关键词:
葡萄糖响应
贯序释放
鸢尾素
结缔组织生长因子
肌腱修复
摘要:
慢性肌腱病合并糖尿病(CTDM)的治疗面临传统方法疗效不足的挑战。炎症因子浸润、活性氧(ROS)堆积、肌腱干细胞(TSPCs)进行性消耗和异常分化,为CTDM的修复带来了不利因素。尽管TSPCs的补充有助于肌腱发生,但过早的增殖和招募可能会破坏肌腱修复的结果,这意味着炎症的调节和成腱发生的时机需要进一步优化。在本研究中,我们基于多巴胺修饰氧化透明质酸(OHA-DA)和苯硼酸功能化羧甲基壳聚糖(CMCS-PBA)开发了一种新型葡萄糖响应双因子贯序递送水凝胶(Glucose-responsive Dual-drug-Sequential-delivery Hydrogel,GDSH),利用树突状介孔二氧化硅(Dendritic mesoporous silica nanospheres,DMSNs)载药位置的差异,实现了鸢尾素(irisin)与结缔组织生长因子(CTGF)的可控贯序释放。GDSH复合水凝胶具有优异的结构特性、力学稳定性及生物相容性。体外细胞学实验显示,早期释放的irisin通过降低ROS水平和驱动巨噬细胞M2型极化间接缓解TSPCs异常分化。晚期释放的CTGF通过增强TPSCs的增殖和招募,同时直接促进TSPCs成腱分化来发挥关键作用。体内动物实验进一步验证,GDSH复合水凝胶可改善CTDM大鼠跟腱的形态与生物力学性能,促进胶原纤维有序排列,减轻炎症细胞浸润及异位骨化。机制研究表明,GDSH复合水凝胶通过激活Smad、Hippo、AMPK、MAPK和PI3K/AKT信号通路,协同调控细胞增殖、迁移、抗氧化、抗炎、分化及基质重塑过程。综上所述,平衡炎症调节和肌腱发生的策略可能是管理CTDM的一种很有前途的方法。
第一部分:葡萄糖响应双因子贯序递送水凝胶(GDSH)的构建及表征
目的:构建基于透明质酸、羧甲基壳聚糖、多巴胺和苯硼酸的葡萄糖响应型水凝胶,利用DMSNs载药位置的差异实现irisin和CTGF的贯序释放,进而调控炎症微环境并促进功能性组织再生,为CTDM的治疗提供新策略。
方法:首先,通过模板法制备了DMSNs作为药物载体,并通过层层自组装技术负载CTGF和irisin。随后,通过多巴胺修饰醛基化透明质酸(OHA-DA)和苯硼酸功能化羧甲基壳聚糖(CMCS-PBA)之间席夫碱和硼酸酯键双动态交联制备了OHA-DA/CMCS-PBA双网络水凝胶。采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)、质子核磁共振(1H NMR)、扫描电镜(SEM)、流变学测试、力学测试等方法对水凝胶的结构、流变特性、力学性能、粘附性、降解和膨胀特性进行表征,并评估其葡萄糖响应药物贯序释放行为。
结果:
1.成功制备了具有树突状分枝和多层孔隙结构的DMSNs并完成了CTGF和irisin的负载。
2.水凝胶呈现出典型的互连且不规则的多孔微观结构,孔径从几十微米到几百微米不等。
3.水凝胶在5min内迅速成胶,表现出显著的剪切稀化行为并能顺利通过26 G针头挤出。
4.水凝胶具有优异的力学性能,能够在60%应变下不破裂,且循环压缩后表现出良好的机械回收性能。
5.水凝胶的粘附强度达到3.3 kPa,且载药DMSNs的加入未显著影响其粘附性能。
***和CTGF的释放受葡萄糖浓度影响显著,表现出可控且贯序释放特性。
结论:本研究成功构建了GDSH复合水凝胶,其在结构、性能和药物释放方面展现出诸多优势,能够根据血糖浓度变化和载药位置差异实现药物精准调控和贯序释放,满足肌腱修复不同阶段的需求。该水凝胶为治疗CTDM提供了新的治疗策略,具有广阔的临床应用前景。
第二部分:GDSH复合水凝胶修复肌腱病损的细胞学实验
目的:评估GDSH复合水凝胶的生物相容性及对TSPCs生物学行为的影响,探索其在CTDM修复中的治疗潜力。
方法:以TSPCs为研究对象,运用细胞骨架染色、活死染色、溶血试验评估生物相容性;采用CCK-8法检测细胞增殖特性;使用Transwell实验分析细胞迁移特性;DCFH-DA探针、q RT-PCR、免疫荧光染色、流式细胞术、ELISA和Spearman秩相关分析评估GDSH复合水凝胶抗炎、抗氧化、及纠正TSPCs分化的能力。
结果:
***复合水凝胶支持TSPCs纺锤形生长且无显著溶血行为。
***的释放可有效降低ROS水平、驱动巨噬细胞M2型极化并缓解TSPCs异常分化。
***的释放可显著促进TPSCs的增殖和迁移,同时调控TSPCs成腱分化。
***和CTGF的贯序释放可最大程度减轻TSPCs异常分化,促进成腱分化。
结论:GDSH复合水凝胶具有良好的生物相容性,通过双因子贯序释放有效改善肌腱修复微环境,抑制异常分化并促进肌腱再生,为CTDM的治疗提供了