能力。在缺失内源myocardin功能的骨髓间充质干细胞中,TGF-β3和其相关转录因子Smad2失去了对平滑肌分化标志物的上调功能。细胞周期抑制因子Rb、p16、 p21参与myocardin和TGF-β3诱导的骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化过程。

关键词： 急性肺损伤   肺泡巨噬细胞   转化生长因子-βⅠ型受体  

摘要： 背景：急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是临床常见的危重急症,是由多种肺外致病危险因子导致的以血管通透性增加为主要临床表现的肺的炎症综合征,其发病机制非常复杂,死亡率高。其病理表现为肺泡腔内炎性细胞的浸润,肺泡毛细血管内皮损伤,通透性增加,肺水肿,最终导致肺泡壁完整性的破坏。早期肺损伤组织重建和晚期肺纤维化形成之间存在着密切关联。由于病因较多、发病机制不十分清楚,目前尚无有效的治疗方法。内毒素是导致ALI的重要因素之一。探索LPS导致的ALI发病的分子机制及新的干预靶点以减轻或防止ALI的发生和发展,具有重要的临床意义。 研究显示,转化生长因子-β(Transforming growth factor P, TGF-β)在包括肺部在内的多器官中的组织损伤均起关键性作用。活化的TGF-β在Ⅲ型受体的调节作用下,首先与2个Ⅱ型受体结合,再募集2个Ⅰ型受体形成复合体,磷酸化Ⅰ型受体的GS功能域,使其活化,随之活化的Ⅰ型受体再磷酸化相应的下游信号分子Smads蛋白发挥生物学效应。但具体哪几个TGF-βⅠ型受体亚型参与ALI的发生和发展过程尚不清楚。因此我们研究TGF-βⅠ型受体亚型ALK-1、2、3、5在正常肺组织和ALI发生和发展中的分布和变化规律,筛选出在ALI中高表达的受体亚型,以求达到减轻或防止ALI的作用。 目的：明确TGF-βⅠ型受体亚型ALK-1、2、3、5在正常肺组织和LPS所致的ALI中的分布和变化规律；探讨上述TGF-βⅠ型受体亚型在ALI中的表达,综合的分析TGF-βⅠ型受体亚型在ALI发生和发展中的分布和变化规律,为防治ALI提供新的理论依据。 方法：制作大鼠急性肺损伤的动物模型,通过实时荧光定量PCR(Real Time-PCR)技术来检测TGF-βⅠ型受体亚型在正常肺组织和ALI发生和发展中的分布和变化规律,结合肺组织的病理改变,筛选出有意义的TGF-βⅠ型受体亚型。 结果： ***染色的病理切片观察 HE染色可见各造模组均有程度不等的肺泡炎,肺泡腔内有不同程度的炎性细胞浸润。其中8h组炎症细胞浸润最明显,24h及48h组除炎细胞浸润外还可见肺泡腔内有淡红色液体渗出。72h组见肺水肿现象较前减轻,但仍有炎性细胞浸润。7天组见炎细胞数量减少,水肿液逐渐吸收。 *** Time-PCR结果显示： 与正常组相比,模型组ALI大鼠肺泡灌洗液中TGF-βⅠ型受体ALK-1 mRNA的表达于损伤后48h开始上升并随炎症时间的延长逐渐增高,于72h达高峰,后逐渐回落；而ALK-3 mRNA随着肺损伤时间延长呈逐渐上升趋势,于24h达到最高峰,后逐渐下降,至72h又再次升高,后逐渐下降。TGF-βⅠ型受体亚型ALK-5 mRNA表达于注射LPS后8h升高,随着损伤时间延长逐渐回落,于24h达到最低水平,后又逐渐升高,于7天达最高峰。ALK-2 mRNA在损伤后始终处于低表达状态,没有明显升高。运用重复测量资料的方差分析,各TGF-βⅠ型受体亚型随时间点的变化比较均为P＜0.05,有统计学意义。 结论： ALK-1、ALK-3、ALK-5在ALI发生发展过程中呈高表达,可能参与了ALI的发生发展。

关键词： 转化生长因子-β3   肝星状细胞   肝纤维化  

摘要： 目的:肝纤维化是由于过多的细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）在肝内沉积所致。转化生长因子（transforming growth factor,TGF）-β1能抑制肝细胞再生,促进肝星状细胞（Hepatic stellate cell,HSC）活化,使ECM合成增加,降解减少,在肝纤维化的发生、发展中具有重要的作用。临床研究发现在皮肤瘢痕的愈合过程中TGF-β3具有拮抗TGF-β1的作用,但TGF-β3与肝纤维化的关系尚未见报导,本研究旨在观察TGF-β3对大鼠HSC胶原合成和分泌的影响,探讨TGF-β3的抗肝纤维化作用。 方法:构建质粒pcDNA3. 1 （ + ）-TGF-β3和pcDNA3. 1 （ + ）-TGF-β1。稳定转染:通过脂质体介导的方法,将pcDNA3. 1 （ + ）-TGF-β1转染HSC-T6,经G418筛选建立稳定高表达pcDNA3. 1 （ + ）–TGF-β1的HSC-T6细胞阳性克隆。再将pcDNA3. 1 （ + ）–TGF-β3转染HSC-T6克隆细胞,用Western blot法和酶联免疫吸附法（ ELISA）分别检测细胞内外TGF-β1、Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase,MMP）-2、MMP-9及金属蛋白酶组织抑制剂（Tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP）-1的蛋白表达量。 结果:pcDNA3. 1 （ + ）-TGF-β3转染HSC-T6阳性细胞克隆后,与单纯阳性克隆组相比, TGF-β1、Ⅰ型胶原、TIMP-1细胞内蛋白表达及培养上清中的分泌水平均明显降低（ P < 0. 05） ,MMP-2的表达也降低,但两者间差异无统计学意义（ P > 0. 05） ,而MMP-9的表达明显增高（P < 0. 05）。 结论:重组质粒pcDNA3. 1 （ + ）-TGF-β3能减少肝星状细胞内外Ⅰ型胶原的合成及分泌,通过调节MMP-9及TIMP-1的表达,可抑制ECM的合成,促进其降解。

关键词： 血清白蛋白   转化生长因子β1   信号传导   肾小管上皮细胞   细胞培养  

摘要： 目的研究白蛋白对人肾小管上皮细胞（HK-2）分泌转化生长因子β1（TGF—β1）的影响，以及PI3K／Akt信号通路在这一过程中的作用。方法体外培养HK-2细胞，分为对照组、白蛋白（BSA）组和白蛋白加抑制剂（BSA＋Ly294002）组。分别于培养12、24、48h后，用MTT法检测HK-2细胞的增殖；RT-PCR检测HK-2细胞TGF-β1 mRNA的表达；Western印迹测定HK-2细胞TGF-β1和磷酸化的P13K（p—P13K）、Akt（p—Akt）蛋白分泌。结果白蛋白可明显诱导HK-2细胞增殖（P〈0．05），诱导后12hBSA组与对照组比较，TGF—β1 mRNA表达明显上调（0．472±0．025比0．233±0．021，P〈0．05）；TGF-β1蛋白明显上调（296±20．1比100±13．2，P〈0．05）；p-Pi3K、p-Akt蛋白表达显著增加（P〈0．05）。加Ly29400212h时HK-2增殖受抑制；48h时TGF—β1mRNA、蛋白和p-P13K、p-Akt蛋白的表达也受到抑制（均为P〈0．05）。结论白蛋白通过活化PI3-K／Akt信号转导通路诱导。肾小管上皮细胞产生TGF-β1。

关键词： 唇腭裂   转化生长因子β3   病例对照   关联  

摘要： 目的探讨中国部分地区人群非综合征型唇裂伴或不伴腭裂(nsCL/P)与转化生长因子β3基因CA重复序列多态性之间的关系。方法采用PCR-单链构象多态性方法,对170个nsCL/P核心家庭成员DNA标本进行TGFβ3 CA重复序列多态性的检测。利用传递不平衡检验(TDT)、基于单体型的单体型相对危险度检验(HHRR)和运用家系为基础的相关性检验(FBAT)检验分析该突变与nsCL/P发生之间的关系。结果TDT(OR=1.38,95%CI0.93～2.06)和HHRR(OR=1.31,95%CI0.93～1.84)检验发现,TGFβ3 CA重复序列多态性与nsCL/P发生之间的关联不具有统计学意义(P>0.05),但是FBAT检验发现在显性和隐性模型中,TGFβ3基因多态性与nsCL/P发病危险之间的关联具有统计学意义(P<0.05)。结论TGFβ3 CA重复序列多态性可能是中国部分地区人群发生nsCL/P的危险因素,但还有待于扩大样本量进一步加以验证。

关键词： 转化生长因子   绒毛膜肿瘤JEG-3细胞   基质金属蛋白酶-9基因   基质金属蛋白酶抑制剂-1基因  

摘要： 目的探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)不同浓度和作用时间对绒癌JEG-3细胞基质金属蛋白酶-9基因(MMP-9 mRNA)及基质金属蛋白酶抑制剂-1基因(TIMP-1 mRNA)表达的影响。方法先分别用TGF-β10、100、200 ng/ml作用于绒癌JEG-3细胞,48 h收获细胞;再以TGF-β1100 ng/ml分别与JEG-3细胞作用0、12、24、48、72h;最后用RT-PCR技术检测TGF-β1不同浓度和作用时间收获JEG-3细胞的MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表达。结果随TGF-β1浓度升高和作用时间延长,各收获细胞的MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表达均明显升高,且MMP-9 mRNA与TIMP-1 mRNA比值均>1(P<0.01或<0.05)。结论在一定浓度和作用时间内,外源性TGF-β1可促进绒癌JEG-3细胞MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表达。

关键词： 肝炎,乙型,慢性   T淋巴细胞,调节性   转化生长因子β  

摘要： 目的调查慢性乙型肝炎患者转化生长因子β1（TGF β1）与CD4^＋CD25^＋Foxp^3＋调节性T淋巴细胞异常的关系。方法将实验对象分为慢性乙型肝炎（CHB）患者、无症状HBV携带者（AsC）、乙型肝炎恢复者、正常人对照4组。通过流式细胞术分析外周CD4^＋CD25^＋Foxp^3＋调节性T淋巴细胞的表型和频率以及实时荧光定量PCR分析Foxp3表达水平；并通过酶联免疫吸附法检测血清中TGF β1水平。根据数据不同采用方差分析或秩和检验进行统计学分析。结果CHB或AsC组外周CD4^＋T淋巴细胞中CD4^＋CD25^＋Foxp^3＋T淋巴细胞频率以及CD4^＋CD25^＋T淋巴细胞中Foxp3 mRNA表达水平显著高于正常人对照组，差异有统计学意义（P〈0．05）。CHB患者和AsC血清中TGF β1水平显著高于正常人和乙型肝炎恢复者，并与CD4^＋CD25^＋Foxp^3＋T淋巴细胞频率存在显著正相关（r=0．78，P〈0．01）。结论CHB和AsC患者TGF β1与CD4^＋CD25^＋Foxp^3＋调节性T淋巴细胞增高有密切关系。

关键词： 脂多糖类   骨化三醇   受体   骨化三醇   腹膜透析   腹膜炎   肿瘤坏死因子α   转化生长因子β1  

摘要： 目的研究脂多糖（LPS）对大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）维生素D受体（VDR）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响，从而为1，25（OH）2D，在腹膜透析相关腹膜炎中的应用提供理论依据。方法胰蛋白酶消化法原代培养腹膜间皮细胞、传代、经鉴定后分组：（1）正常对照组；（2）脂多糖组：不同浓度的脂多糖（1、10、100mg／L）分别作用6h；10mg／L脂多糖分别作用2、6、12h；（3）1，25（OH）2D3作用组：10mg／L脂多糖预孵育2h后，加1，25（OH）2D3（10^-8mol／L、10^-7mol／L、10^-6mol／L）再作用6h。RT-PCR法检测VDRmRNA的表达；Western印迹法检测VDR蛋白表达；ELISA法检测上清液TNF—α、TGF-β1的表达。结果与对照组相比，LPS组RPMCVDRmRNA和蛋白表达均显著下调（均P〈0．05）。与LPS组相比，1，25（OH）2D3组VDRmRNA和蛋白表达均显著上调（均P〈0．01）。LPS组上清液中TNF-α、TGF—β1浓度均显著高于对照组（均P〈0．01）；1，25（OH）2D3组上清液中TNF-α、TGF-β1浓度均显著低于LPS组（均P〈0．01）。结论LPS能下调RPMCVDRmRNA和蛋白的表达，上调TNF-α、TGF—β1表达。1，25（OH）2D3可逆转LPS的作用，上调RPMCVDR mRNA和蛋白的表达，并下调TNF—α、TGF—β1表达。VDR对腹膜透析相关腹膜炎具有一定的保护作用，并具有抑制腹膜纤维化的作用。