关键词： 转化生长因子β1   人肺上皮细胞   上皮-间质细胞转分化   磷脂酰肌醇3激酶   丝氨   酸/苏氨酸蛋白激酶  

摘要： 目的:探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)通路在转化生长因子β1(TGF-β1)体外诱导的人肺上皮细胞A549间充质化过程中的作用。方法:将体外培养的A549细胞随机分成3组:正常对照组、TGF-β1组及抑制剂组,正常对照组不加入TGF-β1,TGF-β1组加入10ng/mLTGF-β1,抑制剂组加入TGF-β1(10ng/mL)和PI3K的抑制剂Ly294002(10nmol/L),72h后通过RT-PCR检测各组A549细胞上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cad)及间充质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的变化,ELISA方法检测间充质细胞标志物纤连蛋白(Fn)表达的变化,Westernblot检测Akt磷酸化(p-Akt)水平的变化。所有实验至少重复3次。结果:正常体外培养的A549细胞有E-cad表达及微量的α-SMA、Fn、p-Akt表达;TGF-β1组E-cad的表达下调,α-SMA、Fn、p-Akt的表达上调;抑制剂组与TGF-β1组比较E-cad的表达上调,α-SMA、Fn、p-Akt的表达明显抑制。结论:PI3K/Akt途径参与TGF-β1介导的肺上皮-间质细胞转分化过程,PI3K特异性抑制剂Ly294002可有效抑制TGF-β1介导的肺上皮-间质细胞转分化过程。

关键词： 转化生长因子β3   结缔组织生长因子   基质金属蛋白酶抑制剂1   慢病毒   293细胞   基因治疗  

摘要： 背景:前期试验显示单个病毒载体介导的多基因共表达系统能够显著提高椎间盘退变转基因疗效。目的:构建人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因重组慢病毒多表达质粒。方法:应用全基因合成技术,以"自剪切多肽2A"串联目的基因,并克隆到慢病毒表达质粒构建重组慢病毒质粒Lenti-TGF-β3-P2A-CTGF-T2A-TIMP1。转染293细胞后,应用RT-PCR和Western-Blot技术分别检测转染后不同时间点目的基因mRNA和蛋白质表达水平。结果与结论:RT-PCR和Western-blot技术检测结果显示重组质粒成功表达了3种目的基因,并于转染后48h左右达到峰值,"2A"结构下游基因蛋白质表达量约为上游基因的80%。说明成功构建了携带人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因的慢病毒多表达质粒。

关键词： 干扰素γ   上皮-间充质转化   胞外调节激酶1/2   信号转导和转录激活因子3  

摘要： 目的探讨干扰素γ（IFN-γ）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的A549细胞上皮-间充质转化（EMT）过程的作用及对胞外调节激酶1／2（ERK1／2）和信号转导和转录激活因子3（STAT3）的作用。方法①体外培养A549细胞，分为TGF-β1，处理组（5μg／L）、IFN-γ处理组（200μg／L）和TGF-1β（5μg／L）＋IFN-γ（10、100、200μg／L）联合处理组。处理时间48h，免疫荧光及Western blot方法检测各组细胞E-钙黏素（E-eadherin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白（vimentin）和纤维连接蛋白（fibronectin）的蛋白表达。②处理不同时间（5、30和60min），Western blot方法检测各组细胞STAT3、p—STAT3和ERK1／2、p-ERK1／2的蛋白表达。结果①与TGF-t31单独处理组相比，IFN-7（200μg／L）＋TGF-1β联合处理组vimentin和fibronectin的蛋白表达减低（P〈0．05），而α-SMA和E—cadherin蛋白表达无显著变化。②作用后5、30和60min，IFN-γ（200μg／L）＋TGF-1β联合处理组STAT3磷酸化水平显著升高（P〈0．01）。作用后5、60min，IFN-γ（200μg／L）＋TGF-1β联合处理组ERK1／2磷酸化水平升高（P〈0．05）。结论IFN-γ可在体外抑制TGF-1β。诱导的A549细胞发生EMT，其机制可能与上调ERK1／2和STAT3信号通路有关。

关键词： 成纤维细胞   补体   胶原   转化生长因子β1  

摘要： 目的 观察补体片段C3f对人胚肺成纤维细胞（MRC-5）表达和分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原及转化生长因子（TGF）-β1的影响.方法 将人工合成的17肽片断C3f加入培养基中刺激MRC-5细胞,通过细胞免疫组化和ELISA法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1细胞内、外表达情况.结果 随着C3f浓度的增加,MRC-5细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGF-β1的表达量逐渐降低,与对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）.MRC-5胞质中TGF-β1的表达量随C3f浓度增加降低趋势,与对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 C3f能够抑制MRC-5细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGF-β1的形成,减轻肺组织的纤维化程度.

关键词： 骨髓间充质干细胞   骨形态发生蛋白2   转化生长因子β3   脂质体  

摘要： 目的：本实验旨在通过阳离子脂质体包埋BMP-2, TGF-β3双基因修饰质粒转染骨髓间充质干细胞,观察BMP2及TGFβ3在细胞内表达及对细胞增殖活性的影响,为下一步研究双基因表达载体对间充质干细胞成骨分化影响奠定基础。 方法：全贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞,进行原代和传代培养,取P2代细胞进行转染,分别将pIRES/BMP-2、 pIRES/TGFp3、 pIRES/BMP2-TGFp3及空质粒转染入干细胞,并设置空白对照组,转染两天后RT-PCR检测各组BMP2及TGFβ3的表达情况,绘制细胞生长曲线,计算细胞倍增时间,比较各组干细胞的增殖情况。 结果：pIRES/BMP2-TGFβ3转染组BMP2及TGFβ3mRNA含量高于单基因组及空白对照组(p<0.05),双基因均可获得稳定表达；双基因组细胞倍增时间较单一组及空白对照组明显缩短(p<0.05),双基因组具有良好的促进BMCs增殖作用。 结论：双基因修饰质粒转染干细胞可以再细胞内获得稳定的表达,并具有良好的协同促干细胞增殖活性,为进一步研究双基因质粒对诱导间充质干细胞成骨的影响及两者之间的协同效应提供理论基础。

关键词： 转化生长因子β3   病理性瘢痕   瘤样增生   功能障碍  

摘要： 实验目的　　 瘢痕是人体创伤愈合过程的必然产物,是进行组织修复的一种机制。病理性瘢痕是以胶原等大量结缔组织的基质过度沉积为特征的皮肤纤维化疾病,包括增生性瘢痕及瘢痕疙瘩。主要表现为明显的瘤样增生和功能障碍。近年来,随着细胞生物学和分子生物学在瘢痕形成机理方面研究的深入,人们逐渐发现细胞因子在病理性瘢痕的形成中起重要作用,其中,转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)的作用较为肯定。我们通过研究TGF-β3在病理性瘢痕中的表达情况,探讨TGF-β3在病理性瘢痕形成中所发挥的作用,为临床治疗及预防病理性瘢痕的发生提供理论依据。　　 实验方法　　 收集中国医科大学第一附属医院2009年-2011年经手术切除后弃用的病理性瘢痕55例,作为实验组,根据临床表现及病理性质将其进行分组,其中包括瘢痕疙瘩A组15例,增生性瘢痕增值活跃期期B组20例,增生性瘢痕成熟稳定期C组20例。选取浅表性瘢痕25例及正常皮肤8例作为对照组,分别设为D组、E组。在室温下,标本进行石蜡包埋制作蜡块,切片厚度为3μm。每例切4张,一张做HE染色,两张做免疫组织化学染色,一张用于阴性对照。常规脱蜡至水,以3%双氧水消除内源性过氧化酶氧化物酶活性,高压修复1.5min,山羊血清阻断非特异性抗原孵育10min后,每例标本分别加入TGF-β3一抗工作液,4℃湿盒过夜,滴加生物素化二抗工作液,滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,其间分别用PBS冲洗3min*3次/min。DAB显色,复染、脱水、透明,封片。以PBS代替一抗进行阴性对照。显微镜下观察,照相。根据阳性细胞表达率及阳性细胞着色程度的差异,采用SPSS17.0统计软件进行非参数Mann-WhitenyUtest统计学分析,p＜0.05,具有统计学意义。　　 实验结果　　 病理性瘢痕及浅表性瘢痕组织中TGF-β13蛋白阳性表达的细胞胞浆着棕黄色,主要包括上皮基底层细胞和成纤维细胞,血管内皮细胞内也有微弱的阳性染色。免疫组化结果表明:实验组的阳性率分别为A组40.00%;B组45.00%;C组70.00%;对照组D组88.00%;E组0.00。实验组中,A、B两组比较,差异无统计学意义(p＞0.05);B、C两组比较,差异具有统计学意义(p＜0.05)。实验组A、B、C组分别与对照组D组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05)即TGF-β3在病理性瘢痕组织中的表达低于正常瘢痕组织,而正常皮肤组织中TGF-β3呈弱阳性或阴性表达。　　 实验结论　　 ***-β3在病理性瘢痕组织中的表达低于浅表性瘢痕组织。　　 ***-β3在瘢痕疙瘩及增生性瘢痕不同时期的表达量不同,所起到的作用不同。　　 ***-β3表达水平的降低可能是病理性瘢痕形成的重要诱因之一。

关键词： 柠檬醛   维甲酸受体   转化生长因子   鸡胚   视黄醛脱氢酶  

摘要： 目的观察柠檬醛在鸡胚发育过程中引起腭发育相关组织缺损的形态学变化,检测与腭发育相关的鼻突组织细胞中维甲酸受体β (RARβ)和转化生长因子β3(TGFβ3)的表达。探索维甲酸与TGF β3信号分子对腭发育及腭缺损的影响。 方法(1)将20期鸡胚按随机原则分为7组,实验组按CT浓度分为6组,0.001g/ml、0.01g/ml、0.05g/ml、0.1g/m1、0.5g/m1、0.88g/ml,对照组为二甲基亚砜(DMSO)组,另设空白对照组。 (2)每组20例鸡胚孵化至38期取大体标本,进行阿辛蓝／茜素红骨骼染色后对标本进行形态学分析和评价,找出适宜浓度为后续实验浓度。 (3)0.5CT实验组和DMSO对照组分别孵化至24期、25期、26期、27期时取出标本,各实验组每期取20例标本,标本固定于4%的多聚甲醛中4-24h,脱水、常规包埋后,制作3μm的石蜡切片,用于HE染色和免疫组织化学法检测。HE切片用于观察CT对鸡胚发育中与腭突发育相关的鼻突组织的形态学变化。采用免疫组织化学法检测比较CT实验组和DMSO对照组鸡胚鼻突组织中的各期RARβ和TGFβ3表达的变化 结果(1)20期鸡胚CT微珠植入上颌突时,引起鼻骨,上颌骨,颧骨,方轭骨完全缺失,但上喙及腭仍是完整的。CT微珠植入鸡胚20期右侧鼻窝时,结果对右喙部及右腭有影响,对上颌骨较小。因此,确定鸡胚20期的鼻窝是本实验植入微珠的最佳时期和部位。 (2)大体标本骨骼染色后的形态学分析DMSO对照组的鸡胚发育正常,其大体标本与正常鸡胚的大体标本外形无明显异常。0.001g/ml、0.01g/ml、0.05g/ml的CT实验组,对鸡胚颌面骨骼发育影响作用甚小,大体标本与正常鸡胚的大体标本无明显异常。从0.1g/ml的CT组开始出现两例鸡胚鼻甲缺损；当浓度为0.5g/ml和0.88g/ml的柠檬醛实验组,对鸡胚有稳定的影响作用,导致鸡胚颌面骨骼发育缺损。0.5g/ml组缺损程度较0.88g/ml组轻。因此我们选定0.5g/ml的CT浓度为后续实验研究浓度。 (3)光镜下观察：矢状面切片上24期DMSO对照组,可见双侧鼻窝逐渐加深且深度对称；24期CT组实验组,CT作用下由于处理侧(右侧)鼻突发育缓慢,右侧鼻窝比左侧鼻窝浅。额切面切片,24期DMSO对照组鸡胚的HE切片可见双侧外侧鼻突发育对称,大小差别不明显。24期CT实验组HE切片可见双侧外侧鼻突发育不对称,处理侧外侧鼻突几乎未生长发育,而对侧外侧鼻突外向生长明显。矢状面切片26期鸡胚右侧壁左侧发育迟缓,26期额状面切片可见处理侧的外侧鼻突的生长发育较右侧慢,右鼻窝的宽度较左侧宽。 (4)免疫组织化学法检测发现,在实验组和对照组中,实验组各期内Rarβ的表达呈轻微持续性下降趋势,差异无统计学意义(P>0.05)。鸡胚同一期内实验组和对照组比较有差异(P<0.05),Rarp表达在CT微珠植入后被下调,可能早期即被下调且下调过程迅速,后期为轻微持续性下降过程。柠檬醛作用于鸡胚面突后导致TGFβ3在鸡胚鼻突中表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论(1)0.5g/ml的CT微珠植入鸡胚20期鼻窝外胚层,影响与鸡胚腭发育相关的鼻突组织。 (2)CT通过抑制鼻窝处的视黄醛脱氢酶,使RARβ与TGFβ3表达下调,鸡胚鼻突发育障碍影响腭突形成,诱导单侧腭部组织缺损。 (3)通过蛋壳开窗,在胚胎发育的早期就可以直接接触胚胎的颅面部,微珠载体将作用因素局限于鸡胚颌面部,减少母体的干扰因素。因此使用鸡胚作为研究唇腭裂的动物模型,是对哺乳动物唇腭裂研究的一个非常好的补充。

关键词： 活性检测   慢病毒多表达质粒   转化生长因子β3   结缔组织生长因子   基质金属蛋白酶抑制剂  

摘要： 目的:构建人转化生长因子β3(TGFβ3)、结缔组织生长因子(CTGF)和基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP1)基因重组慢病毒多表达质粒。转染293细胞后检测活性、包装病毒并探讨其作用特点。　　 方法:应用全基因合成技术,以“自剪切多肽2A”串联目的基因,并克隆到慢病毒表达质粒构建重组慢病毒质粒pLVX-TGFβ3-P2A-CTGF-T2A-TIMP1。转染293细胞后,应用RT-PCR和Western-Blot技术分别检测转染后不同时间点目的基因的mRNA和蛋白质表达水平。　　 结果:RT-PCR和Western-blot技术检测结果显示重组质粒成功表达了目的基因并于转染后48小时左右达到峰值,“2A”结构下游基因蛋白质表达量约为上游基因的80%。经慢病毒包装后获得5×108TU/ml滴度的活性病毒。　　 结论:成功构建了携带人TGFβ3、CTGF和TIMP1基因的慢病毒多表达质粒并收获较高滴度的活性病毒,为转染椎间盘髓核细胞和动物实验打下基础。

关键词： 肝硬化   肝星状细胞   转化生长因子β  

摘要： 目的通过对大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）中内源性转化生长因子β3（TGF-β3）mRNA和蛋白水平的检测，探讨外源性TGF-β3对HSC-T6分泌内源性TGF-β3的影响。方法体外培养HSC-T6，未加入外源陛TGF-β3培养的细胞为对照组，加入外源性TGF-β3（10ng／m1）培养的细胞为TGF—p3组。（1）分别在1、2、4、12h和24h收集细胞，用实时荧光定量PCR法检测内源性TGF-β3mRNA表达；（2）分别在0、1、6h和12h收集细胞，用Western b1ot法检测细胞内TGF-β3蛋白的表达；（3）分别在0、1、2、4、8、14h和24h收集细胞上清液，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞外总TGF-β3蛋白的表达；加入外源性TGF-β3培养HSC-T6 2h，然后换用无血清的DMEM培养液继续培养细胞至2．25、2．5、3、4、6、10h和14h收集细胞上清液，用ELISA法检测细胞外内源性TGF-β3蛋白的表达。对数据进行单因素方差分析。结果（1）TGF-β3组细胞内TGF-β3mRNA表达水平明显增高，于2h达峰值（2．796±0．518），为对照组（1．022±O．038）的2．74倍（P〈0．05）；随后缓慢降低，维持在1．45倍水平达10h，24h时表达水平仍为对照组的1．18倍（P〈0．05）。（2）不同时间点细胞内TGF-β3表达水平均无明显变化（P〉0．05）。（3）TGF-β3组细胞外总TGF-βD3含量明显增加，于4h时达高峰[（18．931±2．904）ng／ml]，约为诱导量[（10．026±0．022）ng／m1]的1．89倍，随后开始下降；内源性TGF-β3于诱导后3h达高峰[（0．835±0．027）ng／m1]，为对照组[（0．026±0．022）ng／m1]的32．12倍，之后开始逐渐降低，直至维持一个弱增长的状态（P〈0．05）。结论外源性TGF-β3可促进HSC-T6细胞分泌大量内源性TGF-β3。

关键词： 转化生长因子β   Smad3   血管平滑肌细胞   炎症   动脉粥样硬化  

摘要： 转化生长因子β是一组在结构上相似的转化生长因子,对于维持血管壁的正常结构以及在动脉粥样硬化的发生发展中有着重要的作用。转化生长因子β主要是通过Sm ad信号通路传递信号。在此信号通路中,Sm ad3蛋白与其他Sm ad蛋白相比,主要是在胚胎后期发挥着重要的调控作用。近年来利用基因敲除及siRNA干扰等方法,进一步解明了Sm ad3生理作用,发现Sm ad3与转化生长因子β介导的细胞增殖与凋亡、免疫监督与心血管发育等有紧密的联系。最近的研究显示,转化生长因子β通过Sm ad3介导参与动脉粥样硬化病理过程,因而有可能成为疾病治疗的靶点。