关键词:
NEAT1
LncRNA
TSP-4
肌腱病
血管生成
摘要:
目的:针对肌腱病病症中LncRNA NEAT1表现的生物学功能展开系统探究,以验证肌腱细胞中LncRNA NEAT1通过影响mi R-148a-3p进行的调控作用,并揭示NEAT1在肌腱病发生发展中的作用机制。通过细胞实验和体内实验探索并验证LncRNA NEAT1/mi R-148a-3p/KLF6信号轴对肌腱细胞中TSP-4表达分泌及调控血管生成的机理。
方法:通过LncRNA芯片技术对样本组织展开LncRNA与m RNA两种表达谱的定量分析,组织来源于肌腱病患者与未患肌腱病的正常人两大人群,并针对表达结果进行筛选,明确肌腱病患者在这两类基因上出现的差异性表达。与此同时,借助RT-q PCR技术对芯片检测结果进行验证分析。再展开GO分析与Pathway分析,对LncRNA靶基因具体的功能以及可能的信号通路进行预测分析。同时,应用RT-q PCR对所筛选出的LncRNA和m RNA进行组织中表达验证,并检测其相关性。利用Starbase中ce RNA预测、双荧光素酶报告基因技术、RT-q PCR以及Western blot对NEAT1下游信号通路进行预测和验证。通过NEAT1基因过表达和沉默进一步验证所研究信号通路的完整性。通过构建肌腱病大鼠动物模型,验证NEAT1所调控的信号通路及其对血管生成的调控。
结果:LncRNA和m RNA表达谱数据表明共发现17个LncRNA,其中,有10个属于上调LncRNA,剩余的则全为下调LncRNA。随机选择了4种差异化表达LncRNA和4种m RNA,其表达趋势与LncRNA芯片检测结果一致。通过LncRNA-m RNA共表达预测分析以及GO分析和Pathway分析发现LncRNA NEAT1和TSP-4的m RNA共表达,且在细胞粘附和血管生成方面具有作用。通过RT-q PCR技术发现LncRNA芯片筛选得到的LncRNA NEAT1在肌腱病组织中异常上调,而TSP-4的m RNA在肌腱病组织中异常高表达。使用Pearson检验发现NEAT1和TSP-4存在正相关性。通过Starbase软件预测NEAT1潜在的靶基因是mi R-148a-3p,双荧光素酶报告基因的检测显示了NEAT1对mi R-148a-3p的调控,随后通过RT-q PCR我们发现肌腱病样本中mi R-148a-3p含量相对于对照组明显升高(P<0.01),通过Pearson检验发现NEAT1和mi R-148a-3p存在正相关性(P<0.001)。通过Target Scan预测发现KLF6可能是mi R-148a-3p潜在的靶目标,亦通过荧光素酶报告检测予以证实。随后我们通过肌腱细胞转染mi R-148a-3p mimics和inhibitors后,用RT-q PCR检测KLF6 m RNA的表达,发现mi R-148a-3p mimics组中KLF6 m RNA表达受到明显抑制(P<0.01),而mi R-148a-3p inhibitors组中KLF6 m RNA表达明显升高(P<0.01)。此外,我们对获取的人肌腱组织样本使用RT-q PCR检测KLF6的表达,发现肌腱组织中KLF6的表达量明显降低(P<0.01),并通过Pearson相关分析表明mi R-148a-3p表达水平与KLF6表达水平在肌腱病组织中呈负相关(P<0.001)。结合文献报道的KLF6可靶向结合TSP-4基因的启动子。我们通过腺病毒转染肌腱细胞过表达和沉默NEAT1基因,共分6组(NEAT1过表达组:NC组、NEAT1组、NEAT1+mi Rinhibitor组;NEAT1沉默组:NC组、NEAT1-sh RNA组、NEAT1-sh RNA+mi Rmimic组)。RT-q PCR结果表明,相对于NC组,过表达NEAT1组的肌腱细胞中KLF6的m RNA表达水平出现下滑。不过TSP-4的m RNA则表现出更高的表达水平;反观共转染mi R-148a-3p inhibitor组,则与单过表达组相反,KLF6的基因表达水平上升,而TSP-4表达水平降低。相对于NC组,NEAT1组可观察到KLF6的m RNA出现了更高水平的表达情况,不过TSP-4的m RNA则出现了表达水平显著下滑的情况;而共转染mi R-148a-3p mimic组,则与单沉默组相反,KLF6基因表达水平降低,而TSP-4表达水平上升;Western blot结果亦显示类似的趋势。进一步验证了LncRNA NEAT1/mi R-148a-3p/KLF6调控轴介导了肌腱细胞表达TSP-4的信号通路。
建立大鼠肌腱病动物模型进行验证,共分为两大组,NEAT1过表达组:生理盐水组;注射NEAT1过表达病毒组;注射NEAT1过表达病毒组+anti-TSP-4蛋白;NEAT1沉默