关键词： 骨髓间充质干细胞   下肢   缺血性疾病  

摘要： 背景与目的 下肢缺血性疾病多由动脉硬化性闭塞症、血栓闭塞性脉管炎或糖尿病引起,是中老年人慢性下肢缺血最常见的原因,它是一种全身性动脉病变,多发生于50岁以上,男性患者多于女性。近年来由于生活水平的提高,人均寿命的延长,饮食习惯的改变,诊疗技术和设备的完善,动脉硬化性下肢缺血的发病率有逐年上升的趋势。 近年来,随着分子生物学和细胞生物工程技术的发展以及对干细胞研究认识的深入,通过移植技术将干细胞植入缺血下肢,形成新生血管及侧支循环,改善下肢血供,达到治疗下肢缺血性疾病的目的,这为下肢缺血性疾病提供了一种全新的治疗策略。 在过去两年内,我们分别在基础和临床中进行了自体骨髓间充质干细胞(mesenchynmal stem cells,MSCs)在下肢缺血性疾病中的研究。其中在基础研究中,我们还进行了转染血管内皮生长因子(Vascular endothel ial growthfactor,VEGF)的MSCs在下肢缺血性疾病中的研究。本研究旨在通过分析移植自体MSCs前后下肢血流灌注情况,探索其安全性、可行性,并且取得了初步结果。 基础研究 1.研究方法: ①健康纯种新西兰大白兔26只,雌雄不限,按移植成分的不同,随机分成3组:(1)移植转染VEGF的MSCs组10只(以下简称VEGF组);(2)移植单纯MSCs

关键词： 骨髓间充质干细胞   细胞移植   心室重构   急性心肌梗死  

摘要： 急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后心肌细胞发生不可逆转的损伤和丢失,又很难通过自身组织的再生来修复。坏死心肌逐渐被纤维组织取代,发生心室重构(ventricular remodeling),最终引起充血性心力衰竭。目前药物、冠脉介入和搭桥手术等治疗手段在一定程度上能阻止重构的进程,但也只能恢复再灌注,不能修复或逆转已坏死的心肌,更不能促进心肌再生。心脏移植(heart transplantation)虽能取代受损心肌,彻底改善心脏状态,但是因其供体来源困难、手术技术要求高、费用昂贵以及免疫排斥反应等原因,临床很难广泛开展。因此,如何增加心肌细胞数目从根本上逆转心肌梗死后心室重构改善心功能仍然是目前主要问题之一。 近年来,通过干细胞(stem cells)移植的方法来增加心肌细胞数目,已取得了令人鼓舞的进展。干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞,其中骨髓来源的干细胞因其来源广泛,可以自体移植而倍受关注,如骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体内和体外均已成功的被诱导分化为心肌细胞。大量研究证实骨髓干细胞移植可以促进梗死区心肌再生和血管形成,修复受损心肌,改善心脏功能,但是目前干细胞移植对整体心室重构和基质重构影响的研究还比较少。 临床上,心肌梗死好发于中老年人,自体骨髓干细胞增殖分化能力较弱,培养需要较长时间,可能会贻误移植时机,而异体细胞移植可能存在免疫排斥反应。因此,我们实验主要观察骨髓干细胞移植对心室重构和基质胶原重构的影响,以及探讨同种异体移植的可行性。

关键词： 骨髓间充质干细胞   糖尿病   胰岛素   移植  

摘要： 目的 近几年,各国糖尿病发病率不断上升,据2000年第17届国际糖尿病大会调查的结果显示,全世界的糖尿病患者数已超过1.51亿。临床上通常采用皮下注射胰岛素来治疗1型和部分2型糖尿病,其治疗效果并不理想,且很难阻止糖尿病并发症的发生及发展。近20年来,国内外学者对胰腺移植及胰岛移植做了大量的探索。对于已经丧失胰岛细胞功能的糖尿病患者来说,植入胰岛β细胞或其替代物被认为是最有效的方法。但供者细胞来源不足及免疫排斥反应等限制了这种方法的应用。干细胞作为一类具有多向分化潜能的细胞,已经逐渐成为人们治疗糖尿病的新希望。 骨髓间充质干细胞(MSC)来源广泛,取材容易,便于自体移植,且在体外长期培养过程中,始终保持其多向分化潜能,遗传背景稳定,自体移植可避免免疫排斥反应,是理想的可供移植的种子细胞。探索人自身的骨髓间充质干细胞的细胞替代治疗具有广阔的应用前景,方法比较简便,而且没有伦理学和细胞来源的限制。 已有研究证实MSC移植入糖尿病大鼠体内,在胰腺发现了可分泌胰岛素的移植的MSC。但也有研究者认为没有证据支持MSC在体内能分化成胰岛β细胞。在本实验中采用了新的方法,进一步验证应用骨髓间充质干细胞治疗糖尿病的可能性。我们尝试首先建立大鼠糖尿病模型,再将BrdU标记的MSC移植入大鼠体内,监测大鼠血糖和体重变化,并观察MSC在糖尿病鼠体内微环境是否能向胰岛β细胞分化,及其对糖尿病病情的恢复作用,为糖尿病治疗提供理论基础。 方法 1 大鼠MSC的分离培养和鉴定

关键词： 骨髓间充质干细胞   衰老   D-半乳糖   超氧化物歧化酶   丙二醛   谷胱甘肽过氧化物酶   骨髓间充质干细胞   SA-β-Gal   p16 Ink4a   p53   p21Cip1/waf1  

摘要： 第一部分 骨髓间充质干细胞治疗D-半乳糖衰老模型小鼠的实验研究 研究目的：研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC)对D—半乳糖诱导的衰老模型小鼠衰老指标的影响，了解骨髓间充质干细胞在抗衰老中的作用。 研究方法：采用5％D-半乳糖(0.25ml／10g)连续8周皮下注射建立衰老小鼠模型，并于模型建成后给予骨髓间充质干细胞输注。用PCR方法检测间充质干细胞在受体小鼠中的植入；并检测间充质干细胞治疗前后衰老相关指标：小鼠体重、免疫器官重量，肝组织、血清SOD活力和MDA含量，全血GSH-PX活力的变化。 研究结果：骨髓间充质干细胞在受体小鼠中定植，并且骨髓间充质干细胞治疗后衰老小鼠肝组织和血清MDA含量降低、SOD活力升高；全血GSH-PX活力、小鼠体重、胸腺及脾脏指数增加。 结论：BMMSC能改善D—半乳糖衰老模型小鼠的衰老相关指标，提示MSC可能具有抗衰老作用。

关键词： Duchenne型肌营养不良症   骨髓间充质干细胞   成肌调节因子   细胞治疗  

摘要： Duchenne型肌营养不良症(DuchenneMuscularDystrophy,DMD)是一种以骨骼肌进行性变性、坏死为主要病理特征的致死性的X-性连锁隐性遗传性肌肉疾病，病因是编码骨骼肌膜上抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的基因突变或缺失致使肌膜上缺乏此蛋白，肌膜不稳定，不能耐受运动损伤而导致肌肉萎缩无力。 目前DMD仍无有效的治疗办法，研究主要集中在药物治疗、基因治疗和细胞治疗。药物治疗采用药物作用于DMD病理生理的特定环节，延缓疾病的发展，改善症状但无法阻止病情的进展。基因治疗是向靶细胞引入正常有功能的基因以纠正或补偿致病基因所产生的缺陷，从而达到治疗疾病的目的。DMD细胞治疗包括成肌细胞和干细胞移植治疗。干细胞携带人体正常的基因组，具有成肌分化潜能，引起了研究者们探索肌肉和非肌肉来源成体干细胞移植治疗DMD的兴趣。其中骨髓间充质干细胞(MSC)因为容易获取，体外培养简单，长期培养仍然保持多向分化潜能和生物学特性不变，可以静脉移植，分布范围广，成为理想的组织工程种子细胞。但是异体干细胞移植引起免疫排斥反应，需要放疗或化疗进行免疫抑制，如果能应用自体干细胞，体外基因修正后回输体内进行DMD治疗将绕过免疫排斥问题，提高疗效。因此结合基因与干细胞治疗两种方法，自体干细胞基因修饰治疗已成为DMD治疗的新途径。 本研究拟将DMD细胞治疗和基因治疗结合起来，构建micro-dystrophin基因真核表达质粒，采用脂质体介导micro-dystrophin基因转染mMSCs，移植治疗mdx鼠，探讨干细胞携带外源基因在移植鼠体内分化为有功能的肌细胞的可能性和机制，为自体干细胞体外基因修饰后移植治疗DMD的临床应用提供理论依据。 1材料和方法 1.1实验材料 1.1.1实验动物4-6周龄mdx鼠用于分离mMSCs，进行体外实验和细胞移植。6-8周龄mdx鼠24只，随机分为两组,12只作为阴性对照，12只移植microdys-mMSCs。分别于移植后4周、8周、12周、16周取材。每组各时间点动物为3只。 1.1.2实验试剂与器材(略) 1.2实验方法 1.2.1真核表达质粒pcDNA3.1(+)/microdystrophin的构建及鉴定将质粒PBSK-MICRO、pcDNA3.1(+)转化感受态细菌进行扩增，提取质粒DNA分别进行NotI酶切。切胶回收microdystrophin目的基因，应用CIP使线性pcDNA3.1(+)载体5'末端去磷酸化，然后用T4连接酶将目的基因和载体连接，构建pcDNA3.1(+)/microdystrophin，并进行酶切和测序鉴定。 1.2.2mMSCs分离、培养、鉴定应用含10％胎牛血清和10ng/mlbFGF的L-DMEM培养mMSCs，差速贴壁法分离、扩增及纯化mMSCs，并进行表面抗原测定和两性霉素B诱导成肌。 1.2.3microdystrophin基因转染mMSCs及鉴定采用Lipofectamine2000介导质粒pcDNA3.1(+)/microdystrophin转染mMSCs，G418筛选阳性细胞。应用免疫荧光、western-blot鉴定microdys-mMSCs中有microdys蛋白的表达，应用RT-PCR鉴定有microdysmRNA的转录。 1.2.4mMSCs基因转染、筛选和mdx鼠尾静脉移植在6孔板基因转染mMSCs(方法同上)，筛选并扩增microdys-mMSCs，通过尾静脉移植入mdx鼠，移植细胞数量为2×106/只。 1.2.5移植后运动功能测试在移植后各时间点测试移植组和未移植组mdx鼠牵引实验。让鼠4爪抓住钢丝，计数3min内从钢丝上坠落次数。 1.2.6移植后肌酸激酶(CK)的测定移植后不同时间点分别取移植组和对照组mdx鼠1.2ml外周血，取血清约250ul,CK-NAC检测CK值。 1.2.7移植后骨骼肌组织HE染色不同时间点分别取移植组及未移植组鼠腓肠肌和膈肌，冰冻切片后进行HE染色，镜下观察细胞形态，200×取5个视野，计数肌细胞核中心移位纤维比例。 1.2.8移植后骨骼肌Microdys的免疫荧光、RT-PCR、WesternBlot检测不同时间点分别取移植组及未移植组鼠腓肠肌和膈肌，做免疫荧光染色、RT-PCR和WesternBlot，检测microdys的表达情况，计数microdys阳性肌纤维比例。 1.2.9移植后腓肠肌MyoD免疫荧光、RT-PCR、WesternBlot检测不同时间点分别取移植组及未移植组鼠腓肠肌进行免疫荧光染色、RT-PCR和WesternBlo

关键词： 骨髓间充质干细胞   心肌梗死   静脉移植   心功能  

摘要： 传统的观点认为心肌细胞属于不可再生细胞，一旦损害将无法修复，死亡的心肌细胞被成纤维细胞所代替，引起心脏结构的改变，心衰的发生，以致死亡。将干细胞注入梗死区内的疗法是一种新的阻止心衰进程的治疗方法。这种新的细胞移植方法可以修复损伤心肌，阻止心肌梗死患者的心室壁变薄、瘢痕形成，从而改善心功能。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多能造血干细胞的分化潜能，实验已经证明在小动物体内具有向心肌细胞分化的能力，并且，已有应用于临床的报道。 然而，心肌梗死发生后心肌组织将经历炎症反应、心肌纤维化的复杂病理过程。在此期间移植的骨髓间充质干细胞分化及存活都会受到此病理过程的影响。如何选择合适的时机进行骨髓干细胞移植是一个关键问题。如何将移植细胞输送到心梗区也是一个非常重要的问题。目前干细

关键词： 血管内皮细胞生长因子   骨髓间充质干细胞   基因治疗   细胞移植   血管再生   缺血性心脏病  

摘要： 尽管传统血运重建术取得了巨大进展，但缺血性心脏病的治疗仍然存在诸多不足。治疗性血管生成(therapeutic angiogenesis)通常所采用的两种方法，包括直接注射重组成血管因子的蛋白疗法和基于传递编码成血管因子基因的基因疗法。在众多的成血管因子中，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)由于其在血管生成中的关键作用而被广泛研究，并且VEGF还表现出对心肌缺血损伤的保护作用。近来细胞移植促进血管生成研究是对治疗性血管生成方法的有效补充。骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有分化包括心肌细胞，内皮细胞在内的多种细胞的能力。并且，MSCs易于从骨髓中分离培养，体外扩增，是较为理想的种子细胞。在梗死心肌和缺血骨骼肌进行成肌细胞介导的成血管基因传送能同时获得肌肉生成和血管生成，因此被视为一种极具潜能的替代疗法。 在这些研究的基础上，我们假设VEGF基因转染的MSCs移植能有效增强缺血心肌的成肌和血管生成效应，进而导致心功能显著改善。为验证该假设，并为该方法的临床运用进一步做出铺垫性实验论证，我们进行了如下研究，共分为三部分：

关键词： 间充质干细胞   白细胞介素12   基因治疗   胶质瘤  

摘要： 胶质瘤是常见的原发性脑肿瘤,其较高的复发率使之成为临床治疗的难题。基因治疗是脑肿瘤治疗的重要手段,而基因治疗肿瘤的疗效主要决定于目的基因和载体系统的选择。目前干细胞已用于多种疾病细胞替代治疗和基因治疗的载体,如神经干细胞,但面临着伦理、来源等问题。骨髓间充质干细胞（BMSCs）,有多向分化的潜能,且取材容易,能迅速培养扩增,通过自体移植又可避免免疫排斥反应,具有更广阔的应用前景。本研究旨在体外分离培养BMSCs,将IL-12,一种强效抗肿瘤作用的细胞因子,通过逆转录病毒导入BMSCs,利用BMSCs能够迁移追踪肿瘤细胞,并能整合于宿主细胞,长期、稳定表达外源基因的特点,将其作为脑肿瘤基因治疗的载体,通过体外及体内实验观察对胶质瘤的作用,干细胞的存活和分化情况,并对其抗肿瘤作用机制进行了研究。结果表明分离鉴定得到的具有多向分化潜能的大鼠BMSCs,作为IL-12基因治疗的载体移植入胶质瘤模型体内,可以存活并可抑制胶质瘤的生长;IL-12抗肿瘤作用的机制并不是IL-12直接抑制肿瘤细胞的生长,而是通过刺激CD4+和CD8+的T淋巴细胞浸润起抗肿瘤作用。该研究为BMSCs作为载体对肿瘤进行基因治疗提供了实验依据。

关键词： 小型猪   骨髓间充质干细胞   心肌梗死   自体骨髓  

摘要： 目的比较3种不同途径移植自体骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗急性心肌梗死效果。方法小型猪12只,建立心肌梗死(AMI)模型,纯化扩增并将DAPI标记的MSCs经冠脉、心内膜及心外膜注射移植,移植前后记录左室血流动力学指标及LVEF变化,3个月后取心肌行免疫组织化学检测结蛋白desmin和心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)的表达。结果冠脉组梗死心肌周围未见明确的移植细胞,仅见非特异的荧光染色,与心梗后比较心功能改善,但与对照组比较无明显差异;心内膜及心外膜组移植的MSCs分布较广,胞核为蓝色椭圆形,免疫组织化学检测胞浆心肌特异蛋白染色阳性,与冠脉移植组比较LVEDP降低(P<0．05)、LV±dp／dtmax增快(P<0．05)、 LVEF增高(P<0．05)、新生血管数增加及瘢痕面积缩小等指标改善更明显,且有统计学意义。结论 3种途径移植MSCs均可改善AMI后心功能,经冠脉移植不是最佳途径,心肌内注射效果更好。

关键词： 干细胞   移植   冠心病   心肌再生  

摘要： 心肌梗死是导致人类死亡的主要疾病之一,干细胞移植为心肌梗死的治疗提供了一种新的思路,因而成为近年来研究的热点。骨髓间充质干细胞因为不涉及伦理道德问题,而且取材方便,所以具有较好的临床应用前景。近年来有关骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究,骨髓间充质干细胞的输送方式及移行机制,移植细胞对心功能的影响以及移植转基因干细胞的治疗前景的研究有了长足的进展。