关键词： 转化生长因子β3   兔牙髓干细胞   成骨向分化   Smad通路  

摘要： 目的:探讨转化生长因子β3(transforming growth factorβ3,TGF-β3)体外联合兔牙髓干细胞(rabbit dental pulp stem cells,rDPSCs)诱导其成骨向分化的效果及其作用机制。方法:酶解组织块法分离获得rDPSCs;将第三代rDPSCs分为实验组(rDPSCs+80ng/mL TGF-β3),对照组(rDPSCs+矿化液)和空白组(rDPSCs),三组细胞分别培养第7、14 d行ALP活性定量检测;第3、7、14 d免疫细胞化学染色法行COL-IA1、OCN,Runx-2染色;第7、14 d RT-qPCR检测各组ALP、COL-1A1、OCN、Runx-2、OPN、BSP、Smad4表达水平;培养第7、14、28d茜素红染色观察矿化结节。结果:成功分离获得rDPSCs;实验组ALP含量明显高于对照组和空白组(P<0.05);免疫细胞化学染色结果示实验组成骨蛋白表达明显强于其余两组;COL-1A1、Runx-2、OPN、BSP、Smad4基因的表达均高于空白组(P<0.05);COL-1A1、Smad4基因的表达高于对照组(P<0.05);实验组矿化结节较其余两组明显。结论:TGF-β3体外有效促进rDPSCs成骨向分化,缩短成骨形成的时间;TGF-β3促进rDPSCs成骨向分化可能通过激活Smad通路来实现。

关键词： 心肌梗死   心肌纤维化   转化生长因子β3   血管紧张素Ⅱ   心肌成纤维细胞   smad7  

摘要： 研究背景心肌梗死(myocardial infarction,MI)后,心肌细胞缺血坏死,心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及炎性细胞分泌大量细胞外基质替代心肌细胞,进而心室结构和功能发生相应改变,引起心肌纤维化,导致心室重构,这个过程能够影响心肌梗死患者预后。病理性心室重构的基本特征是心肌成纤维细胞的异常聚集和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白的过度沉积。在MI的发生和发展过程中,组织中众多细胞因子将不同来源的心肌成纤维细胞招募至损伤区域,合成和分泌大量以Ⅰ、III型胶原蛋白为主的细胞外基质,这些细胞外基质与原有心肌细胞之间相互作用,维持心脏结构和功能的稳定。然而,细胞外基质的过度聚集和沉积,在心肌梗死晚期修复中能够引起心肌纤维化,导致心功能不全。心肌纤维化的调控是改善心肌梗死患者预后的关键因素之一。心肌成纤维细胞是心脏中重要的一类细胞,参与心肌梗死后心脏组织收缩和心肌电生理活动的维持。与其他器官不同的是,心脏损伤后的再生能力有限,其修复过程涉及坏死的心肌细胞被清除,瘢痕组织置换原有的心肌细胞。这种修复方式能够保持心脏结构和功能一定的稳定性。与此同时,在心肌细胞损伤后,心肌成纤维细胞发生表型转化,表达收缩蛋白和α-平滑肌肌动蛋白,转化成为肌原性细胞表型,分泌Ⅰ、III型胶原及胶原交联分子,最终导致心肌纤维化。肾素-血管张素-醛固酮系统(Renin-angiotensin-aldosterone System,RAAS)在心脏血管结构改变时被激活,参与心肌和血管修复,与MI后心肌纤维化有直接关系。血管紧张素II(Angiotensin II,Ang II)是RAAS中的主要活性物质。研究表明,与正常组相比,MI患者组心肌组织中Ang II水平明显升高,提示Ang II参与心肌梗死后心肌微环境改变以及心肌组织修复。Ang II能够作用于心肌成纤维细胞,促进心肌成纤维细胞增殖、迁移、表型转换、胶原蛋白的合成和胶原的交联,最终诱导心肌纤维化的形成。因此,Ang II可作为诱导因子之一可模拟、构建心肌梗死后局部微环境。本实验拟采用Ang II刺激人心肌成纤维细胞,模拟心肌梗死后局部心脏微环境,研究心肌梗死后心肌纤维化相关机制。在参与调节ECM稳态代谢的细胞因子中,与ECM积聚关系最为密切的是转化生长因子β(Transforming growth factor,TGFβ)家族。RAAS和TGFβ家族之间具有许多联系,例如,Ang II能够在多种细胞中促进TGFβ的合成。在多种病理生理学效应中,TGFβ作用于Ang II下游,参与Ang II对生物功能的调节。心室重构中,TGFβ的作用在一定程度上是通过Ang II介导的。TGFβ3定位于人类第14号染色体,在细胞的生长发育中具有重要作用,具有抗组织纤维化的作用。在心肌梗死的发生和发展中,TGFβ1在梗死后6小时开始分泌,72h达高峰,而TGFβ3在梗死后48小时开始分泌,32天达到高峰。这提示TGFβ3能够通过参与的心肌细胞基质抑制性代谢活动对抗心肌纤维化,在纤维化后剩余心肌过度收缩导致的心脏破裂中起一定的作用。TGFβ有3种类型受体,Ⅰ型(TβR-Ⅰ)(又被称为ALK5)、Ⅱ型(TβR-Ⅱ)和Ⅲ型受体(TβR-Ⅲ),为跨膜糖蛋白受体。Smad蛋白是TβR-Ⅰ的直接作用底物之一,是能够将TGFβ与TβR相互作用的信号从胞浆传递到细胞核内的中间介质。活化的Smads进入核内后与其他转录因子一起共同参与靶基因的转录。研究显示,TGFβ3能够促进肝星状细胞中smad7的表达。因此,推测TGFβ3可能通过活化smad7从而抑制胶原的表达。在心脏中,心肌成纤维细胞已经被确认为合成和分泌胶原的主要细胞。前期实验中,我们检测到在心肌梗死组织中TGFβ3表达水平增高,因此,本课题拟以人心肌成纤维细胞为对象,通过组织学染色、ELISA、细胞培养、细胞增殖和迁移实验、细胞毒性实验、细胞转染、细胞免疫荧光、蛋白印迹(Western blot)等方法,研究TGFβ3对心肌成纤维细胞的作用及其相关分子机制,进一步探讨TGFβ3在拮抗心肌纤维化过程中的作用和机制,为心肌纤维化后心室重构的临床治疗提供理论依据。结果显示:1、MI导致心肌组织中TGFβ3表达持续性增加;2、TGFβ3抑制心肌成纤维细胞增殖、迁移和胶原合成;3、TGFβ3促进人心肌成纤维细胞表达LOX、OPN和α-SMA;4、TGFβ3抑制心肌成纤维细胞中TGFβ/smad信号通路的磷酸化水平;TGFβ3通过上调TGFβ/smad信号通路中smad7蛋白的磷酸化水平调节心肌成纤维细胞的增殖、迁移和胶原合成。结论:TGFβ3通过调节TGFβ/smad信号通路中smad7从而抑制心肌梗死后心肌重构。

关键词： 牙髓干细胞   转化生长因子-β3   成骨细胞   蛋白质印迹法  

摘要： 目的 研究转化生长因子-β3(TGF-β3)对体外培养的兔牙髓干细胞(DPSCs)成骨向分化的影响。方法 采用酶消化法分别将兔牙髓与颅骨分离培养获得DPSCs与成骨细胞(OB),通过光镜观察细胞形态,免疫组化染色和茜素红染色对OB进行鉴定。取第3代DPSCs与OB,分为3组:DPSCs组(空白对照组)、OB组(阳性对照组)及DPSCs+TGF-β3组(实验组)。培养第5天采用免疫组化染色检测各组细胞内Runt相关转录因子2(Runx-2)的表达;培养第7天采用碱性磷酸酶(ALP)活性测定试剂盒检测各组细胞内ALP的活性;培养第1、3、5、7天采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测各组成骨特异性标志物Runx-2及TGF-β3蛋白的表达。结果 兔DPSCs多呈长梭形,突触多,OB多呈短梭形或成纤维样细胞形态,突触少而丰满;DPSCs与OB鉴定阳性。培养第5天,OB组与DPSCs+TGF-β3组细胞中的Runx-2蛋白表达均呈强阳性;培养第7天,两组细胞内的ALP活性差异无统计学意义(P>0.05)。Western Blot结果显示,培养各时间点DPSCs组与另外两组比较Runx-2和TGF-β3蛋白相对表达量差异均具有统计学意义(均P<0.05);培养第7天,DPSCs+TGF-β3组Runx-2和TGF-β3蛋白相对表达量均高于另外两组,差异均具有统计学意义(均P<0.01)。结论 TGF-β3可促进DPSCs成骨早期特异性蛋白的表达。

关键词： 抗原   CD31   转化生长因子β1   Smad3蛋白质   伤口愈合   人促红细胞生成素  

摘要： 目的探究人促红细胞生成素（hEPO）对大鼠急性创面愈合相关转化生长因子β1（TGF－β1）/Smad3信号转导通路的影响。方法选取72只健康SD大鼠，在大鼠背部制成直径约2.5 cm的圆形急性创面，按随机数字表法将大鼠分为生理盐水对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组18只。4组大鼠每日常规清创后，生理盐水对照组大鼠创面予1 mL生理盐水浸润的纱布外敷，低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠创面每天分别予1 mL 50、100、150 U的hEPO浸润的纱布湿敷，再用6层干纱布包扎固定，每天换药1次。治疗3、7、14 d每组取6只大鼠行大体观察并计算创面愈合率，处死后取创面组织采用免疫组织化学法观察CD31和TGF－β1的表达，蛋白质印迹法检测3只大鼠磷酸化Smad3蛋白的表达。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD检验、Bonferroni校正。结果（1）治疗3 d，4组大鼠创面均有明显的渗出并有结痂。治疗7 d，低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠创面均较生理盐水对照组明显缩小。治疗14 d，4组大鼠创面均全部愈合。治疗7 d，与生理盐水对照组相比，中剂量组、高剂量组大鼠创面愈合率明显增加（P〈0.01）；余时间点，各组大鼠创面愈合率相近（P〉0.05）。（2）CD31主要定位在血管上。除低剂量组治疗3、7 d（P〉0.05）外，低剂量组大鼠治疗14 d和中剂量组、高剂量组大鼠治疗3～14 d创面组织中CD31表达均明显高于生理盐水对照组（P〈0.01）；除治疗3 d（P〉0.05）外，中剂量组和高剂量组大鼠治疗7、14 d创面组织中CD31表达均明显高于低剂量组（P〈0.01）；除治疗3 d（P〉0.05）外，高剂量组大鼠治疗7、14 d创面组织中CD31表达明显高于中剂量组（P〈0.01）。（3）除低剂量组治疗3 d（1.9±0.7，P〉0.05）外，低剂量组大鼠治疗7、14 d（3.3±1.0、3.7±0.7）和中剂量组、高剂量组大鼠治疗3～14 d创面组织中TGF－β1表达（3.3±1.0、3.6±1.0、3.9±0.9，3.4±0.7、3.8±0.8、4.2±0.4）均明显高于生理盐水对照组（1.7±0.5、2.7±1.0、3.0±0.9，P〈0.01）；除治疗7 d（P〉0.05）外，中剂量组和高剂量组大鼠治疗3、14 d创面组织中TGF－β1表达均明显高于低剂量组（P〈0.01）；除治疗14 d（P〈0.01）外，高剂量组大鼠治疗3、7 d创面组织中TGF－β1表达与中剂量组相近（P〉0.05）。（4）除低剂量组治疗3、14 d及中剂量组和高剂量组治疗14 d（P〉0.05）外，3组大鼠余时间点创面组织中磷酸化Smad3蛋白表达明显高于生理盐水对照组（P〈0.01）；除治疗14 d（P〉0.05）外，中剂量组和高剂量组大鼠治疗3、7 d创面组织中磷酸化Smad3蛋白表达明显高于低剂量组（P〈0.01）；除治疗14 d（P〉0.05）外，高剂量组大鼠治疗3、7 d创面组织中磷酸化Smad3蛋白表达明显低于中剂量组（P〈0.01）。结论外源性hEPO可提高大鼠急性创面CD31、TGF－β1、磷酸化Smad3的表达，促进创面血管新生，激活TGF－β1/Smad3信号转导通路促进创面愈合。

关键词： 肝硬化   转化生长因子β   信号转导和转录激活因子3   肝星状细胞   上皮间充质转化  

摘要： 肝纤维化是慢性肝损伤中常见的病理反应。在肝损伤的病理过程中，不同细胞因子通过与肝纤维化有关的信号传导途径分泌，介导肝细胞的修复、增生以及肝脏的纤维化。在这些途径中，转化生长因子β（TGFβ）和信号转导和转录激活因子3（STAT3）在肝星状细胞（HSCs）的增殖和活化中起关键作用，并促进上皮间充质转化反应发生，这在肝纤维化过程中起到了至关重要的作用，其中还包含胶原和细胞外基质分子增生以及向肌成纤维细胞转化。TGFβ和STAT3分子相关信号通路介导成熟上皮细胞失去上皮表型和基因表达，使其转变为间充质细胞，并有对肝细胞产生抗凋亡和促进HSCs增殖作用。然而，STAT3和TGFβ分子对肝纤维化发生和进展相关机制尚未明确。拟通过综述了解有关TGFβ和STAT3分子介导潜在的肝纤维化机制，并探讨它们在促进HSCs生成和上皮间充质转化反应过程中的关系和相互作用。

关键词： 盆腔器官脱垂   TGF-β1/Smad   3   机械力   胶原蛋白   弹性蛋白  

摘要： 目的探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)/Smad 3信号通路在机械力下调盆底成纤维细胞胶原、弹性蛋白表达中的作用。方法收集2013年1月至2015年1月于武汉大学人民医院因非盆腔器官脱垂行阴式全子宫切除患者的骶主韧带组织,原代培养成纤维细胞,根据干预因素不同进行如下分组:(1)对照组:未加力及不添加TGF-β1孵育的细胞爬片细胞;(2)机械力组(cyclic mechanical stretch,CMS组):力学参数4 mm 0. 5 Hz的机械力加载人盆底成纤维细胞4 h;(3) TGF-β1组:10 ng/m L TGF-β1孵育人盆底成纤维细胞24 h;(4) TGF-β1+CMS组:10 ng/m L TGF-β1孵育人盆底成纤维细胞24 h后,力学参数4 mm 0. 5 Hz的机械力加载人盆底成纤维细胞4 h。采用Western blot检测各组中TGF-β1、Smad 2/3(drosophila mothers against decapentaplegic 2/3,Smad 2/3)、磷酸化(phosphorylation,p-) Smad 2、磷酸化(phosphorylation,p-) Smad 3蛋白表达情况。结果与对照组相比,CMS组TGF-β1、p-Smad 3、I型胶原蛋白A1(Collagen 1A1,COL 1A1)、Ⅲ型胶原蛋白A1(Collagen 3A1,COL 3A1)、弹性蛋白(Elastin)表达明显下调,差异均有统计学意义(P <0. 05),Smad 2/3、p-Smad 2蛋白表达差异无统计学意义(P> 0. 05)。TGF-β1+CMS组与TGF-β1组相比,p-Smad 3、COL 1A1、COL 3A1、Elastin蛋白表达明显下调,差异均有统计学意义(P<0. 05),Smad 3蛋白表达差异无统计学意义(P> 0. 05)。与对照组相比,TGF-β1组COL 1A1、COL 3A1、Elastin、p-Smad 3蛋白表达明显上调,差异均有统计学意义(P <0. 05),Smad 3蛋白表达差异无统计学意义(P> 0. 05)。TGF-β1+CMS组与CMS组相比,p-Smad 3、COL 1A1、COL 3A1、Elastin蛋白表达明显上调,差异均有统计学意义(P <0. 05),Smad 3蛋白表达差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论机械力下调盆底成纤维细胞内TGF-β1蛋白表达,抑制Smad 3信号通路磷酸化,从而下调COL 1A1、COL 3A1及Elastin蛋白表达;外源性TGF-β1磷酸化激活Smad 3后可修复机械力对人盆底成纤维细胞ECM代谢损伤。

关键词： 髓核间充质干细胞   分化   骨形态生成蛋白2   转化生长因子β3   椎间盘退变  

摘要： 背景:髓核间充质干细胞(nucleus pulposus mesenchymal stem cells, NPSCs)在椎间盘损伤退变修复中具有重要应用价值,诱导髓核间充质干细胞向类髓核细胞分化是关键步骤。目的目的:探讨联合使用骨形态生成蛋白2(bone mor-phogenetic protein 2, BMP-2)和转化生长因子β3(transforming growth factorβ3, TGF-β3)诱导髓核间充质干细胞向类髓核细胞分化的可行性及效果。方法方法:取3月龄大鼠尾椎髓核组织,分离培养髓核间充质干细胞,并进行形态学观察、三系分化鉴定和流式细胞术检测干细胞表面抗原。将培养获得的NPSCs分为4组,对照组、20 ng/ml TGF-β3组、100 ng/ml BMP-2组和20 ng/ml TGF-β3+100 ng/ml BMP-2组,分别加入不同组合的细胞因子对NPSCs进行诱导培养。采用CCK-8增殖实验检测各组细胞因子毒性,在诱导第7天、第14天提取mRNA进行实时定量RT-PCR检测各组髓核特异基因Aggrecan、SOX-9、Collagen-2、Krt19的相对表达量;在诱导第14天进行阿利新蓝染色检测细胞外基质的表达量,对比各组染色强度来比较各组NPSCs分化程度。结果结果:成功从髓核组织分离NPSCs并进行鉴定。原代细胞培养11 d后传至P3代,贴壁细胞呈纺锤长梭形,旋窝样生长。CCK-8实验结果显示,加入细胞因子组细胞增殖水平在培养3 d后较对照组升高,但3组之间无统计学差异,排除由细胞增殖导致的胞外基质增多。RT-PCR结果显示,在诱导第7天时加入细胞因子组髓核特异基因的表达较对照组均升高(P<0.05),在第14天时,20 ng/ml TGF-β3+100 ng/ml BMP-2组髓核特异基因的表达较20 ng/ml TGF-β3组和100 ng/ml BMP-2组升高(P<0.05)。阿利新蓝染色结果显示,20 ng/ml TGF-β3+100 ng/ml BMP-2组细胞外基质分泌明显高于其他组。结论结论:联合使用TGF-β3和BMP-2能够有效诱导NPSCs向类髓核细胞分化,可为下一步应用NPSCs治疗椎间盘退变打下基础。

关键词： 转化生长因子β3   间质干细胞   软骨   细胞分化   细胞低氧  

摘要： 目的探索低氧环境下转化生长因子－β3（TGF－β3）诱导大鼠骨髓间充质干细胞（BM－MSCs）向软骨细胞分化的作用及相关机制。方法取SD大鼠的胫骨、股骨，运用全骨髓贴壁法培养BM－MSCs，通过流式细胞术检测其细胞表面抗原、定向诱导分化等方式鉴定BM－MSCs；在常氧或低氧条件下，添加TGF-β3诱导BM-MSCs，阿利新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色检测BM－MSCs的软骨表达情况；实时荧光定量聚合酶链反应检测软骨Ⅱ型胶原蛋白（collagen Ⅱ）、聚蛋白多聚糖（aggrecan）、Ⅹ型胶原蛋白（collagen Ⅹ）的表达情况；蛋白免疫印迹法分别检测collagen Ⅱ、低氧诱导因子－1α（HIF－1α）及β－连环蛋白的表达情况。结果BM-MSCs呈成纤维细胞状，细胞表面高表达CD90（99.26%），CD29（96.41%），CD44（95.98%），弱表达CD45（8.8%）并可诱导向成骨、成脂、成软骨分化；阿利新蓝及细胞免疫荧光染色的结果发现低氧条件下添加TGF－β3培养BM－MSCs细胞团高表达aggrecan和collagen Ⅱ。实时荧光定量聚合酶链反应的结果发现，对比对照组，低氧条件下添加TGF－β3可使BM-MSCs的collagen Ⅱ、aggrecan和collagen Ⅹ的mRNA水平分别上调2.46、2.20和1.80倍（P〈0.05）。蛋白免疫印迹法提示低氧TGF－β3组较对照组HIF-1α、collagen Ⅱ表达量增加，β－连环蛋白表达量下降。结论低氧环境下TGF－β3可以明显促进BM－MSCs成软骨分化能力，并可能与抑制Wnt/β－catenin通路相关，从而为BM－MSCs治疗关节软骨损伤提供有效的新途径。

关键词： 转化生长因子-β1   Smad2/3   硬骨素   成骨细胞骨形成  

摘要： 目的:探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)在成骨细胞骨形成中的负向调节作用及其可能作用机制。方法:离体培养MC3T3-E1小鼠成骨细胞系,以10μg/L的甲状旁腺激素(PTH)或TGF-β1处理细胞6、12、24 h后,应用荧光定量PCR检测硬骨素(SOST)和TGF-β受体ALK5 mRNA表达变化;取对数生长期的MC3T3-E1细胞进行ALK5-siRNA转染,荧光定量PCR及Western blot法检测ALK5-siRNA转染对TGF-β1作用下MC3T3-E1细胞中SOST mRNA和Smad2/3蛋白表达的影响。结果:在10μg/L浓度的TGF-β1诱导下,MC3T3-E1细胞中SOST和ALK5 mRNA表达水平均较对照组升高(P<0.05),且表达水平均随着处理时间的延长而上调(P<0.05)。沉默ALK5可部分抑制TGF-β1诱导的SOST mRNA和Smad2/3蛋白表达上调(P<0.05)。结论:TGF-β1可通过激活Smad2/3信号通路上调SOST表达,从而抑制成骨细胞骨形成。

关键词： 哮喘   大鼠   转化生长因子β1   维生素D   气道重塑  

摘要： 目的检测1,25-(OH)_2D_3对哮喘大鼠气道重塑的防治作用,并探讨1,25-(OH)_2D_3对转化生长因子-β_1(TGF-β_1)表达的影响及两者之间的相关作用机制。方法将清洁级SD大鼠70只随机分为7组,每组10只。A组:正常对照组,以生理盐水代替卵白蛋白(OVA)腹腔注射及雾化吸入,并雾化前生理盐水10 ml/(kg·d)灌胃;B组:哮喘组,OVA腹腔致敏及雾化吸入激发,并雾化前生理盐水10 ml/(kg·d)灌胃;C组:地塞米松干预组,OVA腹腔致敏及雾化吸入,并雾化前给予2 mg/(kg·d)地塞米松灌胃;D～G组:1,25-(OH)_2D_3干预组,OVA腹腔致敏及雾化吸入,并雾化前维生素D灌胃;D组:2μg/(kg·d)维生素D;E组:4μg/(kg·d)维生素D;F组:8μg/(kg·d)维生素D;G组:16μg/(kg·d)维生素D。观察各组大鼠激发前后生物学表现、支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞学分类计数及肺组织病理学改变,采用RT-PCR和免疫组织化学方法分别从mRNA和蛋白表达水平检测不同组大鼠肺组织中TGF-β_1表达的变化。结果 (1)B组大鼠气道重塑及肺部炎性渗出明显重于其他各组,与A组、C组、G组相比,差异有统计学意义(P <0. 001);在不同剂量维生素D组之间,D组(最小剂量)与G组(最大剂量)差异有统计学意义(P <0. 001)。(2)在各组大鼠TGF-β_1 mRNA和蛋白水平上检测结果显示:A组肺组织TGF-β_1 mRNA表达水平和积分光密度(IOD)值明显低于其他各组,差异有统计学意义(P <0. 001);B组与其他各干预组相比,均高于其他各组(P <0. 01),另G组(大剂量维生素D)较B组在TGF-β_1 mRNA和蛋白表达水平上显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);其中在各干预组之间,D组与G组相比,差异有统计学意义(P<0.001)。结论在大鼠哮喘模型中,1,25-(OH)_2D_3可能通过调节TGF-β_1的表达来减轻气道重塑,并发挥与其相反的生物学效应从而防治哮喘。