关键词： 放射性肺纤维化   转化生长因子β   循环纤维细胞   调节性T细胞   辅助性T细胞  

摘要： 目的意义:放射性肺纤维化是临床胸部肿瘤放疗常见的并发症之一,也可发生于骨髓移植手术前的放疗预处理及其它意外照射,其主要特征为肺脏内纤维结缔组织增多,实质细胞减少,持续进展可致肺脏结构破坏和功能减退,乃至肺功能衰竭,严重威胁人类健康和生命。临床上放射性肺纤维化缺乏特异、有效的治疗措施,患者预后较差。因此研究并阐明放射性肺纤维化发生的规律与特征和分子机制,对于临床上预测放射性肺纤维化的发生和转归,寻找干预、治疗的手段有着极其重要的意义。研究表明,转化生长因子β-1（transforming growth factor-β,TGF-β1）是重要的促纤维化因子之一,在肺纤维化过程中调控成纤维细胞分裂、增殖及细胞外基质的沉积,促进纤维化的发生。然而TGF-β3在组织损伤修复中表现出了不同于TGF-β1的抗纤维化特性,但是目前缺少TGF-β3用于放射性肺纤维化干预措施的依据。本研究以雌性C57BL/6小鼠为实验对象,建立放射性肺纤维化模型,观察TGF-β3对小鼠放射性肺纤维化的影响,寻找TGF-β3在放射性肺纤维化中可能的调控机制,为临床放射性肺纤维化的预防和治疗提供新的线索。材料与方法:雌性C57BL/6小鼠（6-8周,20±2g）麻醉后固定于自制的照射板上,除胸部外其余部分用10cm铅砖防护,采用60Coγ-射线单次胸部照射,照射剂量为20Gy,照射源距3m,剂量率215c Gy/min。在照后4h照射组给予腹腔注射0.5ml生理盐水,TGF-β3组给予0.5ml人重组TGF-β3（1μg/kgbw,生理盐水稀释）,此后每周给药一次。分别于照后1个月、3个月和6个月,观察小鼠的大体情况,检测外周血细胞参数,活杀后进行常规病理检查和Masson三色染色观察,免疫组织化学法检测肺组织中基质金属蛋白酶-9（matrix metallopeptidase-9,MMP-9）和基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinases-1,TIMP-1）的表达,检测肺灌洗液（BALF）中细胞分类及细胞因子含量,流式细胞技术检测外周血Treg、肺内循环纤维细胞、Th17与Treg等。采用分离培养人外周血白膜的单个核细胞（PBMC）及Treg细胞建立体外培养体系,分别以不同剂量、不同比例的TGF-β1和TGF-β3混合刺激PBMC,通过流式细胞技术检测PBMC向循环纤维细胞的分化情况。并将Treg细胞与PBMC共培养,检测Treg细胞对PBMC向循环纤维细胞的分化的影响。实验结果：1、60Coγ-射线单次胸部20Gy照射后小鼠体重增加变缓,肺重略微增加,因而肺脏系数也略微增加。2、小鼠照射后外周血白细胞数有一定波动,TGF-β3组血红细胞显著降低（P<0.05）,血小板有增高趋势。3、BALF中有核细胞计数和分类结果显示照射组与TGF-β3组BALF中细胞总数和中性粒细胞数有增高的趋势,但统计学无显著差异。液体悬浮芯片细胞因子检测结果显示照射后小鼠BALF中趋化因子有先增高后降低的趋势。而TGF-β3组促炎因子IL-12分泌增多、抑炎因子IL-4分泌减少。照射组的促炎因子IL-17随着照后时间延长有增加的趋势,其中在照后6个月显著高于对照组（P<0.05）,而TGF-β3组的IL-17变化情况跟照射组正好相反,在照后1个月时显著增加（P<0.05）,随后降低并恢复至正常水平。生长因子中,照射组和TGF-β3组的FGF-basic在照后出现了先增高再降低最后恢复的波动情况。照射组的VEGF在照后有增高的趋势,其中在照后1个月和照后6个月时与对照组相比显著增加（P<0.05）。4、照射能够引起照射组小鼠出现肺泡壁增厚、肺泡间隔明显增宽、成纤维细胞大量增生、肺泡结构严重破坏、胶原纤维大量沉积的典型纤维化病理改变。给予TGF-β3组小鼠病理变化比照射组出现的晚且程度较轻,同时胶原沉积减少,但仍然可见炎性淋巴细胞浸润,蛋白样液体渗出,局部肺泡萎陷,部分肺泡腔融合扩大,局部肺泡间隔增宽,以及部分绿染的胶原纤维。5、免疫组化结果显示照射后小鼠肺内MMP-9、TIMP-1表达与对照组相比均明显增加,其中MMP-9随照后时间的延长增加的更为显著,TGF-β3组MMP-9表达显著高于照射组（P<0.05）。TIMP-1随照后时间延长变化趋势不明显。6、照射组小鼠从照后1个月起肺内循环纤维细胞明显增加（P<0.05）,随照后时间的延长,出现降低,但仍高于对照组（P<0.05）。照后1个月时,TGF-β3组循环纤维细胞数明显低于照射组（P<0.05）,与对照组相比仍有增高（P<0.05）;3m时与照射组水平接近;而6个月时低于照射组,恢复至对照组水平。7、照射组和TGF-β3组外周血Treg细胞比例随着照后时间的延长有降低趋势,但

关键词： 转化生长因子β3   基质金属蛋白酶抑制剂1   慢病毒属   椎间盘退变  

摘要： 目的:探讨慢病毒载体介导的转化生长因子β3(TGFβ3)、基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)联合感染对体外培养人退变椎间盘髓核细胞的影响,从而最终实现延缓甚至逆转椎间盘退变的目的。方法:单层培养人退变椎间盘髓核细胞,采用绿色荧光蛋白标记慢病毒(GV287-EGFP)评价其对髓核细胞的感染效率。应用构建的TGFβ3-P2A-TIMP1慢病毒载体感染髓核细胞,在倒置纤维镜下观察细胞形态学变化,通过Real-time q PCR技术检测感染后TGFβ3、TIMP1、Ⅱ型胶原和蛋白多糖的m RNA表达量,通过Western blot技术检测感染后Ⅱ型胶原和蛋白多糖含量,最终评价应用携带TGFβ3-P2A-TIMP1的慢病毒载体体外感染人退变椎间盘髓核细胞后对其细胞外基质代谢的影响。结果:感染复数(MOI)为60时可获较满意感染效率。Real-time q PCR示目的基因感染组的TGFβ3、TIMP1、Ⅱ型胶原、蛋白多糖m RNA表达量均明显高于空病毒感染组及空白对照组(F=16.350～74.378,q=2.010～10.620,P<0.05),而空病毒感染组和空白对照组间无统计学差异。Western blot示目的基因感染组的Ⅱ型胶原、蛋白多糖蛋白表达量均明显高于空病毒感染组和空白对照组(F=50.495～66.110,q=8.061～16.624,P<0.05),而空病毒感染组和空白对照组间无统计学差异。结论:慢病毒载体介导的TGFβ3和TIMP1双基因联合感染人椎间盘髓核细胞可长时间稳定表达,发挥生物学效应,促进蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成,并最终改善髓核细胞外基质的代谢。

关键词： 转化生长因子β3   DPSCs   Bio-oss骨粉   骨缺损   修复  

摘要： 目的探索TGF-β3与牙髓干细胞(DPSCs)联合Bio-oss骨粉在兔牙槽骨缺损修复中的作用。方法(1)从新西兰幼兔前牙及磨牙牙髓组织中分离DPSCs进行体外培养(2)将24只实验新西兰兔随机分为空白组;对照组1;对照组2;实验组共四组,每组6只。在四组动物下颌无牙区牙槽骨人工制备10*4*4mm骨缺损区,空白组骨缺损区填入0.25g粗颗粒Bio-oss+PBS20μL,对照组1中填入0.25g粗颗粒Bio-oss+250ng/μL TGF-β3 20μL;对照组2填入0.25g粗颗粒Bio-oss+培养好的1×108/L的DPSCs 20μL;实验组填入0.25g粗颗粒Bio-oss+250ng/μLTGF-β3 20μL+培养好的1×108/L的DPSCs20μL。术后第6周分别处死动物,进行HE染色,免疫组织化学法检测骨钙素(OC)、骨涎蛋白(BSP)、Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)的表达。结果(1)原代培养的幼兔牙髓细胞少数纺锤形或多角形,多呈成纤维细胞样细胞,光镜下传代培养的细胞形态特点与原代培养无明显差异;(2)HE染色:术后6周,空白组未见明显骨小梁生成;对照1组可见少量毛细血管,可见少量骨小梁;对照2组可见骨缺损区周围有少量成骨细胞和少量毛细血管,可见少量新生骨板;实验组骨缺损区可见大量毛细血管和大量成骨细胞,新生骨板量明显增加;(3)免疫组织化学:实验组BSP表达较空白组(0.192±0.030)、对照1组(0.215±0.026)及对照2组(0.231±0.052)较高(P<0.05);实验组OC表达较空白组(0.243±0.037)、对照1组(0.272±0.058)及对照2组(0.275±0.046)较高(P<0.05);实验组COL-Ⅰ表达较空白组(0.135±0.026)、对照1组(0.151±0.033)及对照2组(0.176±0.028)较高(P<0.05);说明实验组新生骨组织数量、质量、成骨情况优于其他组。结论(1)DPSCs增殖能力强,具有稳定的生物活性,可适应长期大量培养的需要。(2)外源性TGF-β3与牙髓干细胞可有效地促进颌骨缺损的修复,为后期的临床实验提供一定的理论依据。

关键词： 胰岛素   信号转导   磷脂酰肌醇-3-羟基酶/苏氨酸激酶   视网膜色素上皮细胞   转化生长因子β2   近视   细胞培养  

摘要： 背景 胰岛素具有促进近视发生的作用,胰岛素受体已被证实存在于视网膜色素上皮（RPE）细胞上,转化生长因子β2（TGF-β2）是RPE细胞分泌的重要的近视信号因子之一.目的 研究胰岛素是否通过磷脂酰肌醇-3-羟基酶/苏氨酸激酶（PI3K/Akt）通路促进RPE细胞增生及分泌TGF-β2.方法 使用含质量分数10％胎牛血清的DMEM培养基常规培养人RPE细胞株ARPE-19细胞,分别将10×10^3 U（商品单位）/ml胰岛素、LY294002、10×10^3 U/ml胰岛素＋LY294002、Wortmanin和10× 10^3 U/ml胰岛素＋Wortmanin20 μmol/L各20μl加入培养基,另设常规培养的细胞作为空白对照.作用后48 h,采用MTS法检测各组RPE细胞的增生情况,采用ELISA法检测各组RPE细胞上清液中TGF-β2质量浓度,以评估细胞分泌TGF-β2的能力;各种药物作用后1h和2h,采用逆转录PCR（RT-PCR）法检测各组细胞中TGF-β2mRNA的相对表达量.结果 MTS结果显示,胰岛素＋LY294002组RPE细胞的增生值（A值）明显低于胰岛素组（0.75±0.03 versus0.98±0.04）,差异有统计学意义（P＜0.05）,而胰岛素＋Wortmanin组RPE细胞增生与胰岛素组相比,差异无统计学意义（0.97±0.07 versus 0.98±0.04,P＞0.05）.ELISA法检测结果显示,胰岛素＋LY294002组和胰岛素＋Wortmanin组RPE细胞上清液中TGF-β2质量浓度分别为（11.59±2.85）pg/ml和（49.16±10.94） pg/ml,明显低于胰岛素组的（548.50±35.18） pg/ml,差异均有统计学意义（P＜0.05）,且胰岛素＋LY294002组细胞上清液中TGF-β2质量浓度的下降值明显高于胰岛素＋Wortmanin组,差异有统计学意义（t=8.131,P=0.000）.RT-PCR结果显示,药物作用后1h和2h,胰岛素＋LY294002组和胰岛素＋Wortmanin组细胞中TGF-β2mRNA的相对表达量均明显低于胰岛素组,差异均有统计学意义（P＜0.05）,胰岛素＋ LY294002组细胞中TGF-β2mRNA相对表达量的下降程度稍大于胰岛素＋Wortmanin组,作用后1h差异有统计学意义（t=4.176,P=0.014）,但作用后2h差异无统计学意义（t=0.756,P=0.492）.结论 胰岛素可以通过PI3 K/Akt途径促进RPE细胞增生,并促进RPE细胞分泌TGF-β2以进行信号传递,可能是胰岛素促进近视发生的机制之一.

关键词： 干细胞   培养   转化生长因子β3   干细胞因子及调控因子   人乳牙牙髓干细胞   肝素   CD146   克隆形成率   矿化   茜素红染色   碱性磷酸酶   Vimentin蛋白   STRO1蛋白   transforming   growth   factor   beta   3  

摘要： 背景:目前已有研究报道转化生长因子β超家族对各类干细胞成骨矿化的作用,但转化生长因子β3与肝素联合作用后对人乳牙牙髓干细胞的增殖和矿化能力的作用仍有待研究。目的:观察转化生长因子β3对人乳牙牙髓干细胞增殖和矿化能力的影响。方法:采用酶消化法将人乳牙牙髓分离培养,测定细胞集落克隆形成率,流式细胞术鉴定细胞表面标记物CD146,细胞爬片行Vimentin和STRO1免疫化学染色进行人乳牙牙髓干细胞鉴定;对体外培养的第3代人乳牙牙髓干细胞给予肝素和质量浓度1,5,25μg/L的转化生长因子β3进行干预。MTS法测细胞生长曲线;茜素红染色;碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性的改变。结果与结论:实验所得细胞集落克隆形成率高,细胞表面标记物CD146呈阳性,Vimentin和STRO1免疫化学呈强阳性,鉴定获得人乳牙牙髓干细胞。MTS结果显示,给予转化生长因子β3刺激人乳牙牙髓干细胞后并无明显的促增殖的作用。碱性磷酸酶活性检测结果显示,转化生长因子β3-肝素联合作用可随着浓度的增加而增强人乳牙牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性,其中质量浓度分别为5,25μg/L转化生长因子β3和肝素联合作用组与转化生长因子β3单独作用组、肝素单独作用组以及对照组相比显著性升高(P<0.01)。转化生长因子β3-肝素联合作用组的茜素红染色均呈阳性,其中以5μg/L转化生长因子β3-肝素联合作用组染色最强。结果证实,转化生长因子β3与肝素联合作用可促进人乳牙牙髓干细胞矿化能力。

关键词： 凋亡抑制蛋白质类   转化生长因子β3   金属蛋白酶1组织抑制剂   慢病毒属   椎间盘   退变  

摘要： 目的构建人生存素（Survivin）、转化生长因子03（TGFtβ3）与基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）三基因过表达慢病毒载体，通过一次转染，实现Survivin、TGFβ3、TIMP-1三基因在人退变椎间盘髓核细胞的稳定转染，为逆转或延缓椎间盘退变的基因治疗提供实验基础。方法应用Survivin、TGFβ3、TIMP-1慢病毒载体联合转染人退变髓核细胞，应用Real—TimePCR技术检测转染后基因表达情况。结果人退变椎间盘髓核细胞在转染后1周，Survivin、TGFβ3、TIMP-1三基因在基因水平均获得稳定过表达，并且其表达能维持细胞传至第3代或更久。Real—TimePCR检测结果显示，目的病毒组Survivin、TGFβ3、TIMP-1均过表达，其相对表达量与空白组比较，差异有显著性（F=12．96～3889．70，P〈O．05）。结论Survivin、TGFβ3与TIMP-1慢病毒载体能够稳定转染人退变椎间盘髓核细胞，并且能长时间维持其表达，从而发挥生物学效应。

关键词： 红斑狼疮   系统性   信号转导和转录激活因子3   转化生长因子β1  

摘要： 目的:探讨信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)和转化生长因子(transforming growth factor,TGF)β1在系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者与正常人外周血单一核细胞(PBMC)中的表达差异及其与临床和实验室指标的相关性;探讨STAT3和TGF-β1在SLE发病机制中的调节作用。方法:收集40例SLE患者和40例正常人对照的外周血标本,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测其PBMC中STAT3和TGF-β1表达水平;利用SPSS16.0分析STAT3和TGF-β1的表达及其与临床特征的相关性。结果:SLE患者PBMC中STAT3和TGF-β1的表达水平明显高于正常人对照组[STAT3 mRNA的△CT值分别为2.34±0.38和3.03±0.48(t=7.09,P<0.01);TGF-β1 mRNA的⊿CT值分别为3.54±0.71和4.27±0.81(t=4.30,P<0.01)],且与SLE活动性指数(SLEDAI)呈正相关(r值分别为-0.32和-0.37,P均<0.05);活动期的SLE患者STAT3和TGF-β1的mRNA表达量明显高于静止期患者[STAT3 mRNA的△CT值分别为2.21±0.38和2.53±0.30(t=2.93,P<0.01);TGF-β1 mRNA的△CT值分别为3.29±0.57和3.81±0.76(t=2.46,P<0.05)];伴有发热的SLE患者STAT3的mRNA表达量明显高于无发热的患者[STAT3 mRNA的△CT值分别为2.1 1±0.47和2.40±0.33(t=2.09,P<0.05)]。结论:STAT3和TGF-β1可能参与了SLE的发病过程;STAT3和TGF-β1与SLE病情活动性有关;STAT3可能参与了发热的过程。

关键词： 转化生长因子β3   分子克隆   肝星状细胞  

摘要： 目的:克隆大鼠转化生长因子β3(TGFβ3)基因并研究其转染肝星状细胞(HSC)后的表达情况。方法:采用逆转录—聚合酶链式应(RT-PCR)从大鼠成骨细胞中扩增出特异性片段,经酶切鉴定证实为大鼠TGFβ3cDNA,将此片段插入pcDNA3.1(+)表达载体,构建得到pcDNA3.1(+)-TGFβ3重组质粒。应用阳离子脂质体介导的基因转移技术将TGFβ3表达载体导入大鼠HSC,24 h、48 h、72 h后用荧光定量PCR法进行瞬时表达的检测。结果:重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-TGFβ3经限制性内切酶NheI、XbaI酶切,电泳后显示的TGFβ3目的片段和5.4 kb的pcDNA3.1(+)载体片段,测序证实酶切片段与GenBank中登记的TGFβ3全长序列相同,证实pcDNA3.1(+)-TGFβ3真核表达载体构建成功,转染48 h后,肝星状细胞的表达明显增高(P<0.05)。结论:重组TGFβ3真核表达载体构建正确,并在转染大鼠HSC48 h后获得高效表达,为转基因治疗肝纤维化疾病提供理论依据。

关键词： Adipose-derive stem cells   Rac1   Osteochondral defect   Hypertrophy  

摘要： Hyaline cartilage differentiation is always the challenge with application of stem cells for joint repair. Transforming growth factors (TGFs) and bone morphogenetic proteins can initiate cartilage differentiation but often lead to hypertrophy and calcification, related to abnormal Rac1 activity. In this study, we developed a strategy of programmed application of TGF beta 3 and Rac1 inhibitor NSC23766 to commit the hyaline cartilage differentiation of adipose-derived stem cells (ADSCs) for joint cartilage repair. ADSCs were isolated and cultured in a micromass and pellet culture model to evaluate chondrogenic and hypertrophic differentiation. The function of Rac1 was investigated with constitutively active Rac1 mutant and dominant negative Rac1 mutant. The efficacy of ADSCs with programmed application of TGF beta 3 and Rac1 inhibitor for cartilage repair was studied in a rat model of osteochondral defects. The results showed that TGF beta 3 promoted ADSCs chondro-lineage differentiation and that NSC23766 prevented ADSC-derived chondrocytes from hypertrophy in vitro. The combination of ADSCs, TGF beta 3, and NSC23766 promoted quality osteochondral defect repair in rats with much less chondrocytes hypertrophy and significantly higher International Cartilage Repair Society macroscopic and microscopic scores. The findings have illustrated that programmed application of TGF beta 3 and Rac1 inhibitor NSC23766 can commit ADSCs to chondro-lineage differentiation and improve the efficacy of ADSCs for cartilage defect repair. These findings suggest a promising stem cell-based strategy for articular cartilage repair.

关键词： 膀胱   纤维化   转化生长因子-β   炎症  

摘要： 目的 观察转化生长因子-β1（TGF-β1）通过Smad-3对膀胱慢性炎症纤维化的调节作用.方法 将40只SD大鼠随机分为对照组、模型组、大剂量及小剂量干预组.通过尿流体动力学、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、苏木素-伊红（HE）及Masson三色染色检测各组差异.结果 与对照组比较,模型组大鼠膀胱慢性炎症纤维化显著,膀胱顺应性由（0.99±0.11） ml/mmHg降低为（0.29±0.05） ml/mmHg,膀胱TGF-β1、Smad-3、Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型胶原（CollagenⅢ）的mRNA表达均显著升高（0.79±0.07、0.73 ±0.06、1.09 ±0.09、1.32 ±0.05,P＜0.05）.两个剂量SB431542干预后,大鼠膀胱顺应性分别增高到（0.64±0.07）和（0.71±0.05） ml/mmHg,Smad-3表达降低为0.30±0.04和0.25±0.05,膀胱炎症及纤维化改善（P＜0.05）.结论 TGF-β1通过调节Smad-3在膀胱慢性炎症及纤维化进程中发挥促进作用.