关键词： 转化生长因子β3   层粘连蛋白   松弛素   女性盆底功能障碍性疾病  

摘要： 目的：探讨转化生长因子一β3、松弛素及层粘连蛋白mRNA及蛋白在主骶韧带及阴道前壁的表达与女性盆底功能障碍性疾病发生的关系。 方法：(1)采用实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)方法,对试验组及对照组主骶韧带及阴道前壁组织中三种因子mRNA的表达情况做半定量分析。(2)进一步采取western-blot对试验组及对照组主骶韧带及阴道前壁组织中三种蛋白的表达量分析。试验组取绝经后确诊为POP-QⅡ-Ⅲ患者和绝经后POP伴SUI患者各30例;对照组取同期住院绝经后行子宫全切术的手术非卵巢功能性肿瘤和宫颈病变患者15例,共75例患者,手术中取近尿道口1.5cm范围内0.5cm×0.5cm阴道前壁组织及近子宫侧主骶韧带组织。 结果： 三种因子mRNA表达结果 1、POP组、SUI组中转化生长因子β3(TGF-β3) mRNA的表达均高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.001);POP与SUI之间差异无显著性(P>0.05)。 2、POP组、SUI组层粘连蛋白的mRNA表达均低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.001),POP与SUI之间差异无显著性(P>0.05)。 3、POP组、SUI组松弛素mRNA的表达研究组均高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.001),POP与SUI之间差异无显著性(P>0.05)。 三种因子蛋白表达量的结果 1、主骶韧带 POP组、SUI组主骶韧带中TGF-β3蛋白的含量研究组均高于对照组,差异具有统计学意义(F=41.342,P<0.001),POP与SUI之间差异有显著性(P<0.05)。 POP组、SUI组LN蛋白的含量研究组均低于对照组,差异具有统计学意义(F=105.773,P<0.01),POP与SUI之间差异具显著性(P<0.05)。 POP组、SUI组RLX蛋白的含量研究组均高于对照组,差异具有统计学意义(F=512.636,P<0.001),POP与SUI之间差异具有显著性(P<0.05)。 2、阴道前壁 POP组、SUI组主骶韧带中TGF-β3蛋白的含量研究组均高于对照组,差异具有统计学意义(F=501.522,P<0.01),POP与SUI之间差异有显著性(P<0.05)。 POP组、SUI组LN蛋白的含量研究组均低于对照组,差异具有统计学意义(F=52.607,P<0.01),POP与SUI之间差异无显著性(P=0.067)。 POP组、SUI组RLX蛋白的含量研究组均高于对照组,差异具有统计学意义(F=512.636,P<0.001),POP与SUI之间差异具有显著性(P<0.05)。 结论： 1：本次实验中,POP组、SUI组中TGF-β3的mRNA及蛋白的表达均高于对照组。说明PFD的发生与TGF-β3的升高有关。 2：POP组、SUI组中层粘连蛋白mRNA及蛋白表达均低于对照组,说明PFD的发生与层粘连蛋白的降低有关。 3：POP组、SUI组中松弛素mRNA及蛋白的表达高于对照组,说明PFD的发生与RLX的升高有关。

关键词： 人肾小球系膜细胞   慢性血葡萄糖   信号转导   转化生长因子   糖尿病肾病  

摘要： 糖尿病(DM)是一组是由于胰岛素分泌和/或胰岛素作用缺陷所引起的，以慢性血葡萄糖（简称血糖）水平增高为特征的代谢性疾病。随着人们生活水平的提高和人口的老龄化，糖尿病的发病率逐年上升，糖尿病患者总数也在全球范围内逐年增多。目前全球约有糖尿病病人1.7亿人，这个数到2030年可能增加一倍[1]。人口老龄化和居民生活方式的改变使得我国的糖尿病患病率呈现明显的上升趋势。据国家卫生部调查显示，我国每天约新增3000例，每年约增加120万糖尿病患者，其中约95.00％为2型糖尿病患者[2]。长期高血糖可导致多种组织，器官的损伤，功能障碍和衰竭，自从20世纪90年代以后由糖尿病导致的终末期肾病(ESRD)发生率增加了一倍，而且还在往上升[3]。　　 目前认为糖尿病肾病的发病过程中有多种酶和转录因子被激活，涉及多条细胞内信号转导通路(DAG/PKC、MAPK、JAK/STAT)杀伤靶器官。大量研究表明，JAK/STAT信号转导通路与系膜细胞的增殖，肥大及细胞外基质分泌有关。而肾小球系膜细胞作为肾脏最重要的固有细胞，其表型和功能的改变在糖尿病肾病的进程中必然发挥着重要的作用。因此探索RNAi沉默STAT1基因后高糖刺激下系膜细胞JAK2/STAT3通路表达变化对于揭示糖尿病肾病的机制有重要的指导意义。　　 STAT1是第一个被发现的STAT蛋白，在干扰素信号中发挥重要作用，主要使细胞生长停滞，促进凋亡。在我们先前的研究中已经证实，高糖刺激下肾小球系膜细胞中STAT1与STAT3蛋白表达均有变化。研究表明STAT1与STAT3在系膜细胞增殖中扮演不同的角色，STAT1激活对系膜细胞增殖有抑制作用，而STAT3激活对系膜细胞增殖有促进作用。STAT1的活化可以抑制细胞生长，参与细胞周期调控，但是STAT1的抑制增殖作用在JAK/STAT通路中可被其他STAT亚型(如STAT3)活化所掩盖。如何促进STAT1的有益作用，并避免被其他STAT亚型的负面作用所掩盖，是我们治疗糖尿病肾病的新思路[4-7]。　　 为此我们设计了以下实验:　　 目的：　　 1.观察RNAi沉默STAT1基因后高糖培养人肾小球系膜细胞的增殖情况及细胞内STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3蛋白的表达变化，探讨糖尿病状态下STAT1和STAT3活性变化。　　 2.观察RNAi沉默STAT1基因后高糖培养人肾小球系膜细胞JAK/STAT通路下游TGF-β1的表达变化，探讨STAT亚型变化对JAK/STAT通路下游TGF-β1的影响，从而为糖尿病肾病提供新的治疗靶点。　　 方法：　　 设计并合成针对STAT1基因的三个特异性siRNA序列，应用lipofectamine2000转染试剂将STAT1-siRNA转染入HMCs。激光共聚焦显微镜鉴定转染效率，应用Western blot、Real-timePCR方法筛选最有效抑制STAT1表达的干扰序列用于后续实验。转染有效干扰序列24 h后，用25mmol/1高糖浓度刺激相应时间，MTT检测各组系膜细胞的增殖情况并用Westem blot法检测各组细胞STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3蛋白的表达变化，ELISA检测TGF-β1的表达变化。　　 结果：　　 HMCs转染后48 h及72 h收集细胞，分别用Real-time PCR和Western blot方法检测干扰效率，STAT1 mRNA水平降低约56.7％，蛋白水平也明显降低，证实干扰成功，同时用阴性对照证实干扰的特异性。　　 1.正常糖浓度组与高糖浓度组MTT490nm处OD值差异有统计学意义(P＜0.05)，而STAT1-siRNA+高糖浓度组与高糖组490nm处OD值差异也有统计学意义（P＜0.05）;而正常糖浓度组与甘露醇组490hm处OD值差异无统计学意义（P＞0.05）。　　 2.P-STAT1，P-STAT3在高糖浓度组的表达较正常糖浓度组明显升高，甘露醇组与正常糖浓度组相比差异无统计学意义，且各组之间STAT1，STAT3表达也无统计学差异。而与高糖浓度组相比，STAT1-siRNA+高糖浓度组STAT1，P-STAT1的表达降低，STAT3，P-STAT3的表达却进一步升高（P＜0.05）。　　 ***/STAT通路的下游因子TGF-β1在高糖浓度组的表达较正常糖浓度组明显升高并且呈时间依赖性，甘露醇组与正常糖浓度组相比差异无统计学意义。而且STAT1-siRNA+高糖浓度组较高糖浓度组TGF-β1表达更高（P＜0.05）。　　 结论：　　 1.高糖可以通过磷酸化方式激活HMCs的JAK2/STAT3信号转导通路。干扰STAT1后，系膜细胞增殖增多，STAT3活性增强。　　 2.高糖促进HMC

关键词： 转化生长因子β1   肝星状细胞   Smad3   Smad7  

摘要： 目的探讨外源性TGF-β1对大鼠肝星状细胞系(HSC-T6)信号通路中相关蛋白的影响，为抑制TGF-β1诱导的肝纤维化提供实验依据。 方法（1）HSC-T6培养基中加/不加外源性TGF-β1(10ng/ml)，诱导2h后应用RT-PCR法检测TGF-β/Smad信号通路中各组蛋白mRNA的表达；（2）选用同样的方法检测加入外源性TGF-β1后不同时间点Smad7mRNA的表达；（3）将阴性对照质粒（ctrl）、Smad3小干扰质粒（siRNA-Smad3）分别转染HSC-T6，各组再根据加/不加外源性TGF-β1分为(+)组和(-)组，RT-PCR法检测Smad3、Smad7mRNA的表达；（4）Western印迹法分析外源性TGF-β1对不同时间点Smad3、Smad7蛋白表达的影响。 结果（1）外源性TGF-β1能诱导TGF-β/Smad信号通路中Smad7mRNA的高表达（2.990±0.101，t=-33.962，P=0.001），但对TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad3、Smad4、Smad6mRNA的表达均无明显影响（均P＞0.05）；（2）外源性TGF-β1处理HSC-T6后，Smad7mRNA的表达迅速增高，于2h达峰值，为0h的2.99倍，随后开始逐渐下降，Smad7的表达量与0h相比均无明显变化（均P＞0.05）；（3）与阴性对照组相比，siRNA-Smad3组Smad3mRNA的表达明显下降（0.532±0.169，t=4.810，P=0.041），同时siRNA-Smad3（-）组Smad7mRNA的表达较ctrl（-）组明显降低，siRNA-Smad3（+）组Smad7mRNA的表达较ctr（l+）组也明显降低（F=9.787，P=0.02）；(4)不同时间点Smad3蛋白表达水平均无明显变化（均P＞0.05）；Smad7蛋白表达与PCR的结果一致，呈时间依赖。 结论外源性TGF-β1可诱导HSC-T6中Smad7早期短时高表达;Smad3可能是外源性TGF-β1诱导Smad7表达的关键调节因子，TGF-β1通过活化Smad3调节Smad7的表达。

关键词： 肝硬化,胆汁性   转录因子Foxp3^+   转化生长因子β_1  

摘要： 目的检测原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者肝组织Foxp3^+和转化生长因子(TGF)β_1表达与肝组织病理的相关性。方法采用免疫组织化学法检测29例PBC患者肝组织中Foxp3^+和TGFβ_1表达。同时选取20例正常肝组织作为正常对照组。结果 PBC患者肝组织Foxp3^+表达量显著高于正常对照组,差异有统计学意义(P=0.000),且Ⅰ期/Ⅱ期PBC患者肝组织表达量与Ⅲ期/Ⅳ期,差异有统计学意义(P=0.002)。PBC患者肝组织TGFβ31表达量显著高于正常对照组,差异有统计学意义(P=0.000),且Ⅰ期/Ⅱ期PBC患者肝组织表达量与Ⅲ期/Ⅳ期差异无统计学意义(P>0.05)。PBC患者肝组织Foxp3^+和TGFβ_1表达量之间存在显著正相关(r=0.765,P=0.000)。结论 PBC患者肝组织中Foxp3^+和TGFβ_1表达与肝组织炎症活动度密切相关。

关键词： cholestasis   hepatitis   transforming growth factor   MAD homolog  

摘要： Transforming growth factor-beta (TGF beta) is activated as a result of liver injury, such as cholestasis. However, its influence on endogenous metabolism is not known. This study demonstrated that TGF beta regulates hepatic phospholipid and bile acid homeostasis through MAD homolog 3 (SMAD3) activation as revealed by lithocholic acid-induced experimental intrahepatic cholestasis. Lithocholic acid (LCA) induced expression of TGFB1 and the receptors TGFBR1 and TGFBR2 in the liver. In addition, immunohistochemistry revealed higher TGF beta expression around the portal vein after LCA exposure and diminished SMAD3 phosphorylation in hepatocytes from Smad3-null mice. Serum metabolomics indicated increased bile acids and decreased lysophosphatidylcholine (LPC) after LCA exposure. Interestingly, in Smad3-null mice, the metabolic alteration was attenuated. LCA-induced lysophosphatidylcholine acyltransferase 4 (LPCAT4) and organic solute transporter beta (OST beta) expression were markedly decreased in Smad3-null mice, whereas TGF beta induced LPCAT4 and OST beta expression in primary mouse hepatocytes. In addition, introduction of SMAD3 enhanced the TGF beta-induced LPCAT4 and OST beta expression in the human hepatocellular carcinoma cell line HepG2. In conclusion, considering that Smad3-null mice showed attenuated serum ALP activity, a diagnostic indicator of cholangiocyte injury, these results strongly support the view that TGF beta-SMAD3 signaling mediates an alteration in phospholipid and bile acid metabolism following hepatic inflammation with the biliary injury. -Matsubara, T., N. Tanaka, M. Sato, D.W. Kang, K.W. Krausz, K.C. Flanders, K. Ikeda, H. Luecke, L.M. Wakefield, and F.J. Gonzalez. TGF-beta-SMAD3 signaling mediates hepatic bile acid and phospholipid metabolism following lithocholic acid-induced liver injury. J. Lipid Res. 2012. 53: 2698-2707.

关键词： cAMP反应元件结合蛋白质   转化生长因子β3   肝星状细胞  

摘要： 目的探讨大鼠肝星状细胞（HSC）中，环磷酸腺苷（cAMP）反应元件结合蛋白-1（CREB-1）对转化生长因子β3（TGFβ3）的mRNA表达及启动子活I生的影响。方法将HSC分为CREB-1表达质粒转染组（C质粒组）、s氓NA—cREB-1转染组（s质粒组）、阴性对照质粒组（N质粒组）、Forskolin处理组（FSK组）、H-89处理组（H-89组）及空白对照组，并根据加或不加入外源性TGFD3重组蛋白将以上各组再分为（TGFD3＋）组和（TGFD3-）组，实时荧光定量PCR法检测TGFβ3mRNA的表达。上述各组共转染PGL3妇sjc-TGFp3P（W质粒）或PGL3-basic-TGFB3P—mCRE（M质粒），以pRL-SV40为空白对照，荧光素酶报告基因分析法检测各组TGFD3启动子活性。双侧t检验进行组间数据比较。结果TGFD3mRNA表达结果显示，与N质粒（TGFp3-）组比较，s质粒（TGFp3-）组mRNA相对表达量降低至0．69fl：0．15（t=3．702，P〈0．05）；与空白对照（TGFD3-）组比较，H-89（TGFD3-）组降低至0．57±0．08（t=9．490，P〈0．05）；N质粒（TGFD3＋）组与N质粒（TGFD3-）组、s质粒（TGFB3＋）组与s质粒（TGFD3-）组、空白对照（TGFB3＋）组与空白对照（TGFβ3-）组、H-89（TGFB3＋）组与H-89（TGFD3-）组分别比较，差异均有统计学意义（t值分别为-7．404、-3．480、-2．831和-7．875，尸值均〈0．05）。荧光素酶报告基因分析结果显示，s＋w质粒组、N＋W质粒组、C＋W质粒组的TGFB3启动子活性分别为0．062±0．013、0．122±0．011、0．165±0．016，C＋W质粒组TGFB3活性较N＋w质粒组组明显升高（t=-3．823，P〈0．05），s＋w质粒组较N＋w质粒组明显降低（t=5．853，P〈0．01）lH-89＋W质粒组、空白对照＋w质粒组、FSK＋W质粒组TGFp3启动子活性分别为0．154士0．010、0．188士0．016、0．276±0．031，FSK＋W质粒组的TGFB3启动子活性较空白对照＋W质粒组明显升高（t=-4．419，P〈0．05），H-89＋W质粒组的TGFD3启动子活性较空白对照＋W质粒组明显降低（t=-3．115，P〈0．05）。结论增加HSC内CREB-1表达或提高CREB-1磷酸化水平可上调TGFp3mRNA表达及其启动子活性ICRE位点是TGFD3启动子的关键位点，封闭该位点后，TGFD3启动子活性明显降低。外源性TGFD3可上调HSC中内源性TGFD3mRNA的表达。

关键词： 树突状细胞   转化生长因子β1   Smad3   肿瘤疫苗  

摘要： 目的研究通过RNA干扰技术阻断外周单核细胞来源的树突细胞(DC)内的Smad3,并在转化生长因子β(1TGF-β1)作用下对DC的成熟和免疫抑制作用的影响。方法设计针对Smad3特异性小干扰RNA(siRNA),利用RNAiMAX转入DC,并用RT-PCR检测转染效果。实验分Control-DC组、TGF-β1-Control-DC组、TGF-β1-Negative siRNA-Smad3 DC组和TGF-β1-siRNA-Smad3 DC组。流式检测各组DC成熟表型的变化,ELISA检测各组DC上清白细胞介素12(IL-12)的水平,CCK-8法检测DC刺激同种异体T细胞增殖的能力。结果 TGF-β1-siRNA-Smad3 DC组表面成熟标志CD80、CD83、CD86、HLA-DR及IL-12分泌水平明显高于TGF-β1-Control-DC组和TGF-β1-Negative siRNA-Smad3 DC组(P<0.05),且TGF-β1-Negative siRNA-Smad3 DC组刺激同种异体T细胞增殖的能力显著增强。结论通过阻断DC的Smad3表达,可以逆转TGF-β1对DC成熟和免疫功能的抑制。

关键词： 芪蚣抗纤方   活血组   肝纤维化   TGF-β1   Smad2/3  

摘要： 目的:观察芪蚣抗纤方(QF)活血组对免疫损伤性肝纤维化大鼠转化生长因子(TGF-β1)及Smad2/3的影响。方法:猪血清腹腔注射法复制免疫损伤性肝纤维化大鼠模型,分为正常对照组,模型组、活血低剂量组、活血高剂量组,用双抗夹心法(ELISA法)测定血清TGF-β1含量;免疫组化法检测肝组织TGF-β1,Smad2,Smad3的表达。结果:①血清学指标:模型组血清TGF-β1含量较其他组明显升高(P<0.01)。与模型组比较,活血组血清TGF-β1含量显著下降(P<0.01),并具量效关系。②免疫组化检测:模型组肝组织TGF-β1,Smad2,Smad3表达明显,活血组肝组织中TGF-β1,Smad2,Smad3表达明显低于模型组(P<0.01)。结论:芪蚣抗纤方活血组通过降低TGF-β1,减少Smad2/3的激活,从而抑制肝纤维结缔组织增生,减轻肝损伤及肝纤维化程度。具有抑制肝纤维化的作用。

关键词： 转化生长因子-β3基因   增强型绿色荧光蛋白   腺病毒载体  

摘要： 目的:构建含有转化生长因子-β3(Transforming growth factor-β3,TGF-β3)和增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的腺病毒载体,使其转染兔骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),并在细胞内得到表达。方法:将含有TGF-β3基因克隆至含有EGFP的穿梭质粒,通过在感受态菌DH5α内同源重组,构建pAdxsi-EGFP-TGF-β3。PacⅠ酶切线性化pAdxsi-EGFP-TGF-β3转染HEK293细胞,多轮"乒乓感染法"扩增收集pAdxsi-EGFP-TGF-β3病毒液,氯化铯梯度离心纯化,PCR和荧光显微镜观察EGFP的表达并检测重组腺病毒液的滴度。测定重组腺病毒液转染MSCs细胞转染效率,Western blot检测TGF-β3蛋白表达。结果:成功构建携带TGF-β3和EGFP的重组腺病毒载体pAdxsi-EGFP-TGF-β3,PCR和绿色荧光证实病毒包装成功,并具有感染力,病毒滴度为2×1010pfu/ml。Western blot检测表明Adxsi-EGFP-TGF-β3感染的兔骨髓MSCs细胞有效表达TGF-β3。结论:含有TGF-β3和EGFP的腺病毒载体pAdxsi-EGFP-TGF-β3构建成功和TGF-β3蛋白在兔骨髓MSCs中有效表达,为进一步研究转染TGF-β3基因的兔骨髓MSCs减轻创面愈合后瘢痕组织增生提供实验基础。

关键词： 磷脂酰肌醇3-激酶   转化生长因子   肺纤维化  

摘要： 目的探讨转化生长因子(TGF-β1)通过调节磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)分子影响肺纤维化进程的重要机制。方法应用博来霉素构建KM鼠肺纤维化模型,设置联合TGF-β1+SB-431542组、单纯TGF-β1组、联合TGF-β1+LY294002组、对照亚组、空白组,于建模后3、7、14、28d检测各组羟脯氨酸(HYP)含量;应用免疫组化技术检测各组磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)蛋白表达;应用方差分析法比较各组PI3K表达差别。结果相对空白组,实验各组PI3K明显高表达,主要分布在细胞核外;单纯TGF-β1组,PI3K及羟脯氨酸(HYP)含量明显高于其余联合TGF-β1+LY294002组。结论 PI3K可能参与TGF-β1调节肺纤维化过程的机制,抑制PI3K的表达,可能可以阻碍肺纤维化疾病发展。