关键词： Nod样受体蛋白3   转化生长因子β   增生性玻璃体视网膜疾病   视网膜色素上皮细胞   白细胞介素-18   白细胞介素-1β  

摘要： 目的探讨转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)刺激下Nod样受体蛋白3(nod-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体在视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)增殖中的表达变化及意义。方法利用TGF-β刺激RPE细胞增殖模拟增生性玻璃体视网膜病变模型,随机分为空白对照组(Sham组)和TGF-β诱导RPE细胞增殖组(TGF-β组),TGF-β组再根据浓度(0.5μg·L^(-1)、2.5μg·L^(-1)、10.0μg·L^(-1)、12.5μg·L^(-1))分组。利用MTT微量酶比色法检测RPE细胞增殖情况;Western blot观察NLRP3蛋白的表达变化;利用标准ELISA试剂盒检测白细胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-18表达情况。结果与Sham组比较,0.5μg·L^(-1) TGF-β组RPE细胞增殖不明显,差异无统计学意义(P>0.05),但NLRP3、IL-1β和IL-18表达明显提高(均为P<0.01);2.5μg·L^(-1)、10.0μg·L^(-1)和12.5μg·L^(-1)TGF-β组RPE细胞增殖明显,NLRP3、IL-1β和IL-18表达均提高(均为P<0.05);与0.5μg·L^(-1) TGF-β组相比,2.5μg·L^(-1)、10.0μg·L^(-1)和12.5μg·L^(-1)TGF-β组RPE细胞增殖显著增加,NLRP3、IL-1β和IL-18表达均下降,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论不同浓度TGF-β诱导RPE细胞增殖中NLRP3炎症小体表达变化不同,两者可能相互调控影响RPE细胞增殖,在增生性玻璃体视网膜疾病发生发展中具有重要的作用。

关键词： 转化生长因子β3   兔牙髓干细胞   成骨向分化   Smad通路  

摘要： 目的探讨转化生长因子β3(transforming growth factorβ3,TGF-β3)体外联合兔牙髓干细胞(rabbit dental pulp stem cells,r DPSCs)诱导其成骨向分化的作用机制。方法酶解组织块法分离获得r DPSCs;将r DPSCs分为实验组(r DPSCs+80μg/L TGF-β3)、对照组(r DPSCs+矿化液)和空白组(r DPSCs),3组细胞分别培养7、14 d后行ALP活性定量检测; RT-qPCR检测COL-1A1、Runx-2、OPN、BSP和Smad4基因的表达; Western blot法检测COL-1A1和Runx-2蛋白的表达情况;茜素红染色观察矿化结节形成情况。结果成功分离获得r DPSCs;实验组ALP含量明显高于对照组和空白组(P<0.05); COL-1A1、Runx-2、OPN、BSP、Smad4基因的表达均高于空白组(P<0.05); COL-1A1、Smad4基因的表达高于对照组(P<0.05); Western blot结果示实验组COL-1A1和Runx-2蛋白的表达均强于其余两组(P<0.05);实验组矿化结节较其余两组明显。结论 TGF-β3体外促进r DPSCs成骨向分化; TGF-β3促进r DPSCs成骨向分化可能通过激活Smad通路来实现。

关键词： 增生性瘢痕   成纤维细胞   脉冲染料激光   转化生长因子β1   转化生长因子β3  

摘要： 目的探讨不同能量脉冲染料激光(Pulsed dye laser,PDL)对体外人瘢痕成纤维细胞转化生长因子(TGF)-β1和TGF-β3表达的影响。方法按组织块法体外培养人瘢痕成纤维细胞,分别用4、6、8、10、11、12 J/cm2能量的PDL照射细胞,观察不同能量PDL对细胞周期的影响,酶联免疫吸附测定(ELLSA)法检测激光照射后TGF-β1、TGF-β3的分泌量。结果 PDL照射后,处于G1期的瘢痕成纤维细胞较对照组明显增多;不同能量PDL照射瘢痕成纤维细胞后,TGF-β1的分泌量随激光能量密度的升高而降低,TGF-β3的分泌量则增加,差异有统计学意义。结论 PDL对瘢痕的治疗作用可能与抑制细胞增殖,减少瘢痕成纤维细胞TGF-β1分泌,增加TGF-β3的分泌有关。

关键词： 牙髓干细胞   转化生长因子-β3   骨形成蛋白-2   成骨向分化  

摘要： 目的探讨转化生长因子-β_3(transforming growth factor-β_3,TGF-β_3)、骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)对牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成骨向分化的影响。方法健康新西兰幼兔4只,取牙髓组织采用酶解组织块法分离培养获得DPSCs,镜下观察细胞形态及生长状况。将培养的第3代DPSCs分为BMP-2组和TGF-β_3组,分别加入浓度为80μg/L的BMP-2、TGF-β_3的完全培养液,采用免疫组织化学法于诱导第3、7天检测Ⅰ型胶原蛋白(collagen-Ⅰ,COL-Ⅰ)表达,于第7、14天检测骨钙素(osteocalcin,OC)表达;诱导第7、14天,对BMP-2组、TGF-β_3组行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色后,倒置显微镜下观察ALP活性染色结果。结果兔DPSCs分离、培养48h,组织块周围有细胞游出、贴壁生长,培养的第3代兔DPSCs大多为长梭形,也可为多角形,呈巢式或集落生长;TGF-β_3组诱导第3天COL-1表达的累计吸光度(integrated optiacal density,IOD)值(159 676.79±63 959.56)高于BMP-2组(44 047.33±15 853.65)(P<0.05),诱导第7天COL-1表达的IOD值(245 378.26±60 084.60)与BMP-2组(223 294.43±80 266.72)比较差异无统计学意义(P>0.05);TGF-β_3组诱导第7天OC表达的IOD值(109 568.82±14 079.88)高于BMP-2组(55 168.57±1 694.93)(P<0.05),诱导第14天OC表达的IOD值(411 544.95±82 803.24)与BMP-2组(360 103.54±20 835.36)比较差异无统计学意义(P>0.05);BMP-2组、TGF-β_3组诱导第7天出现少量淡蓝色ALP阳性区,诱导第14天蓝色ALP阳性区增大且蓝染颜色加重,镜下观察2组无明显差异。结论与BMP-2比较,TGF-β_3对早期兔DPSCs向成骨细胞分化有较明显的促进作用。

关键词： 关节软骨细胞   骨髓间充质干细胞   共培养   增殖   分化   糖胺聚糖   Ⅱ型胶原   转化生长因子β3   缝隙连接   连接蛋白   干细胞   软骨细胞   骨髓   间质干细胞   共同培养技术   转化生长因子β3   连接蛋白43   组织工程  

摘要： 背景:在关节软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养环境中,软骨细胞功能活跃,增殖速度加快,骨髓间充质干细胞促进了软骨细胞的表型维持,而且少量软骨细胞提供的微环境能够诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化,降低了软骨分化过程中出现的肥大表型和软骨内骨化,但是影响共培养系统中细胞增殖分化的因素和细胞间相互作用的机制尚不明确。目的:观察软骨细胞和骨髓间充质干细胞接触共培养对细胞增殖分化的影响,进一步优化共培养方式,为探讨共培养系统中二者的相互作用机制提供依据。方法:分离和培养新西兰兔(南京医科大学实验动物中心提供)软骨细胞和骨髓间充质干细胞,取第2代软骨细胞和骨髓间充质干细胞,以1∶3的比例直接混合在24孔板进行接触共培养为接触共培养组,以1∶3比例分别在Transwell的上室和下室进行非接触共培养为非接触共培养组,共培养21d。细胞爬片进行甲苯胺蓝染色、COL2a1及Cx43细胞免疫化学染色。应用CCK8检测共培养系统中细胞的增殖情况,ELISA检测共培养细胞上清液中糖胺聚糖和转化生长因子β3水平,Western blot检测共培养细胞COL2a1和Cx43的表达。然后添加转化生长因子β3进行软骨细胞和骨髓间充质干细胞接触共培养和非接触共培养,比较细胞增殖、糖胺聚糖水平、COL2a1及Cx43蛋白表达的变化。结果与结论:(1)随着共培养时间的延长,细胞增殖能力逐渐增高,接触共培养组细胞吸光度值明显高于非接触共培养组(P <0.05),糖胺聚糖和转化生长因子β3水平以及COL2a1和Cx43的蛋白表达明显高于非接触共培养组;(2)添加10μg/L转化生长因子β3共培养21 d,接触共培养组细胞增殖、糖胺聚糖水平、COL2a1及Cx43的表达与未添加转化生长因子β3比较无明显变化(P>0.05),而非接触共培养组的细胞增殖、糖胺聚糖水平、COL2a1及Cx43蛋白表达明显提高(P<0.05),但仍明显低于未添加转化生长因子β3的接触共培养组(P <0.05);(3)结果表明,接触共培养比非接触共培养明显促进细胞的增殖和分化,Cx43在其中起重要作用。

关键词： 辛伐他汀   转化生长因子β1/Smad 3   牙槽骨成骨细胞  

摘要： 目的探讨辛伐他汀对牙槽骨成骨细胞的影响。方法本实验将牙槽骨成骨细胞分为对照组和低、中、高3个剂量实验组,分别为予以0,1,10,100nmol·L;辛伐他汀,孵育72 h。用噻唑蓝（MTT）法测定辛伐他汀干预24,48,72 h后的细胞增殖活力,用流式细胞仪法测定辛伐他汀干预后24 h细胞凋亡情况,用实时荧光聚合酶链式反应检测Smad 3 mRNA的表达水平,用酶联免疫吸附实验法检测转化生长因子β1（TGF-β1）的表达变化。结果干预48,72 h后,中剂量实验组的细胞存活率分别为（69. 10±2. 91）%和（83. 90±3. 56）%,均显著高于对照组的（52. 00±3. 63）%和（70. 00±2. 61）%,差异均有统计学意义（P <0. 05）。干预24 h后,低、中、高3个剂量实验组和对照组的细胞凋亡率分别为（17. 10±1. 10）%,（18. 90±1. 22）%,（27. 23±1. 14）%和（28. 70±1. 53）%,低、中剂量实验组的细胞凋亡率和对照组比较,差异均有统计学意义（均P <0. 05）。干预24 h后,低、中、高3个剂量实验组和对照组的Smad 3 mRNA分别为（2. 25±0. 46）,（1. 95±0. 37）,（1. 75±0. 31）和（2. 73±0. 37）,低、中、高3个剂量实验组的Smad 3 mRNA和对照组比较,差异均有统计学意义（均P <0. 05）。干预24 h后,低、中、高3个剂量实验组和对照组的TGF-β1表达量分别为（43. 42±2. 12）,（40. 16±2. 51）,（34. 24±3. 13）和（43. 57±3. 82）,中、高2个剂量实验组和对照组比较,差异均有统计学意义（均P <0. 05）。结论辛伐他汀通过调节TGF-β1/Smad 3通路抑制牙槽骨成骨细胞的凋亡。

关键词： 转化生长因子β3   兔牙髓干细胞   成骨向分化   Smad通路  

摘要： 目的:探讨转化生长因子β3(transforming growth factorβ3,TGF-β3)体外联合兔牙髓干细胞(rabbit dental pulp stem cells,rDPSCs)诱导其成骨向分化的效果及其作用机制。方法:酶解组织块法分离获得rDPSCs;将第三代rDPSCs分为实验组(rDPSCs+80ng/mL TGF-β3),对照组(rDPSCs+矿化液)和空白组(rDPSCs),三组细胞分别培养第7、14 d行ALP活性定量检测;第3、7、14 d免疫细胞化学染色法行COL-IA1、OCN,Runx-2染色;第7、14 d RT-qPCR检测各组ALP、COL-1A1、OCN、Runx-2、OPN、BSP、Smad4表达水平;培养第7、14、28d茜素红染色观察矿化结节。结果:成功分离获得rDPSCs;实验组ALP含量明显高于对照组和空白组(P<0.05);免疫细胞化学染色结果示实验组成骨蛋白表达明显强于其余两组;COL-1A1、Runx-2、OPN、BSP、Smad4基因的表达均高于空白组(P<0.05);COL-1A1、Smad4基因的表达高于对照组(P<0.05);实验组矿化结节较其余两组明显。结论:TGF-β3体外有效促进rDPSCs成骨向分化,缩短成骨形成的时间;TGF-β3促进rDPSCs成骨向分化可能通过激活Smad通路来实现。

关键词： 心肌梗死   心肌纤维化   转化生长因子β3   血管紧张素Ⅱ   心肌成纤维细胞   smad7  

摘要： 研究背景心肌梗死(myocardial infarction,MI)后,心肌细胞缺血坏死,心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及炎性细胞分泌大量细胞外基质替代心肌细胞,进而心室结构和功能发生相应改变,引起心肌纤维化,导致心室重构,这个过程能够影响心肌梗死患者预后。病理性心室重构的基本特征是心肌成纤维细胞的异常聚集和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白的过度沉积。在MI的发生和发展过程中,组织中众多细胞因子将不同来源的心肌成纤维细胞招募至损伤区域,合成和分泌大量以Ⅰ、III型胶原蛋白为主的细胞外基质,这些细胞外基质与原有心肌细胞之间相互作用,维持心脏结构和功能的稳定。然而,细胞外基质的过度聚集和沉积,在心肌梗死晚期修复中能够引起心肌纤维化,导致心功能不全。心肌纤维化的调控是改善心肌梗死患者预后的关键因素之一。心肌成纤维细胞是心脏中重要的一类细胞,参与心肌梗死后心脏组织收缩和心肌电生理活动的维持。与其他器官不同的是,心脏损伤后的再生能力有限,其修复过程涉及坏死的心肌细胞被清除,瘢痕组织置换原有的心肌细胞。这种修复方式能够保持心脏结构和功能一定的稳定性。与此同时,在心肌细胞损伤后,心肌成纤维细胞发生表型转化,表达收缩蛋白和α-平滑肌肌动蛋白,转化成为肌原性细胞表型,分泌Ⅰ、III型胶原及胶原交联分子,最终导致心肌纤维化。肾素-血管张素-醛固酮系统(Renin-angiotensin-aldosterone System,RAAS)在心脏血管结构改变时被激活,参与心肌和血管修复,与MI后心肌纤维化有直接关系。血管紧张素II(Angiotensin II,Ang II)是RAAS中的主要活性物质。研究表明,与正常组相比,MI患者组心肌组织中Ang II水平明显升高,提示Ang II参与心肌梗死后心肌微环境改变以及心肌组织修复。Ang II能够作用于心肌成纤维细胞,促进心肌成纤维细胞增殖、迁移、表型转换、胶原蛋白的合成和胶原的交联,最终诱导心肌纤维化的形成。因此,Ang II可作为诱导因子之一可模拟、构建心肌梗死后局部微环境。本实验拟采用Ang II刺激人心肌成纤维细胞,模拟心肌梗死后局部心脏微环境,研究心肌梗死后心肌纤维化相关机制。在参与调节ECM稳态代谢的细胞因子中,与ECM积聚关系最为密切的是转化生长因子β(Transforming growth factor,TGFβ)家族。RAAS和TGFβ家族之间具有许多联系,例如,Ang II能够在多种细胞中促进TGFβ的合成。在多种病理生理学效应中,TGFβ作用于Ang II下游,参与Ang II对生物功能的调节。心室重构中,TGFβ的作用在一定程度上是通过Ang II介导的。TGFβ3定位于人类第14号染色体,在细胞的生长发育中具有重要作用,具有抗组织纤维化的作用。在心肌梗死的发生和发展中,TGFβ1在梗死后6小时开始分泌,72h达高峰,而TGFβ3在梗死后48小时开始分泌,32天达到高峰。这提示TGFβ3能够通过参与的心肌细胞基质抑制性代谢活动对抗心肌纤维化,在纤维化后剩余心肌过度收缩导致的心脏破裂中起一定的作用。TGFβ有3种类型受体,Ⅰ型(TβR-Ⅰ)(又被称为ALK5)、Ⅱ型(TβR-Ⅱ)和Ⅲ型受体(TβR-Ⅲ),为跨膜糖蛋白受体。Smad蛋白是TβR-Ⅰ的直接作用底物之一,是能够将TGFβ与TβR相互作用的信号从胞浆传递到细胞核内的中间介质。活化的Smads进入核内后与其他转录因子一起共同参与靶基因的转录。研究显示,TGFβ3能够促进肝星状细胞中smad7的表达。因此,推测TGFβ3可能通过活化smad7从而抑制胶原的表达。在心脏中,心肌成纤维细胞已经被确认为合成和分泌胶原的主要细胞。前期实验中,我们检测到在心肌梗死组织中TGFβ3表达水平增高,因此,本课题拟以人心肌成纤维细胞为对象,通过组织学染色、ELISA、细胞培养、细胞增殖和迁移实验、细胞毒性实验、细胞转染、细胞免疫荧光、蛋白印迹(Western blot)等方法,研究TGFβ3对心肌成纤维细胞的作用及其相关分子机制,进一步探讨TGFβ3在拮抗心肌纤维化过程中的作用和机制,为心肌纤维化后心室重构的临床治疗提供理论依据。结果显示:1、MI导致心肌组织中TGFβ3表达持续性增加;2、TGFβ3抑制心肌成纤维细胞增殖、迁移和胶原合成;3、TGFβ3促进人心肌成纤维细胞表达LOX、OPN和α-SMA;4、TGFβ3抑制心肌成纤维细胞中TGFβ/smad信号通路的磷酸化水平;TGFβ3通过上调TGFβ/smad信号通路中smad7蛋白的磷酸化水平调节心肌成纤维细胞的增殖、迁移和胶原合成。结论:TGFβ3通过调节TGFβ/smad信号通路中smad7从而抑制心肌梗死后心肌重构。

关键词： 牙髓干细胞   转化生长因子-β3   成骨细胞   蛋白质印迹法  

摘要： 目的 研究转化生长因子-β3(TGF-β3)对体外培养的兔牙髓干细胞(DPSCs)成骨向分化的影响。方法 采用酶消化法分别将兔牙髓与颅骨分离培养获得DPSCs与成骨细胞(OB),通过光镜观察细胞形态,免疫组化染色和茜素红染色对OB进行鉴定。取第3代DPSCs与OB,分为3组:DPSCs组(空白对照组)、OB组(阳性对照组)及DPSCs+TGF-β3组(实验组)。培养第5天采用免疫组化染色检测各组细胞内Runt相关转录因子2(Runx-2)的表达;培养第7天采用碱性磷酸酶(ALP)活性测定试剂盒检测各组细胞内ALP的活性;培养第1、3、5、7天采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测各组成骨特异性标志物Runx-2及TGF-β3蛋白的表达。结果 兔DPSCs多呈长梭形,突触多,OB多呈短梭形或成纤维样细胞形态,突触少而丰满;DPSCs与OB鉴定阳性。培养第5天,OB组与DPSCs+TGF-β3组细胞中的Runx-2蛋白表达均呈强阳性;培养第7天,两组细胞内的ALP活性差异无统计学意义(P>0.05)。Western Blot结果显示,培养各时间点DPSCs组与另外两组比较Runx-2和TGF-β3蛋白相对表达量差异均具有统计学意义(均P<0.05);培养第7天,DPSCs+TGF-β3组Runx-2和TGF-β3蛋白相对表达量均高于另外两组,差异均具有统计学意义(均P<0.01)。结论 TGF-β3可促进DPSCs成骨早期特异性蛋白的表达。