关键词： 干细胞治疗   骨髓间充质   实验研究   肝硬化   “横向分化”   多向分化潜能   间充质干细胞   组织细胞分化   肝细胞样细胞   cells   神经外胚层   自我更新   中胚层  

摘要： 具有无限或较长期自我更新和多向分化潜能的干细胞及其“横向分化”特性的发现,为治疗各种疾病提供了一种新的手段[1],使其成为近年来研究的热点。源于中胚层的间充质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)在不同的诱导条件下,除具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力[2,3],在体外也可以分化肝细胞样细胞或肝系细胞[4～7]。一、目的本实验利用肝硬化大鼠模型,进行交叉性别MSCs移植,在体内探讨MSCs的整合及对肝硬化治疗的疗效,为临床应用提供实验依据。二、材料和方法Wistar大鼠(河南省试验动物中心),胎牛血清(杭州四季青),DNA抽提试剂和PCR试剂(上海Sangon公司

关键词： IL-10   治疗   静脉移植   心外膜   注射   心脏结构   大鼠   浓度   配制   改善  

摘要： 目的 :观察炎症抑制因子IL -10干预后静脉移植骨髓间充质子细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)与心外膜注射MSCs疗效的比较 ,探讨IL -10干预后静脉移植MSCs治疗心肌梗死的可行性。方法 :抽取大鼠股骨和胫骨骨髓 ,获得较纯MSCs ,溴氮胞苷 (BrdU)标记 ,配制成终浓度 3× 10 6/ml细胞悬液备用 ,制备IL -10溶液。结扎大鼠冠状动脉左前降支 ,建立急性心梗模型后随机分为 3组 ,对照组、IL- 10 +MSCs静脉移植组及MSCs心外膜注射组。 4周后处死大鼠 ,检测心肌内MSCs ,观察心脏结构和功能的改变。结果 :细胞移植 4周后可在心梗周边找到BrdU阳性标记的移植细胞。血流动力学和超声检查显示 ,与对照组相比 ,其它各组心脏结构和功能均明显改善 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ,而IL 10 +MSCs静脉移植组和MSCs心外膜注射组之间无明显差别 (P >0 .0 5 )。结论 :IL- 10 +MSCs静脉移植组和MSCs心外膜注射组均能明显改善心脏结构和功能且差异无统计学意义 ,故IL -10干预后静脉移植MSCs治疗心肌梗死可行。

关键词： 间充质干细胞   VEGF基因   缺血性心脏病   细胞治疗   基因治疗   心肌梗死  

摘要： 心肌梗死是导致猝死和心衰的重要原因之一，其在我国的发病率也日益升高。急性心肌梗死后的基本病理变化是大量心肌细胞丢失，最终由纤维性的非收缩细胞所替代。尽管心肌组织中残余有少量具有轻度扩增能力的心肌细胞，加上心脏外干细胞所具有的有限扩增分化能力，心梗区的心肌细胞可产生一定程度的再生性代偿，然而，此类细胞的代偿，如不加以有效的干预措施，是不足以减轻心梗后心功能衰竭的进行性发展。当前的治疗手段主要有药物、多种介入和外科手术治疗等，但都不尽如人意。因此，为保护幸存的心肌和恢复受损的心脏收缩功能，心肌缺血的细胞治疗和基因治疗逐渐成为基础与临床的研究热点。 骨髓间充质干细胞(BoneMarrowMesenchymalStemCell，BMMSC)是存在于成体骨髓组织中的中胚层发育的早期细胞，可自我更新并具有多向分化潜能，具有来源广泛、分离容易方便、遗传稳定、无免疫排斥和伦理障碍等优势，是干细胞治疗及基因治疗的理想供体细胞。同时，BMMSC可接受多种载体的基因转染并在体内分化后仍保持良好的遗传稳定性，使外源性基因易于得到长期和稳定的表达;而外源性基因在BMMSC中的表达有利于增强其移植效应及提高其分化率。由此，我们设想如能将血管内皮细胞生长因子(VascularEndothelialGrowthFactor,VEGF)基因转入BMMSC中，并获得有效的表达，再把携带外源性VEGF基因的BMMSC移植到心梗区，就有可能起到基因或细胞治疗二者相互协同、相互促进的作用;其效果可能优于单用。 本实验分为两个部分。第一部分(VEGF基因转染BMMSC)以密度梯度离心一贴壁培养法获取Wistar大鼠BMMSC，采用阳离子脂质体法转染对大鼠BMMSC进重组人VEGF165外源性基因修饰，以ELISA、RT-PCR和Western检测基因表达情况;第二部分(VEGF基因转染BMMSC移植对大鼠心功能的影响)于大鼠心梗2周后心肌直接注射移植携带VEGF基因的BMMSC到心梗区，4周后通过检测心功能、心梗面积、心梗区血管新生及移植细胞的示踪分化等指标，来检验是否优于独立的细胞治疗或基因治疗，并通过RT-PCR分析VEGF基因的体内表达，探讨VEGF基因以BMMSC为细胞载体的表达特征。 第一部分：血管内皮细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞目的：探讨对大鼠BMMSC进行重组人VEGF165基因修饰的可行性。 方法：1.采用密度梯度离心一贴壁培养法获Wistar大鼠BMMSC。测定其生长曲线，表面标志CD34、CD44、CD45和SH3，进行向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化的研究。2.采用脂质体Lipofectamine2000介导下行pcDNA3.1-hVEGF165转染BMMSC，在倒置显微镜下观察转染后细胞形态和生长情况的变化，通过RT-PCR，Western和ELISA鉴定VEGF在细胞中的表达情况。 结果：1.采用密度梯度离心一贴壁培养法易获取大鼠BMMSC，检测结果为CD44、SH3阳性，CD45、CD34阴性，可向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化。***-PCR、Western和ELISA检测均证实采用阳离子脂质体Lipofectamine2000能成功地将hVEGF165基因转染至大鼠BMMSC中，并获得有效的表达。 结论：真核表达载体pcDNA3.1-hVEGF165可以成功地在BMMSC中表达，为进一步探讨VEGF基因转染BMMSC移植对大鼠心功能及心室重构的影响提供了实验依据。 第二部分：血管内皮细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞移植对大鼠心功能的影响 目的：探讨VEGF基因转染BMMSC后心肌移植对缺血性心脏病心功能及心室重构的影响，并比较联合治疗与基因治疗、细胞治疗单独使用的疗效差别。 方法：以Wistar近交系大鼠建立心肌缺血模型，60只心肌缺血模型动物随机分为5组(各组12只)。联合组(Combogroup)在心梗模型建立2周后于心梗区移植转染VEGF基因的BMMSC，细胞组(Cellgroup)移植等量的BMMSC，基因组(Genegroup)注射脂质体-pcDNA3.1-hVEGF165DNA复合物，对照组(Controlgroup)注射等容积的培养液，模型评估组(Model-assessmentgroup)仅用于模型评估;另取12只未结扎冠脉的Wistar近交系大鼠为假手术组，未作任何治疗。移植4周后以Buxco系统检测心功能，测量心梗面积，免疫组化检测Brdu、肌钙蛋白T双染确定移植细胞的存活与分化，通过Ⅷ因子染色检测血管新生，通过RT-PCR检测VEGF基因的体内表达。 结果：冠脉结扎法制作的大鼠心梗模型，其有效使用率为

关键词： 脑缺血治疗   成纤维生长因子   骨髓间充质干细胞   bFGF  

摘要： 本文从大鼠骨髓中分离出单个核细胞，密度梯度离心后，贴壁培养和扩增，用流式细胞仪对第6代细胞进行CD29、CD106、CD45和CD34抗原检测以证实为MSCs。用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和叔丁基对羟基茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)在体外对MSCs进行诱导分化，然后用免疫细胞化学法检测MSCs神经细胞特异性标志物的表达，鉴定诱导后的细胞分化类型，并观察其变化规律。采用脂质体转染法，将外源性bFGF转入MSCs中，并用RT-PCR、免疫细胞化学和Western blot方法检测bFGF在转染后的MSCs中的分泌表达情况。最后，将MSCs和bFGF基因修饰的MSCs(MSCs-bFGF)通过静脉移植至实验性脑缺血大鼠体内，观察比较两者对大鼠脑缺血后神经功能及脑梗死体积的影响，并应用免疫组化、双重荧光标记方法观察MSCs在脑内迁移和分化情况。经实验得出结论：***在体内外均能分化为神经细胞;***移植对脑缺血具有保护作用;3.b-FGF基因修饰可提高MSCs移植对大鼠脑缺血后损伤的保护作用和神经功能恢复的促进作用，其作用可能与增加移植后MSCs存活率，并提高MSCs向神经元的分化率有关。

关键词： 骨髓间充质干细胞   脊髓损伤   细胞移植  

摘要： 背景 脊髓损伤常导致损伤平面以下感觉、运动功能不可逆、永久性丧失,给患者造成极大伤害,给家庭及社会造成极大负担。中枢神经系统损伤后,轴突所处的微环境比轴突本身更影响其再生。细胞移植可替代丢失的神经细胞,它分泌的各种神经生长因子可促进轴突的再生,桥接神经缺损后遗留的空隙,改善CNS的轴突再生环境,为轴突的生长提供物理支架,符合联合治疗脊髓损伤理念,因此细胞移植成为目前脊髓损伤修复领域研究的热点。目的 研究静脉移植BMSC对脊髓损伤的修复作用。力弦(1)体外分离、培养、扩增、纯化、BrdU标记10只同种异体SD大鼠的BMSC。(2)WD法制成同种大鼠脊髓损伤完全瘫痪动物模型,制模后7天随机分为A、B、C三组,A组18只,作为BMSC移植组,B组16只,作为对照组,C组12只,作为空白手术对照组。(3)A组经鼠尾静脉移植2×10～6/ml的BMSC细胞悬液1ml,B组移植1mlL-DMEM液,C组作为空白手术对照组。(4)组织学及免疫组织化学观察移植后2、3、6w检测BMSC在损伤段脊髓的存活、分布、分化,检测损伤段脊髓内GAP-43、NF及巢蛋白的表达,移植后每周用BBB评分评估各组后肢运动功能。结果 BMSC能在体外大量扩增、经6次传代后,无细胞衰老征象。移植后2w BMSC主要分布于损伤段及邻近节段脊髓内,约占移植细胞数的4.9%,移植后6、8w,细胞数量明显减少,但仍可检测到存活的BMSC。移植后2w,BMSC形态大多变为园形或椭圆形,部分阳性标记的细

关键词： 骨髓间充质干细胞   细胞移植   心肌梗死   冠心病  

摘要： 目的：随着冠心病治疗的迅速发展，大部分冠心病病人可以得到及时有效的治疗。然而，对于心梗后病人及长期慢性心肌缺血病人即使受损心肌恢复血流灌注，但仍有一部分病人因心肌细胞大量丧失导致心功能不全，心腔扩大，心室重塑，最终走向心衰、死亡。针对这一部分病人曾经尝试多种治疗方式，如心室折叠重建、基因治疗等，但临床效果均不满意。近年来研究表明，细胞移植治疗有望为这一部分病人提供一种新型的很有前途的治疗手段。目前已有很多关于细胞移植的实验研究及部分Ⅰ期临床试验报告。在临床试验中，大多采用自身骨髓单个核细胞，对于更加纯化的人骨髓间充质干细胞(MSCs)的动物及临床试验还鲜有报道。本实验从人的骨髓中提取问充质干细胞，在体外扩增后移植入大鼠梗死心肌，观察移植细胞的存活、分化情况，评估移植细胞对大鼠心梗后心功能的改善程度，探讨细胞移植心功能改善的作用机制，为人骨髓间充质干细胞应用于临床奠定实验基础。 方法：抽取冠心病病人胸骨骨髓液，用Percoll液梯度离心后提取骨髓单个核细胞。将提取细胞接种于具有骨髓间充质干细胞专用培养液的培养瓶中。更换培养液后只保留骨髓问充质干细胞，并进一步体外扩增。培养的人骨髓MSCs进行流式细胞鉴定，体外BrdU细胞标记。制作大鼠心梗模型，取SD大鼠侧开胸后结扎前降支。模型制作后两周进行超声评价，心梗模型评价标准为：①客观指标，心脏FS值＜30％入选。②主观指标，超声科医师判断至少有一个层面的前壁室壁收缩运动明显异常。将同时符合上述两个指标者入选下一步实验，并随机分成细胞治疗组14只和培养液注射对照组13只。分组后立即对心梗大鼠行二次手术，正中开胸，在心梗区内注射已标记的人骨髓MSCs(2×106/100μl)或等体积的细胞培养液。注射后四周再行超声评价，与治疗前超声评价指标进行对比。检测指标包括：左室收缩功能、心室壁厚度、室腔大小、室壁增厚率、左室舒张功能。超声评估后处死动物，固定心脏后取材。沿左室短轴切片，进行HE染色、体内组织BrdU染色、肌细胞结合蛋白、肌动蛋白、心肌肌钙蛋白-Ⅰ免疫组化染色。进行Ⅷ因子免疫组化染色，并在光镜下进行微血管计数。另有8只心梗大鼠，4只2周后进行细胞治疗、4只注射培养液，再于1周后处死取材进行RT-PCR检测。检测的目的基因包括：Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶-1、问质细胞源因子、血管内皮生长因子、Bcl-2。 结果： 1、细胞培养结果。经提取的冠心病病人骨髓问充质干细胞体外培养容易生长，可传代15代以上，细胞形态均一。对不同代细胞进行流式细胞学鉴定，均一性表达CD29、CD44阳性，CD34、CD45阴性。体外BrdU标记染色，细胞核染成棕红色。 2、超声评价结果。细胞治疗组和对照组在细胞移植前超声检测无显著差异。细胞移植后四周，细胞治疗组较对照组射血分数值和短轴缩短率显著改善，局部前壁室壁增厚率明显提高，室腔扩大小于对照组。大鼠心脏舒张功能两组无显著差异。 3、组织学检查结果。心梗部位HE染色心肌正常组织结构消失，被纤维瘢痕组织取代。体内组织BrdU染色显示移植细胞存在于心梗及心梗边缘区，散在或成簇排列，部分移植细胞构成微血管的组成部分。连续切片法观察移植细胞体内分化情况，可见desmin、actin染色阳性，而TroponinⅠ染色阴性。Ⅷ因子染色显示细胞治疗组较对照组有更多的微血管生成。 4、RT-PCR检测结果。细胞治疗组梗死区心肌Ⅰ型、Ⅲ型胶原基因表达水平明显高于对照组，而在非梗死区低于对照组。细胞治疗组梗死区间质细胞源因子、血管内皮生长因子、Bcl-2基因表达水平均明显高于对照组。细胞治疗组和对照组的基质金属蛋白酶-1表达水平无显著性差异。 结论：人骨髓间充质干细胞易于提取和体外扩增，表型稳定。移植到大鼠心梗模型后，可以存活并部分经局部环境诱导后呈现肌样细胞分化。超声评估显示细胞移植可明显改善心梗后心功能，减轻左室重塑。作用机制可能为新血管生成增加、细胞外基质、旁分泌、抗凋亡、心肌再生等共同作用的结果。本实验证明，在动物体内移植冠心病病人骨髓问充质干细胞可行、有效，为其在临床应用提供了实验理论基础。

关键词： 细胞移植   自体骨髓间充质干细胞   急性心肌梗死   动物实验   微环境   血管生成  

摘要： 目的　观察骨髓间充质干细胞 (MSC)植入急性心肌梗死 (AMI)区的转归及治疗作用。方法　通过冠脉转运的方法将幼猪自体骨髓MSC移植至AMI区 ,8周后观察MSC的分化、促血管生长情况 ,用核素门控心肌灌注显像观察心肌灌注的改善及心脏功能变化。结果　移植的细胞表达β肌球蛋白重链 (β MHC)和连接蛋白Connexin4 3,8周后 ,治疗组心肌灌注显像明显改善 ,毛细血管密度、左室射血分数均明显高于对照组 (P <0 0 0 1)。结论　骨髓MSC经冠脉转运在心肌微环境下可向心肌细胞分化 。

关键词： 同种异体   骨髓间充质干细胞移植   治疗   大鼠   心肌梗死  

摘要： 目的　探讨同种异体骨髓间充质干细胞 (MSCs)在梗死大鼠心脏局部存活、迁移、分化及对心功能的影响 ;明确同种异体细胞移植治疗心肌梗死 (MI)的可行性及效果。方法　雌性Wistar大鼠 3 5只 ,随机分为正常对照组、急性心肌梗死 (AMI)组及MI +MSCs治疗组。分离纯化雄性Wistar大鼠骨髓MSCs ,于左冠状动脉前降支结扎后 1～ 3h植入到雌性大鼠心脏组织 ,移植后 10周检测心功能并取心脏检测各种相关指标。结果　异体大鼠MSCs经纯化后可在梗死心脏组织定居、生存 ,并与宿主心肌纤维排列方向一致 ,免疫组化检测胞质心肌特异蛋白染色阳性 ,与MI组比较 ,异体细胞移植组左室收缩压升高 (P <0 0 5) ,舒张末压明显降低 (P <0 0 1)、左心室内压最大上升和下降速率显著增快 (P <0 0 5) ,梗死边缘区心肌面毛细血管数目明显增加 (P <0 0 5) ,多功能真彩色病理图像分析系统显示MI面积缩小 (P <0 0 5)。结论　同种异体MSCs移植治疗MI可行。

关键词： 骨髓间充质干细胞   心肌   细胞移植   心力衰竭  

摘要： 充血性心力衰竭(心衰)是现代社会发病率、病死率不断提高的主要心血管疾病，急性心肌梗死(心梗)是重要的致病原因。心梗后，心肌细胞坏死、凋亡造成心肌数目减少，心室重构促使心衰发生。通常认为，哺乳动物成体心肌为终分化组织，没有成肌前体细胞，受损后无分化和增生潜能，故心肌细胞丢失多不可逆。尽管有研究显示心衰时心肌细胞存在有

关键词： 间充质干细胞   细胞分化   急性心肌梗塞   自发性高血压大鼠   动脉粥样硬化  

摘要： 第一部分旨在证明人的骨髓间充质干细胞(MSC)分化为心血管组织的潜能。用5-氮胞杂苷诱导MSC向心肌细胞分化，用VEGF-B诱导向血管内皮细胞分化。异丙肾上腺素法制成NOD／SCID小鼠心肌损伤模型，经尾静脉注入标记的MSC。免疫荧光法检测MSC的体内外分化。结果显示，在体外，经诱导的MSC表达肌凝蛋白重链和肌钙蛋白Ⅰ，表达Ⅷ因子相关抗原和CD31。在体内，标记的MSC表达阳性的肌凝蛋白重链和Ⅷ因子相关抗原。以上结果说明MSC可分化为心肌和血管血管内皮细胞，是心血管再生医学的理想种子细胞。 第二部分研究猪的自体骨髓间充质干细胞(MSC)经冠脉内注射治疗急性心肌梗塞(AMI)的有效性和可行性。球囊阻塞法制成AMI模型。经冠脉注入经标记的MSC，4周后，核素心肌断层显像检测相对心梗面积、心肌灌注评分和射血分数，经导管检测左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、压力升高最大速率(+dP／dt)和压力下降最大速率(-dP／dt)。免疫荧光法分析MSC的植入和分化。结果显示，和对照组相比，细胞治疗组射血分数显著增加[(44.1±4.3)％对(39.0±5.2)％，p＜0.05]，心肌灌注评分(30.0+5.3对41.8±8.8，p＜0.01)和相对心梗面积[(28.6±4.7)％对(33.5±3.4)％，p＜0.05]显著降低，LVSP(87.1+8.7mmHg对78.0+4.4 mmHg，p＜0.05)、+dP／dt(1818.1±116.7mmHg／s对1610.64±114.5 mmHg／s，p＜0.01)和-dP／dt(1800.9±88.5mmHg／s对1618.4+65.7mmHg／s，p＜0.01)显著增加，LVEDP(9.4±1.7mmHg对12.6±2.8 mmHg，p＜0.05)显著降低。标记的MSC在心肌中表达阳性的肌凝蛋白重链、连接蛋白43、平滑肌肌动蛋白和Ⅷ因子相关抗原。因此，MSC在体内分化为心肌和血管组织，可改善AMI猪的心功能。 第三部分研究自发性高血压大鼠(SHR)间充质干细胞(MSC)生物学特性的改变。取SHR和WKY骨髓和主动脉的贴壁细胞，经CD105免疫磁珠分选，测定其生长曲线和倍增时间，流式细胞仪检测其免疫表型，进行纤维母细胞集落形成