关键词： 热应激   猪睾丸   精子发生   TGF-β3   血睾屏障紧密连接分子Occludin和 Claudin-11  

摘要： 目的:夏季高温严重影响种猪的繁殖率,是国内外种猪场生产实践中普遍存在的严重问题。在高温热应激下,公猪精子的畸形率上升、密度减少和活力下降,但其分子机制尚不明确。高温热应激是否通过影响猪睾丸血睾屏障(blood-testis barrier,BTB)调节蛋白转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3,TGF-β3)和血睾屏障紧密连接(tight junctions,TJs)分子Occludin和Claudin-11的表达与定位,导致血睾屏障的结构破坏,从而影响精子发生和精液品质,尚无研究报道。本研究旨在探讨热应激条件下血睾屏障调节蛋白TGF-β3和血睾屏障紧密连接分子Occludin和Claudin-11在猪睾丸的表达与定位,进而研究热应激损伤猪睾丸精子发生的分子机理。方法:本研究构建了猪睾丸热应激模型。将12头长白公猪(14-18月龄性成熟)随机分成4组,每组3头。热应激处理其中的9头猪:短时环境热应激组,3头猪置于37～40 ℃猪舍环境7 d,每天3 h;长时环境热应激组(一个精子发生的周期是42 d),3头猪置于37～40 ℃猪舍环境42 d,每天3 h;局部阴囊加热组,用自制的温控加热垫42 ℃热敷3头猪睾丸1 h。每天于热处理结束后将猪驱赶回20～27℃正常猪舍环境中。剩余的3头猪饲养于20-～27 ℃的猪舍环境作为对照组。取所有猪睾丸组织,采用qRT-PCR、Western blotting及免疫组织化学对猪睾丸血睾屏障调节蛋白TGF-β3、血睾屏障紧密连接分子Occludin和Claudin-11的表达和定位进行研究。结果:***-PCR结果显示,热应激(短时环境热应激、长时环境热应激和局部阴囊加热)上调TGF-β3mRNA的相对表达,下调了血睾屏障紧密连接分子Occludin和Claudin-11mRNA的相对表达。*** blotting结果显示,热应激(短时环境热应激、长时环境热应激和局部阴囊加热)上调TGF-β3蛋白的相对表达,下调了血睾屏障紧密连接分子Occludin和Claudin-11蛋白的相对表达。3.免疫组织化学结果发现,热应激组(短时环境热应激组、长时环境热应激组和局部阴囊加热组)中TGF-β3定位于各级生精细胞和支持细胞的胞质,免疫阳性着色深度和范围高于对照组;热应激组(短时环境热应激组、长时环境热应激组和局部阴囊加热组)与对照组相比,Occludin和Claudin-11的免疫反应性染色局限于支持细胞周围,显著的血睾屏障带状表达受到损伤。结论:热应激(短时环境热应激、长时环境热应激和局部阴囊加热)引起猪睾丸内血睾屏障调节蛋白TGF-β3的表达增高,血睾屏障紧密连接分子Occludin和Claudin-11的表达下降,这提示热应激可能导致血睾屏障的结构破坏,精子发生受损。

关键词： 转化生长因子β3   牙髓干细胞   牙种植体   骨结合  

摘要： 目的:(1)建立新西兰兔前牙区种植体修复的动物模型,利用组织工程方法,将TGF-β3联合DPSCs与种植体复合,构建组织工程化种植体。(2)通过比较各组新西兰兔下前牙区种植体模型,探讨TGF-β3在促进骨组织愈合的作用机制。方法:(1)选择拔除新西兰兔下前牙进行下前牙区种植修复模型;(2)实验组将种植体与骨间隙内之间放入TGF-β3、DPSCs、Bio-oss骨粉的混合物,对照组将种植体与骨间隙之间放入DPSCs、Bio-oss骨粉的混合物,空白组将种植体与骨间隙之间放PBS液、Bio-oss骨粉混合物;(3)设2周、4周、8周、12周,4个时间段,每个时间段为6只动物。于各个限点处死动物取材,对种植体修复区分别进行大体观察游离下颌骨,种植体周围骨组织进行组织学观察、免疫组织化学观察和实时荧光定量PCR检测分析种植体修复中TGF-β3在促进骨组织愈合的作用机制。结果:(1)组织形态学观察2周时,实验组较对照组、空白组较早出现较多的成骨细胞、见骨陷窝形成及新生血管区域、新骨形成区域,其界限较清楚;4周时,实验组较对照组、空白组出现明显低密度的大量新骨形成,成骨细胞区域充满蜂窝状的结缔组织伴有新生血管,随着成骨细胞数量的减少,骨细胞数量大幅度增加,形成初期的骨组织修复;8周时,实验组与对照组、空白组相比,大量成骨细胞被固定在骨基质中,然后变为骨细胞,形成小梁状不成熟的编织骨组织,由于骨基质中矿物质和有机物的增加,使骨基质进一步成熟,钙化明显,从而层板骨修补种植体的骨结合。12周时,实验组已基本形成层板骨,新骨与旧骨之间没有明显的界限,对照组、空白组成骨细胞数量、骨细胞数量、血管化、新生骨面积均不如实验组,另外,时间上成骨活动时间比实验组晚2周至4周。(2)免疫组化染色观察:从数量还时间上,与其他两组相比,实验组种植体周围成骨细胞数量更多、形成更早。实验组、对照组与空白组有明显的差异(P<0.05),从而实验组成骨效果相对于对照组、空白组更加明显,显示了TGF-β联合DPSCs作用下,种植体周围提前完成骨结合,(3)实时荧光定量PCR发现,在三个月的成骨周期内,实验组的RUNX2基因明显高于对照组(P<0.05),提示TGF-β3有效地刺激机体促进成骨细胞的增生,成骨基因RUNX2的高表达;COL-I在实验组中的表达高于对照组,前成骨细胞在实验组中已形成成骨细胞并开始分化,而对照组组与空白组无明显差异,可能是由于时间还没达到刺激细胞分化表达COL-I的浓度。结论:(1)将TGF-β3联合DPSCs与种植体相复合,可构建组织工程化种植体。(2)通过动物体内实验证明,外源性TGF-β3联合DPSCs、Bio-oss骨粉颗粒的混合物可显著促进并加速骨组织形成。(3)可以为临床种植骨愈合时间过长提供解决的方法,骨代谢疾病导致的种植失败率较高等问题提供一种新的思路和方法。

关键词： miRNA-30a-5p   心肌成纤维细胞   整合素β3   转化生长因子β1  

摘要： 目的:MicroRNAs(miRNAs)已被证实在心肌梗死的发生发展中起着重要作用。MiRNA-30a-5p是miRNA-30家族的一员,也是心肌梗死后纤维化中TGF-β1通路的上游调节因子。整合素β3在血小板和内皮细胞内表达,并影响趋化因子和细胞因子的表达,包括转移生长因子β1。本研究旨在观察miR30a在转化生长因子β1调节中的作用,探讨心肌缺血中miR30a、整合素β1和转化生长因子β1的表达。方法:1、我们通过不同的网站软件分析,发现整合素β3有很大可能同时是miRNA-30a-5p的下游靶点和转化生长因子β1的上游靶点,这些软件包括TargetScan version 6.2(http://***),MiRanda(http://***),DIANAmicroT version3.0(http://***,)and miRDB(http://***/miRDB).2、实验用的心肌成纤维细胞是从刚出生1-3天的SD大鼠乳鼠的心脏中提取。将提取的原代成纤维细胞分成4组(每组有2皿)。其中三组分别转染miRNA-30a-5p上调腺病毒、miRNA-30a-5p下调腺病毒以及空载病毒组。还有一组不做转染作为对照组。四组中每组取出一皿细胞,一起用无糖培养基培养并置于5%二氧化碳和95%氮气的无氧环境中培养6个小时做心肌梗死模型。分别标记为对照组、对照+缺氧组、空载病毒+缺氧组、过表达miRNA-30a-5p+缺氧组以及抑制miRNA-30a-5p+缺氧组。实时荧光定量PCR法(realtime-qPCR,rt-PCR)检测各组细胞中miR-30a-5p及转化生长因子β1、整合素β3的mRNA的表达变化;蛋白印迹法(Western Blot,WB)检测转化生长因子β1和整合素β3的蛋白的表达变化。3、重新提取4皿心肌成纤维细胞,其中两皿进行过表达miR-30a-5p腺病毒的转染。并且将一皿未处理的细胞和一皿转染病毒的细胞分别转染小干扰RNA,从而将抑制整合素β3的表达,然后将四皿细胞同时进行缺氧无糖处理6小时后,分别通过实时荧光定量PCR法和蛋白印迹法检测四皿细胞中的转化生长因子β1的表达水平。结果:1、实时荧光定量PCR结果显示,在心肌梗死模型中,ITGβ3和TGF-β1的表达升高,过表达miRNA-30a-5p能抑制ITGβ3和TGF-β1的表达与对照+缺氧组以及空载病毒+缺氧组相比,整合素β3和转移生长因子β1的mRNA水平在上调组中显著降低而在下调组中升高,(P<0.05)。并且蛋白印迹法检测的结果与rt-PCR的结果一致,(P<0.005)。缺氧导致整合素β3和转移生长因子β1的表达上升,(P<0.05)。2、通过干扰整合素β3的表达,干扰组的细胞中转化生长因子β1的表达比非干扰组显著增加,(P<0.05)。结论:MiRNA-30a-5p可以通过抑制整合素β3的表达来调控转化生长因子β1的表达,miRNA-30a-5p可能成为心肌梗死后心肌纤维化的新的治疗靶点。

关键词： 转化生长因子-β   人卵巢癌细胞系   SK-OV-3细胞   活性氧簇   上皮细胞-间充质转化   线粒体呼吸链复合体Ⅲ  

摘要： 目的观察转化生长因子-β(TGF-β)对人卵巢癌细胞系SK-OV-3活性氧簇(ROS)表达的影响,并探讨其可能机制。方法取对数生长期SK-OV-3细胞,随机分为两组,观察组用2 mL培养液+2μL无血清DMEM配制的5μg/mL TGF-β培养(最终浓度为5 ng/mL),对照组直接加2 mL培养液。流式细胞仪检测细胞内总的活性氧簇(ROS)产生及线粒体来源的ROS,实时荧光定量PCR检测细胞上皮细胞-间充质转化(EMT)变化各指标、线粒体呼吸链复合体Ⅲ组分mRNA。结果观察组及对照组总ROS产生量分别为3 159±42.92、1 062±24.41,两组比较,P<0.05。观察组及对照组细胞内线粒体来源ROS产生量分别为1 254±29.04、1 039±17.32,两组比较,P<0.05。观察组E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、ZEB1分别是对照组的0.200 0、6.739 8、4.487 9、1.639 5倍,P均<0.05。观察组CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCR10、UQCRB、UQCRFS1、UQCRH、UQCRQ mRNA表达水平较对照组改变倍数分别为0.89、1.04、1.09、0.87、1.17、1.18、0.92、1.09、1.07倍,P均>0.05。观察组CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1蛋白水平较对照组改变倍数分别为1.01、0.97、1.07、0.99、1.03倍,P均>0.05。结论TGF-β诱导细胞内总的ROS表达增加,但过量ROS并非来源于线粒体,机制可能是通过调控细胞内氧化-抗氧化平衡系统的关键酶从而改变细胞内的ROS水平。

关键词： 替米沙坦   转化生长因子   Smad2/3   糖尿病  

摘要： 目的研究替米沙坦对转化生长因子β1(TGF-β1)胞内信号蛋白Smad2/3在糖尿病大鼠肾脏表达的影响及意义。方法用链脲佐菌素制备糖尿病大鼠模型,采用免疫组织化学、蛋白质印迹法及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测糖尿病大鼠TGF-β1和Smad2/3在肾组织中的表达水平。结果治疗前,与对照组比,其余组别的血糖(BG)、尿肌酐(Ucr)、内生肌酐清除率(Ccr)和24h尿蛋白(UP)均明显增高(P<0.05),治疗后,与糖尿病4周比,糖尿病8周的BG、Ucr、Ccr和24hUP略有增高。与糖尿病4周和糖尿病8周比,相应替米沙坦干预组的BG、Ucr、Ccr和24hUP显著降低(P<0.05)。免疫组织化学和蛋白质印迹法检验显示,与对照组比,糖尿病4周组和8周组的TGF-β1和Smad2/3在肾组织的表达均明显增高(P<0.05),与糖尿病4周和8周组比,对应替米沙坦干预组的TGF-β1和Smad2/3表达均明显降低(P<0.05)。RT-PCR检测显示,与对照组比,糖尿病4周组和8周组的TGF-β1和Smad2/3mRNA表达均明细增高(P<0.05),与糖尿病4周和8周组比,对应干预组的TGF-β1和Smad2/3mRNA表达均明显降低(P<0.05)。结论替米沙坦可降低糖尿病大鼠肾脏TGF-β1胞内信号蛋白Smad2/3的表达。

关键词： 牙髓干细胞   转化生长因子-β3   Western   blot   成骨  

摘要： 目的:探讨转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3,TGF-β3)诱导体外培养的兔牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成骨向分化的情况。方法:采用酶消化法分离并培养兔DPSCs,光镜下进行形态学观察;并将体外培养的第4代DPSCs分为空白对照组,矿化液阳性对照组与TGF-β3实验组。1、3、5、7 d后采用碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)试剂盒检测各组细胞内ALP活性变化情况;1、3、5、7 d后行细胞免疫化学法检测成骨细胞标记物相关转录因子2(RUNX-2)和骨涎蛋白(BSP)的表达情况;14 d后观察各组细胞的矿化结节情况;7 d后使用Western blot检测各组细胞成骨分化指标BSP变化情况。结果:兔DPSCs在诱导体系中生长状态良好;实验组较两对照组上调细胞内ALP活性明显;免疫化学检测TGF-β3组与矿化液组RUNX-2第5 d呈阳性表达,BSP第7d阳性表达,空白对照组均呈弱阳性;14 d茜素红染色显示TGF-β3组矿化结节较矿化组明显,空白对照组阴性;与对照组相比,TGF-β3可增强兔DPSCs内BSP相关蛋白表达。结论:TGF-β3能够一定程度上促进兔DPSCs成骨向分化。

关键词： 脂氧素A4   Smad7/3   转化生长因子β1   糖尿病肾脏疾病   Notch-1  

摘要： 目的通过观察脂氧素A4(LXA4)对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠肾小管上皮细胞Smad7/3、转化生长因子β1(TGF-β1)蛋白水平,及其对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞Smad7/3、Notch-1蛋白水平的影响,探讨LXA4对糖尿病大鼠肾小管上皮细胞纤维化的潜在保护作用。方法雄性SD大鼠随机分为对照组(Con,n=10)、糖尿病组(DM,n=10)、糖尿病+LXA4组(DM+LXA4,n=10),DM+LXA4组以1mg/kg体质量的LXA4隔日1次尾静脉注射,连续8周;肾小管上皮细胞分为Con组、TGF-β1诱导组、LXA4组以及TGF-β1+LXA4组。免疫组织化学法及Western blot法观察STZ诱导的糖尿病大鼠肾小管上皮细胞Smad7/磷酸化Smad3(p-Smad3)及TGF-β1的蛋白水平,并观察LXA4对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞Smad7、p-Smad3及Notch-1的蛋白水平。结果DM+LXA4组Smad7阳性面积率高于DM组及Con组[(24.18±1.38)%vs(18.56±1.13)%,(24.18±1.38)%vs(21.80±1.82)%,P<0.001]。p-Smad3及TGF-β1阳性面积率率低于DM组[(14.17±1.18)%vs(17.89±2.62)%,(20.53±0.83)%vs(24.91±1.82)%,P<0.05或P<0.001],但高于Con组[(14.17±1.18)%vs(12.68±1.33)%,(20.53±0.83)%vs(18.14±1.48)%,P<0.001]。LXA4组尿白蛋白、Ⅳ型胶原(TⅣC)及TGF-β1排泄率低于DM组[(46.90±17.65)vs(70.60±14.99)mg/g,(87.40±16.25)vs(149.30±15.13)μg/ml,(53.60±14.74)vs(125.70±32.22)pg/ml,P<0.001],但高于Con组[(46.90±17.65)vs(16.70±3.34)mg/g,(87.40±16.25)vs(32.00±10.58)μg/ml,(53.60±14.74)vs(27.10±3.38)pg/ml,P<0.001]。LXA4抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞p-Smad3、和Notch-1的蛋白水平,上调Smad7的表达(P<0.01)。结论LXA4可以通过上调Smad7、下调p-Smad3、TGF-β1及Notch-1的蛋白水平,预防肾小管上皮细胞纤维化,具有潜在防治TIDM肾病的作用。

关键词： 莪术   三棱   药对   子宫肌瘤   转化生长因子β3   基质金属蛋白酶11   大鼠  

摘要： 目的:研究莪术-三棱药对合煎液对大鼠子宫肌瘤的防治作用及机制。方法:将大鼠随机分为正常组、模型组、阳性组(米非司酮,2.25 mg/kg)和药对合煎液组(莪术-三棱药对合煎液,6.0 g/kg),每组10只。除正常组外,其余各组大鼠分别于每周一、三、五im苯甲酸雌二醇注射液(0.5 mg/kg),持续12周;从第13周开始,造模组大鼠增加im黄体酮注射液(5 mg/kg),并每天ig给药1次,至实验第16周。给药结束后,测定大鼠子宫系数,苏木精-伊红染色观察大鼠子宫病理变化并测定平滑肌厚度,免疫组化染色法测定大鼠子宫组织中转化生长因子β_3(TGF-β_3)和基质金属蛋白酶11(MMP-11)蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠子宫系数升高、子宫发生明显病理变化、子宫平滑肌厚度增加、子宫组织中TGF-β_3和MMP-11蛋白表达增强(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,阳性组和药对合煎液组大鼠上述变化均显著改善(P<0.05或P<0.01)。结论:莪术-三棱药对合煎液对大鼠子宫肌瘤有一定的防治作用,其机制可能与下调子宫组织中TGF-β_3、MMP-11蛋白表达有关。

关键词： 肺癌   外源性信号素3A   信号通路   转化生长因子-β1   Akt磷酸化  

摘要： 目的:探讨外源性信号素3A(Sema 3A)信号通路对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肺癌A549细胞侵袭、增殖的影响及可能作用机制。方法:将肺癌A549细胞分为3组,即空白对照组、TGF-β1诱导组(TGF-β1组)、Sema 3A预处理组(Sema 3A+TGF-β1组)。空白对照组细胞正常培养;TGF-β1组加入5μg·L^(-1)TGF-β1;Sema 3A+TGF-β1组首先加入10μmol·L^(-1)Sema 3A,预处理40~50 min后再加入5μg·L^(-1)TGF-β1。检测细胞增殖、侵袭能力和E-cadherin、Akt、P-Akt蛋白表达。结果:Sema 3A+TGF-β1组细胞Sema 3A mRNA相对表达水平显著高于空白对照组和TGF-β1组(均P<0.05)。培养36 h^72 h内,TGF-β1组细胞增殖率显著高于Sema 3A+TGF-β1组和空白对照组(均P<0.05),Sema 3A+TGF-β1组细胞增殖率显著高于空白对照组(均P<0.05)。TGF-β1组穿透滤膜细胞数显著高于Sema 3A+TGF-β1组和空白对照组(均P<0.05),Sema 3A+TGF-β1组穿透滤膜细胞数显著高于空白对照组(P<0.05)。TGF-β1组E-cadherin蛋白表达显著低于Sema 3A+TGF-β1组和空白对照组(均P<0.05),P-Akt蛋白显著高于Sema 3A+TGF-β1组和空白对照组(均P<0.05);Sema 3A+TGF-β1组E-cadherin蛋白表达显著低于空白对照组(P<0.05),P-Akt显著高于空白对照组(P<0.05)。结论:Sema 3A能够抑制TGF-β1诱导肺癌细胞侵袭、增殖的效应,其机制可能与抑制Akt磷酸化、上调E-cadherin表达有关。