关键词： 表没食子儿茶素-3-没食子酸   上皮一间质转化   转化生长因子   B1   恶性黑素瘤  

摘要： 目的观察表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）能否通过转化生长因子-B1（TGF-61）／信号传导与转录激活因子-3（STAT3）信号通路对恶性黑素瘤上皮-间质转化（EMT）产生影响。方法采用倒置相差显微镜观察不同浓度的EGCG（5、25、50mg／L）对TGF．p1（5ug/L）刺激的B16黑素瘤细胞作用24h后细胞形态、迁移能力和侵袭力变化。Westernblot法检测细胞磷酸化STAT3（p-STAT3）及E-钙黏蛋白（E—cadhefin）的表达。建立B16肿瘤动物模型，逆转录-聚合酶链反应（***）检测各组瘤组织E-cadheinmRNA表达。结果（1）TGF—Bl（5ug／L）刺激B16细胞后细胞间连接不紧密，形态为长梭形，不同浓度EGCG（5、25、50mg／L）作用于TGF-61（5ug／L）刺激B16细胞24h后细胞连接较为紧密，且随浓度增加改变更加明显，细胞划痕间距逐渐增大，Transwell小室检测穿膜数依次为97．00±9．97、60．30±4．00、38．75±7．18，侵袭力与EGCG浓度呈负相关（r=-0．92，P〈0．05）。（2）不同浓度EGCG刺激组p-STAT3的表达逐渐降低，E—cadhefin表达逐渐升高，且呈浓度依赖性，p-STAT3与***表达亦呈负相关（r=-0．805，P〈0．05）。（3）EGCG干预后肿瘤组织中***水平明显增加，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论EGCG具有明显抑制B16细胞EMT作用，其机制与抑制TGF-B1／STAT3信号通路相关。

关键词： 肝硬化   转化生长因子D   肝星状细胞   重组Wnt3a  

摘要： 目的研究Wnt3a对肝星状细胞（HSC）的增殖、活化以及转化生长因子（TGF）p／Smad表达的影响。方法重组Wnt3a刺激HSC后，用EDU法测定其对HSC增殖的影响；用Westemblot法检测HSC表达a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）、TGFD1、Smad3和Smad7的蛋白水平并比较四者之间的关系，多组间数据的比较用单因素方差分析，双变量相关分析研究数据间相关性。结果200ng／mlWnt3a刺激HSC24h后，其增殖率达到最大（63．00％±2．3嘶），显著高于未处理组、50ng／ml、100ng／ml及150ng／ml组（P值均〈0．05），而和250、300ng／ml组的差异无统计学意义（P值均〉0．05）；随着Wnt3a浓度的增加和刺激时间的延长，HSC表达a-SMA，TGFp1和Smad3的蛋白水平也随之升高，均在300ng／ml刺激48h后达到最大值（与3一磷酸甘油醛脱氢酶的灰度比值分别为1．0860±0．0101、1．0346土0．0118、1．0306士0．0122），而Smad7的蛋白水平却随之降低，在300ng／mlWnt3a刺激48h后达到最小（与GAPDH的灰度比值为0．7736±0．0139），差异均具有统计学意义俨值均〈0．05），并且a-SMA的蛋白表达与TGFD1、Smad3的蛋白表达呈正相关（r=0．968，JD〈0．05；r=0．997，P〈0．01），而和Smad7的蛋白表达呈负相关（r=0．960，P〈0．05）。结论重组Wnt3a能促进HSC的增殖、活化，并上调TGFp／Smad的表达，可能对肝纤维化的形成具有促进作用。

关键词： 转化生长因子-β   肝纤维化形成   磷脂酰肌醇3激酶   蛋白激酶B   Smad   细胞外基质   信号   细胞因子  

摘要： 肝纤维化是慢性肝病发展过程中肝组织内细胞外基质（ECM）过度增生与异常沉积所致肝脏结构和肝功能异常改变的一种病理过程，其发生发展是一个连续的阶段性过程并涉及到多种细胞和细胞因子的功能改变。在肝纤维化形成中，转化生长因子-β（TGF-β）是公认的关键细胞因子，对细胞的增殖、凋亡、衰老、分化、迁移发挥着复杂多变的多向性功能。

关键词： 哮喘   半乳糖凝集素-3   转化生长因子-β1   儿童  

摘要： 目的探讨半乳糖凝集素-3(Gal-3)、转化生长因子-β1(TGF-β1)在哮喘患儿血清和支气管肺泡灌洗液(BALF)中的变化及临床意义。方法采用ELISA法测定和比较45例哮喘患儿(哮喘组)及15例气管异物或气道畸形患儿(对照组)血清和BALF中Gal-3、TGF-β1水平。结果哮喘组患儿的血清和BALF中的Gal-3、TGF-β1水平均较对照组高;中重度哮喘患儿的血清和BALF中Gal-3、TGF-β1水平均高于轻度哮喘患儿,差异均有统计学意义(P均<0.05)。哮喘组患儿血清中的Gal-3、TGF-β1水平与相应的BALF中的Gal-3、TGF-β1水平呈显著正相关(r=0.910、0.914,P均<0.05);血清中Gal-3水平与TGF-β1水平呈显著正相关(r=0.932,P<0.05)。结论哮喘患儿血清和BALF中Gal-3、TGF-β1水平均明显升高,可能参与了哮喘的发生、发展。

关键词： 转化生长因子β1   转染   RNA   小分子干扰   肾小球系膜细胞   高糖   信号转导与转录激活子  

摘要： 目的观察信号转导与转录激活子1（STAT1）siRNA转染后高糖培养人肾小球系膜细胞（HMC）的增殖情况及细胞内STAT1、磷酸化（p）STAT1、STAT3、p-STAT3蛋白及下游TGF-β1的表达变化，探讨高糖状态下STAT1和STAT3活性变化及STAT亚型变化对TGF-β1的影响。方法设计并合成针对STAT1基因的3个特异性siRNA序列（STAT1-siRNA），应用Lipofeetamine2000转染试剂将STAT1-siRNA转染入HMC。激光共聚焦显微镜鉴定转染效率，应用Western印迹、实时定量PCR法筛选最有效抑制STATl表达的干扰序列用于后续实验。转染有效干扰序列24h后，用25mmol／L葡萄糖刺激24、48、72h，M1vr法检测各组系膜细胞的增殖情况；Western印迹法检测各组细胞STAT1、p-STATl、STAT3、p-STAT3蛋白的表达；ELISA法检测TGF-β1的表达。结果与对照组相比，高糖可刺激HMC增殖，HMC的P-STAT1、P-STAT3及TGF-β1表达上调（P〈0．05）。转染STAT1-siRNA后高糖刺激HMC，p-STAT3及TGF-β1的表达进一步增高（P〈0．05）。结论高糖可以通过磷酸化方式激活HMC的JAK-STAT信号转导通路。转染STATI-siRNA后，系膜细胞增殖增多，STAT3活性增强。高糖促进HMC分泌TGF--β1，转染STAT1-siRNA后，TGF-β1分泌进一步增加，与肾脏纤维化有关。

关键词： 壳聚糖   转化生长因子β3   滑膜鞘   肌腱损伤   粘连  

摘要： 一、研究背景 屈指肌腱损伤后愈合发生粘连常常导致手指的关节活动受限,目前仍是手外科术后常见的并发症，往往需要再次手术治疗。尽管随着材料和手术技术、康复手段的进步，如何减少肌腱损伤愈合后粘连仍然面临挑战。研究发现有滑膜鞘肌腱在抗粘连方面明显优于无滑膜鞘肌腱，滑膜鞘通过分泌滑液给肌腱提供营养，同时通过自身分泌的细胞因子来减少瘢痕形成，但其数量少、取材会对局部组织造成损伤，如果使用人工肌腱也面临着免疫排斥反应等问题。如果我们对无滑膜鞘或滑膜鞘损伤的肌腱给予人工化改造，制备组织工程滑膜鞘，将有可能大大减少肌腱损伤愈合后粘连问题。 近年来，转化生长因子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)家族在瘢痕形成过程中的作用被越来越重视，TGF-β被认为是肌腱损伤后粘连、瘢痕形成的关键因子。研究发现在皮肤损伤愈合过程中，加入转化生长因子TGF-β1,2的中和抗体或增加TGF-β3的量能有效减少瘢痕的形成。TGF-β3在减少瘢痕形成的治疗中被认为是有效和可行的。 壳聚糖是几丁质部分脱乙酰基的产物，在自然界中广泛存在，壳聚糖溶液中带有高密度的正电荷，可以与多种水溶性的阴离子物质结合，并可以用来制备壳聚糖微球、纤维和多孔支架。壳聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，在体内可被溶菌酶等酶解成低聚糖，降解产物能被生物体完全吸收。 本研究拟利用壳聚糖微球负载TGF-3，构建负载缓释TGF-3微球的壳聚糖组织工程支架，然后种植滑膜细胞，构建TGF-3缓释组织工程滑膜鞘，并检测其生物相容性。本研究将为肌腱粘连的防治提供新的理论依据和实验基础，将可能为临床手外科屈指肌腱粘连的防治提供有效的方法。 二、研究目的 通过制备负载转化生长因子β3(TGF-β3)的缓释组织工程滑膜鞘，探索减少肌腱损伤愈合后粘连的新方法。 三、研究内容 1.采用乳化交联法制备负载TGF-β3的壳聚糖缓释微球，扫描电镜观察并检测其体外缓释效果。 2.利用冷冻干燥法制备壳聚糖三维支架，将壳聚糖微球引入支架，扫面电镜观察。 3.将滑膜细胞收集后种植于含TGF-β3微球的壳聚糖三维支架，MTT法检测微球和支架材料对滑膜细胞增殖的影响，检验材料和细胞的体外相容性。 四、结果 1.壳聚糖微球扫描电镜下观察呈球状，平均粒径28.5±4.3μ m。 2.对微球缓慢释放TGF-3进行连续监测7天，累积总释放率为46.2％±0.3%。 3.壳聚糖三维支架扫面电镜观察孔隙较为一致，孔隙直径平均180.4±35.3μ m，孔隙率83.2％±0.6%。微球可均匀扩散并嵌入到支架中。 4.滑膜细胞在支架和微球间生长良好。MTT法检测TGF-β3微球和支架不影响滑膜细胞正常生长增殖，材料体外相容性较好(p>0.05)。 五、结论 本研究验证了负载TGF-β3的微球体外缓释效果良好，材料和滑膜细胞具有良好的生物相容性，组织工程滑膜鞘为减少肌腱损伤愈合后粘连提供了新方法。

关键词： 转化生长因子β3   骨形态发生蛋白2   重组慢病毒   成骨   骨髓间充质干细胞  

摘要： 目的：探讨慢病毒介导的转化生长因子β3(transforming growthfactor β3, TGF-β3)联合骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)在诱导骨髓间充质干细胞(bone marrowderived mesenchymal stem cells, BMSC)向成骨细胞表型转化中的可能性及相互作用机制。 方法：1.构建慢病毒：构建携带绿色荧光蛋白、tgfβ3和BMP-2基因的重组慢病毒载体,包装、生产重组后的慢病毒(Lv-GFP、Lv-tgfβ3-GFP、Lv-BMP2-GFP、Lv-BMP2-tgfβ3-GFP);2.原代细胞培养：取幼兔骨髓间充质干细胞,体外培养、传代,至第三代用于实验；3.转染与检测：将包装后的重组慢病毒按所携带的不同基因分四组转染体外培养的第三代骨髓间充质干细胞,继续体外培养,于转染后1周分别提取各细胞的总RNA和蛋白,分别采用实时定量PCR技术、免疫印迹法检测各组中目的基因和相应蛋白的表达情况。 结果：通过重组慢病毒转染技术,可以将目的基因tgfβ3和BMP-2同时整合入骨髓间充质干细胞内,并实现了双基因的稳定表达。成功转染的骨髓间充质干细胞中基因tgfβ3和BMP-2在核酸及蛋白水平均明显高于单基因转染组及空白对照组(P<0.05),提示tgfβ3联合BMP-2有更高的诱导BMSC向成骨表型转化的潜能,且两者之间具有协同作用。 结论：通过慢病毒转染技术将tgfβ3和BMP-2整合入体外培养的骨髓间充质干细胞内使其在细胞内稳定表达,能诱导其向成骨表型分化,通过不同组的检测结果表明,双基因组的协同作用克服了单一基因组的不足,可以为干细胞为基础的成骨组织工程提供新的方法。

关键词： 脂肪间充质干细胞   椎间盘退变   化学微环境   大鼠   转化生长因子β3   聚乳酸聚乙醇酸共聚物  

摘要： 背景 椎间盘(The intervertebral disc, IVD)由层状纤维环(annulus fibrosus, AF)包裹的髓核(nucleus pulposus, NP)构成。髓核中有大量的椎间盘相关基质蛋白,是由负电荷蛋白聚糖(proteoglycans, PG)和Ⅱ型胶原形成的网状结构。椎间盘在许多情况下都会发生退变,临床上极为常见,给国家医疗花费增加了沉重的负担。现有文献证明,代谢因素如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs),细胞凋亡,炎症相关细胞因子都会加速椎间盘的退变。目前临床上针对椎间盘都以对症治疗为出发点,以减轻痛苦和修补功能为目标,并没有对椎间盘病变进行根治或是对其在生物力学功能上进行修复。对于椎间盘的修复,针对退变早期,新型的生物学治疗方案是对椎间盘的基质进行再生以及正常功能的全面恢复。体外研究显示,TGF-β1, BMP-7, GDF-5和TGF-β3等生长因子会刺激椎间盘细胞的增殖及提高细胞外基质的合成能力。虽然一些研究提示GDF-5和BMP-7会椎间盘的退变产生抑制作用,但Walsh等的研究中,退变椎间盘的环状纤维只有对大剂量TGF-β1的体内注射产生即时效应,这些生长因子在体内短暂的半衰期成为阻碍生长因子治疗效果的瓶颈。微创治疗的微粒组装系统不但可以作为细胞和蛋白质缓释载体,而且在可以用于各种微创组织工程研究。明确的生物组织相容性和安全性,使得PLGA微球作为组织相容复合物被广泛应用于各种各样的生物组织工程研究。但是,培养在PLGA微球上的椎间盘细胞和间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs),在常规培养基条件下常常从软骨样细胞表型的干细胞分化为成纤维样细胞。因此,一些试验都在尝试着在椎间盘内髓核组织分化中,将特殊的生长因子和药物包装到PLGA微球上。在材料表面修饰的过程中,纳米颗粒在空间上可以被有序加工,用其制作的各式各样新型材料已被用于光学,电学,磁学设备,此外,生物支架材料的表面修饰可以增加细胞表面的相互作用增强细胞功能。值得一提的是,不同电荷的纳米微粒的层层组装(layer-by-layer assembly, LBL)已经用于新型纳米复合材料的制作,而且纳米多层结构材料也已经用于细胞培养和细胞移植。基于上述研究进展,本课题主要从以下五个方面进行了研究：(1)SD ADSCs的分离培养及鉴定;SD GFP/ADSCs和SD TGF-β3/ADSCs过表达细胞系的构建和鉴定;(2)椎间盘微环境对不同年龄来源ADSCs的活力、增殖和基质合成的影响;(3) DEX/TGF-β3/PLGA纳米微球的制备及对SD ADSCs活性、增殖及分化能力的研究;(4) DEX/TGF-β3/PLGA纳米微球/SD ADSCs复合物移植修复SD大鼠退变椎间盘的研究。 第一部分SD ADSCs的分离培养及鉴定;SD GFP/ADSCs和SD TGF-β3/ADSCs过表达细胞系的构建和鉴定 目的分离培养出SD大鼠ADSCs,然后通过三系分化和流式细胞术鉴定其干细胞特征。构建携带TGF-β3和GFP基因的慢病毒载体,转染到.ADSCs,进而药物筛选获得GFP/ADSCs和TGF-β3/ADSCs细胞系,同样鉴定其干细胞特征,为椎间盘退变性疾病的细胞学及基因治疗提供实验依据。 方法和结果我们首先采用机械剪碎组织,酶消化和贴壁法分离培养出SD大鼠ADSCs,通过研究干细胞形态,生长曲线,表面抗原标记表达谱及三系分化能力,对分离的ADSCs进行鉴定。然后利用Gateway技术构建携带TGF-β3和GFP基因的慢病毒载体,转染到ADSCs,进而药物筛选获得稳定表达TGF-β3和GFP基因的细胞系GFP/ADSCs和TGF-p3/ADSCS。最后,本文按照干细胞形态,表面抗原标记表达谱及三系分化能力,对细胞系GFP/ADSCs和TGF-β3/ADSCs进行鉴定;同时利用RT-PCR和Western Blot检测TGF-β3基因在三种细胞系ADSCs, GFP/ADSCs和TGF-β3/ADSCs中的表达情况。体外成功建立SD大鼠ADSCs培养扩增的方法,并成功诱导出成骨、成脂和成软骨细胞。ADSCs造血干细胞表型标志表达为阴性,而间充质干细胞表型标志表达为阳性。基因转染48h后观察到较强的绿色荧光表达,Lenti-GFP-TGF-β3及Lenti-GFP的转染率均达到90%以上。与GFP/ADSCs和ADSCs细胞相比,RT-PCR、Western blot检测到目的基因TGF-β3在TGF-β3/ADSCs中出现过表达(P<0.05)。此外,GFP/ADSCs和TGF-β3/ADSCs细胞系仍然具有干细胞特征。 结论分离培养出的SD大鼠ADSC

关键词： 增生性瘢痕组织   CTGF   流式细胞   正常皮肤   结缔组织生长因子   Smad3  

摘要： 增生性瘢痕属于纤维增生性疾病,是常见的病理性瘢痕,多由创伤引起,为伤口愈合后局部纤维组织增生所致的病理状态[1]。近年来细胞因子及其信号转导途径异常活化与创伤愈合关系的研究引起了人们的重视。Smad3及其产物可以调节创面愈合,其表达失控可能是创面愈合延迟、不

关键词： 川芎嗪   肝纤维化   转化生长因子B1   Smad   2   3   肝星状细胞   大鼠  

摘要： 目的研究川芎嗪对大鼠肝纤维化TGF-β1／Smads信号通路的影响。方法Wistar雄性大鼠50只，随机分为5组：空白组、模型组、川芎嗪组（200mg／kg组、400mg／kg组、800mg／kg组）。用CCl。诱发大鼠肝纤维化，川芎嗪不同剂量组作用大鼠8周后处死并分离肝星状细胞。应用免疫细胞化学法及Western印迹法检测肝星状细胞中TGF-β1、Smad2／3的表达及分布。结果TGF—βl、Smad2／3均主要表达于肝星状细胞中。免疫细胞化学结果示TGF-βl主要在胞核表达，Smad2／3蛋白则在胞核及胞浆均有表达。CCI4注射诱导后，大鼠肝组织中TGF-β1、Smad2／3蛋白的表达较空白对照组明显增强（P〈0．05）。随着川芎嗪浓度（200、400、800nlg／kg）的升高，TGF-β1、Smad2／3蛋白在肝组织的表达强度呈逐级递减的趋势，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论川芎嗪可能通过抑制TGF-βl／Smads信号转导通路，从而发挥其抗肝纤维化的作用。