关键词：
肌腱病
肌腱干细胞
PGE2
成骨分化
成脂分化
sirt1
摘要：
前言肌腱病(tendinopathy)是一种慢性劳损性疾病,病因尚不清楚,普遍认为与肌腱的过度使用直接相关[1]。肌腱持续承受压力和机械负重,不仅能导致急性肌腱损伤而且会引发慢性降解性肌腱病。跟腱,髌骨,肩袖、前臂扩展肌、肱二头肌、胫骨后肌处的肌腱是最易引发肌腱病的部位。肌腱干细胞(Tendon stem cells,TSCs)是一种肌腱腱旁组织来源的间充质干细胞。James H-C Wang和*** Mos等人研究发现:肌腱干细胞在特定的环境下可以进一步分化为肌腱细胞,且较肌腱细胞而言,肌腱干细胞不仅更能促进细胞的增殖和胶原合成,还能分泌更多的细胞外基质修复损伤的肌腱。肌腱干细胞具有多向分化潜能,在一定条件下能够分化成脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞[2-7],在肌腱修复过程中,肌腱干细胞的这种多向分化潜能将发挥重要作用。然而,目前肌腱干细胞的分化机制尚不清楚,研究证实,TSCs在肌腱组织修复方面存在明显的优势。肌腱干细胞来源丰富,肌腱组织含有1%-4%的TSCs;TSCs体外培养增殖能力更强,拥有更短的培养周期,多次传代后仍能保持稳定的干细胞特性[8];TSCs趋向软组织,故其向肌腱、软骨、骨组织的分化趋势更容易;肌腱干细胞免疫原性极低,肌腱干细胞甚至还有免疫抑制性[9]。所以,在肌腱损伤修复方面,肌腱干细胞潜力巨大,前景光明。因此,如何对肌腱干细胞分化方向加以调控,使其向有利于肌腱损伤恢复的方向分化,为肌腱病的治疗指明了新的方向。前人的研究表明前列腺素(PGE2)在肌腱损伤中是疼痛和急性炎症反应的主要炎症调节因子[10,11]。在动物模型中,重复的机械负重会使肌腱中PGE2的表达显著增加,PGE2的增加可以看做是对重复性的负重的反应。前列腺素E2处理肌腱干细胞后,其增殖能力明显降低,不同浓度的PGE2处理肌腱干细胞不同时间,其将向成骨和成脂两种不同的方向分化[5,12]。正常肌腱的腱-骨连接部分有四种不同的组织:肌腱、未钙化的纤维软骨、钙化的纤维软骨及骨。在肌腱损伤修复过程中,肌腱干细胞向软骨和成骨方向的分化是有利于的。而损伤的肌腱中脂肪组织的积累则不利于肌腱病的恢复。因此,如何调控损伤的肌腱中肌腱干细胞的成骨分化和脂质积累,是将肌腱干细胞应用于治疗肌腱病的关键所在。Sirtuin是生命体中广泛存在的一类依赖于NAD+的组蛋白去乙酰化酶,Sirt1是目前研究最为广泛的sirtuin蛋白,它在能量代谢和细胞分化过程中起着重要的作用[13]。sirt1通过自身的去乙酰化活性发挥其调节作用,其中组蛋白的去乙酰化是sirt1调节细胞分化的主要机制[14]。在细胞分化中多种非组蛋白也是sirt1的靶标,研究显示,sirt1将runx2和β-catenin[15]去乙酰化,来调节间充质干细胞的成骨分化[16]。ppar?在间充质干细胞成骨成脂分化平衡中起着重要作用[17,18]。白藜芦醇能促进间充质干细胞的成骨分化[19,20]。同样被激活的sirt1能够减少脂肪细胞数目,增加成骨分子标记的表达,而sirt1被抑制后,则会增加脂肪细胞数目和成脂分子标记,减少成骨分子标记的表达,因此被激活sirt1起到抑制成脂分化促进成骨分化的作用[21]。sirt1在细胞分化中的作用及其调控机制,为我们的课题指明了方向。肌腱病在运动医学中是一种高发病,目前临床普遍采取抗炎治疗,通过减少炎性因子pge2达到减轻肌腱及腱周疼痛的目的。近年来自体肌腱干细胞治疗自体肌腱病逐渐成为运动医学医生关注的重点。肌腱干细胞具有多项分化潜能,可以正常分化成肌腱,也可以异常分化成骨、成脂,如何调控其异常分化是肌腱病早期康复的关键。在骨髓间充质干细胞中,sirt1是骨系及脂系分化的重要因子,因此,本课题研究炎性因子pge2刺激下导致的肌腱病通过sirt1的调控抑制成脂和成骨促进成肌腱来达到治疗肌腱病的目的,为临床提供治疗肌腱病的新方法。综上所述,本研究主要在前期工作的基础上,检测pge2处理前后的肌腱干细胞其成骨分化能力的改变,并探求其相关的信号通路;构建bmp-2,igf-1,cebpδ,crebandsmad1稳定低表达的细胞模型,探讨pge2处理前后的肌腱干细胞其成脂分化能力的改变,及其可能影响成脂分化的相关信号通路;从基因和蛋白水平检测sirt1激活剂和抑制剂处理不同时间后肌腱干细胞中sirt1的表达情况,并检测处理前后细胞中成骨和成脂的变化,研究sirt1对肌腱干细胞成骨和成脂分化的调控,从而阐明其机制,为肌腱病的发生、发展机制以及生物学治疗提供理论依据,最终达到治疗肌腱病的目的。方法第一部分:分离培养大鼠的肌腱干细胞,并用细胞免疫荧光的方法鉴定肌腱干细胞,检测细胞的标记蛋白的表达;分别用不同浓度的pge2处理肌腱干细胞7天或者用100ng/ml的pge2分别作用
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