关键词： 骨髓间充质干细胞   肝细胞样细胞   肝硬化   移植   大鼠  

摘要： 目的了解肝硬化大鼠在输注骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)后肝功能生化指标、AFP的变化情况,为临床应用提供实验依据。方法将健康雌性Wistar大鼠随机分为正常组、对照组和实验组;对照组和实验组腹腔注15%的四氯化碳石蜡油溶液建立肝硬化模型。实验组经尾静脉输入用BrdU(Bromodeoxyuridine)标记的健康雄性Wistar大鼠BM-MSCs,于1/2h、1wk、2wk、3wk、4wk处死对照组和实验组大鼠,用PCR检测雄性性别决定基因SRY、免疫组化检测BrdU以了解BM-MSCs的整合情况;用全自动生化分析仪检测血清肝功能指标、放免法检测AFP。结果PCR和BrdU免疫组化初步分析对照组在不同时期均无雄性BM-MSCs,实验组在1/2h处死的5例中均阴性,在第1wk处死的5只中有2例阳性,在第2wk处死组5只中有3只阳性,在第3、4wk处死组5只中均阳性。ALT、AST随着时间推移有所改善,在第4wk时与对照组有显著性差异(28.0±3.74,84.6±36.38vs56.0±26.66,161.2±55.43,P<0.005),ALB仅在第3kw时对照组和实验组有显著性差异(30.3±2.18vs34.4±2.49,P<0.005),但与正常组无显著性差异;GLO在不同时间点均无显著性差异;AFP虽无显著性差异,但有上升的趋势。结论BM-MSCs可以植入肝脏汇管区、肝细胞索,植入细胞最早见于移植后约7d;植入的BM-MSCs能够部分替代肝细胞的功能。

关键词： 骨髓间充质干细胞   移植   脊髓损伤   脑外伤   多发性硬化   Parkinson's病  

摘要： 目的 观察骨髓间充质干细胞（MSCs）移植治疗脊髓损伤（SCI）、脑外伤（TBI）、Parkinson’s病（PD）和多发性硬化（MS）的临床疗效和不良反应。方法 脊髓伤病6例，TBI3例，MS1例，PD1例，经骨髓穿刺采集白体骨髓222～350ml，分离提取MSCs后经静脉途径和／或蛛网膜下腔内一次性或分次注射。干细胞治疗前、后对患者神经功能变化及不良反应分别进行评价。结果 自体MSCs治疗脊髓伤病6例，5例有不同程度的感觉、运动和自主神经功能改善。治疗TBI3例，2例运动功能明显改善，1例持续植物状态患者PVS评分由5分提高到8分。治疗PD和MS各1例，PD患者震颤减轻，肌张力明显降低；MS患者运动功能明显改善。症状和体征改善最早出现在治疗后2d，多数患者在治疗后2周有明显改善。MSCs移植常见的不良反应包括发热（7／11例）、头痛（2／11例）、腹胀（1／11例）；1例于蛛网膜下腔内注射时出现双下肢麻木、脑膜刺激征。结论 MSCs移植治疗脊髓损伤、TBI、PD和MS等近期疗效明显，不良反应较少，但其远期疗效还需要进一步随访和观察。

关键词： 骨髓间充质干细胞   脑缺血再灌注   碱性成纤维生长因子   大鼠  

摘要： 目的:研究骨髓间充质干细胞(MSC)对大鼠脑缺血再灌注损伤的治疗机制。方法:20只Wistar大鼠随机分为对照组和MSC治疗组。应用GFP阳性MSC,再灌注1d后经尾静脉注射MSC(1×106),对照组则注射PBS。采用线栓法建立脑缺血再灌注模型。术后每天由双盲于试验组的研究人员应用爬杆计分法评定大鼠神经功能。缺血2h再灌注8d取脑组织,用免疫组织化学方法检测脑组织中bFGF的表达。结果:MSC治疗组大鼠的神经功能缺损评分明显低于手术组和对照组(P<0.05)。MSC治疗组缺血侧缺血周边区脑组织中观察到GFP阳性与bFGF免疫组化染色阳性细胞。结论:经尾静脉给予的MSC可促进脑缺血再灌注大鼠的运动功能恢复;bFGF表达升高,可能是MSC脑保护作用机制之一。

关键词： 骨髓间充质干细胞   干扰素γ   胶质瘤  

摘要： 胶质瘤是常见的原发性脑肿瘤,占颅内原发肿瘤的一半以上,易复发,难治愈。胶质瘤具有迁移特性,迁移的微小病灶通过常规手术和放化疗难以根除。 骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨髓中除造血干细胞以外的另一类干细胞,是一群具有多向分化潜能的细胞。BMSCs的多向分化潜能,尤其是它向神经细胞分化的能力,可修补受损脑组织;此外,BMSCs还具有向胶质瘤迁移能力,给本研究提供了一个理想的基因治疗胶质瘤的载体。 胶质瘤患者的免疫功能低下与IFNγ有关,不仅患者外周血淋巴细胞IFNγ分泌不足,而且胶质瘤细胞中IFNγ基因也呈劣势表达;此外,胶质瘤细胞分泌的免疫抑制因子也通过下调T淋巴细胞表达IFNγ,从而抑制T淋巴细胞功能。 本实验将分子生物学技术与形态学手段相结合,利用转基因技术在国内、国外首次将mIFNγ基因通过携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的逆转录病毒载体导入大鼠的BMSCs,在体内、体外观察转染mIFNγ基因的BMSCs治疗胶质瘤的情况。结果证明,BMSCs可向胶质瘤细胞迁移,并可分化成MAP-2或GFAP阳性细胞;转染mIFNγ基因的BMSCs在体内外均可抑制大鼠胶质瘤细胞生长,延长大鼠生存期。

关键词： 贫血   再生障碍性   间充质干细胞   T细胞  

摘要： 目的探讨在体外骨髓间充质干细胞(MSC)治疗再生障碍性贫血(AA)的机制。方法2003-02～2005-04安徽医科大学第一附属医院血液内科从人骨髓分离培养MSC,用尼龙棉柱分离T淋巴细胞。分别以不同数量MSC加入到植物血凝素(PHA)刺激的AA患者T淋巴细胞增殖体系中,用MTT还原法测定MSC对AA患者T细胞增殖的影响,通过流式细胞术计算CD3+T细胞CD25(IL-2R)的表达率。结果当MSC为2×104/孔(A组)和1×104/孔(B组)时,与单独培养的AA患者T淋巴细胞(对照组)相比,MSC对AA患者T淋巴细胞增殖及CD25的表达呈明显抑制作用,差异有统计学意义(P<0·01)。当MSC为1×103/孔(C组)时,无统计学意义。结论MSC抑制AA患者T细胞的活化与增殖,且这种抑制作用具有数量依赖性。

关键词： 间充质干细胞   细胞培养   基因治疗   白介素4   胶质瘤   动物模型  

摘要： 目的 (1)探讨成体骨髓间充质干细胞的体外培养方法并研究培养细胞的生物学行为特征,建立体外分离培养MSCs程序方法,为进一步实验和临床应用提供基础; (2)利用绿色荧光蛋白基因作为示踪剂,观察MSCs对大鼠脑胶质瘤的趋向性,以明确MSCs能否作为肿瘤基因治疗的载体; (3)探讨颅内移植IL-4基因修饰的MSCs对大鼠脑胶质瘤的治疗效果。方法 (1)采用梯度离心法分离大鼠骨髓基质细胞,24h后换液,保留贴壁细胞,体外培养扩增,光镜下观察细胞形态特点,传代培养后免疫细胞化学技术鉴定细胞表面CD44,CDl05和CD45的表达,分别在特定条件下进行成骨、脂肪和神经细胞的诱导分化,分别鉴定诱导后细胞碱性磷酸酶、油红0和神经元特异性烯醇化酶的表达; (2)脂质体介导EGFP基因转染MSCs,G418筛选,荧光显微镜下观察基因转染的情况,同时立体定向方法建立大鼠C6脑胶质瘤模型,分别行HE染色和免疫组织化学鉴定肿瘤组织GFAP的表达,并将EGFP标记的MSCs原位种植到大鼠脑胶质瘤模型中,2周后取出脑和肿瘤组织,制成切片,在荧光显微镜下观察绿色荧光的分布情况; (3)脂质体介导mIL-4基因转染MSCs,G418筛选,转染后采用ELISA检测培养细胞上清中mIL-4的分泌,RT-PCR检测mIL-4 mRNA的表达水平,将稳定转染mIL-4并经BrdU标记的MSCs颅内原位种植于荷C6脑胶质瘤大鼠,分别以PBS和未转染基因的MSCs作为对照组。观察治疗后动物生存状况、磁共振扫描观察肿瘤大小、H-E染色观察肿瘤组织学变化,免疫组化鉴定CD4、CD8、mIL-4及BrdU的表达。 结果 (1)刚接种的骨髓基质细胞呈圆形,悬浮生长,24h后可见散在贴壁细胞,此后逐渐增多并变为长或宽扁的梭形,免疫化学显示多数细胞为CD44,CD105阳性染色,而CD45为阴性,细胞在体外可以定向诱导分化为成骨、脂肪和神经元样细胞; (2)EGFP基因在体外可以稳定转染MSCs,阳性细胞在荧光显微镜下显示为绿色荧光,HE染色和免疫组化证实大鼠颅内肿瘤为胶质源性肿瘤,表现为GFAP阳性,EGFP标记的MSCs原位移植后弥散分布于肿瘤组织以及肿瘤与脑组织交界处; (3)MSCs转染后可稳定表达mIL-4,***06细胞培养24h可分泌mIL-465.78±2.28np/ml,RT-PCR在转基因组可检测到mIL-4 mRNA表达,而对照组未检测到,BrdU标记的MSCs移植后弥散分布于肿瘤内部及边缘,MSCs-mIL-4治疗组生存期明显延长,肿瘤体积(mm3)明显小于各对照组(55.08±5.14vs.227.72±10.23,279.54±18.84,P<0.01),肿瘤局部可出现坏死改变,并有CD4+和CD8+细胞浸润,免疫组化在治疗组可检测到mIL-4蛋白的表达。结论 (1)MSCs在体外易于培养和扩增,并可以向多种组织分化; (2)外源性基因可在体外转染MSCs; (3)MSCs对大鼠脑胶质瘤具有趋向性; (4)mmIL-4基因修饰的MSCs对大鼠脑胶质瘤有良好的靶向性和治疗效应; (5)MSCs作为治疗载体是脑胶质瘤治疗的有力工具。

关键词： 骨髓间充质干细胞   下肢   缺血性疾病  

摘要： 背景与目的 下肢缺血性疾病多由动脉硬化性闭塞症、血栓闭塞性脉管炎或糖尿病引起,是中老年人慢性下肢缺血最常见的原因,它是一种全身性动脉病变,多发生于50岁以上,男性患者多于女性。近年来由于生活水平的提高,人均寿命的延长,饮食习惯的改变,诊疗技术和设备的完善,动脉硬化性下肢缺血的发病率有逐年上升的趋势。 近年来,随着分子生物学和细胞生物工程技术的发展以及对干细胞研究认识的深入,通过移植技术将干细胞植入缺血下肢,形成新生血管及侧支循环,改善下肢血供,达到治疗下肢缺血性疾病的目的,这为下肢缺血性疾病提供了一种全新的治疗策略。 在过去两年内,我们分别在基础和临床中进行了自体骨髓间充质干细胞(mesenchynmal stem cells,MSCs)在下肢缺血性疾病中的研究。其中在基础研究中,我们还进行了转染血管内皮生长因子(Vascular endothel ial growthfactor,VEGF)的MSCs在下肢缺血性疾病中的研究。本研究旨在通过分析移植自体MSCs前后下肢血流灌注情况,探索其安全性、可行性,并且取得了初步结果。 基础研究 1.研究方法: ①健康纯种新西兰大白兔26只,雌雄不限,按移植成分的不同,随机分成3组:(1)移植转染VEGF的MSCs组10只(以下简称VEGF组);(2)移植单纯MSCs

关键词： 骨髓间充质干细胞   细胞移植   心室重构   急性心肌梗死  

摘要： 急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后心肌细胞发生不可逆转的损伤和丢失,又很难通过自身组织的再生来修复。坏死心肌逐渐被纤维组织取代,发生心室重构(ventricular remodeling),最终引起充血性心力衰竭。目前药物、冠脉介入和搭桥手术等治疗手段在一定程度上能阻止重构的进程,但也只能恢复再灌注,不能修复或逆转已坏死的心肌,更不能促进心肌再生。心脏移植(heart transplantation)虽能取代受损心肌,彻底改善心脏状态,但是因其供体来源困难、手术技术要求高、费用昂贵以及免疫排斥反应等原因,临床很难广泛开展。因此,如何增加心肌细胞数目从根本上逆转心肌梗死后心室重构改善心功能仍然是目前主要问题之一。 近年来,通过干细胞(stem cells)移植的方法来增加心肌细胞数目,已取得了令人鼓舞的进展。干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞,其中骨髓来源的干细胞因其来源广泛,可以自体移植而倍受关注,如骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体内和体外均已成功的被诱导分化为心肌细胞。大量研究证实骨髓干细胞移植可以促进梗死区心肌再生和血管形成,修复受损心肌,改善心脏功能,但是目前干细胞移植对整体心室重构和基质重构影响的研究还比较少。 临床上,心肌梗死好发于中老年人,自体骨髓干细胞增殖分化能力较弱,培养需要较长时间,可能会贻误移植时机,而异体细胞移植可能存在免疫排斥反应。因此,我们实验主要观察骨髓干细胞移植对心室重构和基质胶原重构的影响,以及探讨同种异体移植的可行性。

关键词： 骨髓间充质干细胞   糖尿病   胰岛素   移植  

摘要： 目的 近几年,各国糖尿病发病率不断上升,据2000年第17届国际糖尿病大会调查的结果显示,全世界的糖尿病患者数已超过1.51亿。临床上通常采用皮下注射胰岛素来治疗1型和部分2型糖尿病,其治疗效果并不理想,且很难阻止糖尿病并发症的发生及发展。近20年来,国内外学者对胰腺移植及胰岛移植做了大量的探索。对于已经丧失胰岛细胞功能的糖尿病患者来说,植入胰岛β细胞或其替代物被认为是最有效的方法。但供者细胞来源不足及免疫排斥反应等限制了这种方法的应用。干细胞作为一类具有多向分化潜能的细胞,已经逐渐成为人们治疗糖尿病的新希望。 骨髓间充质干细胞(MSC)来源广泛,取材容易,便于自体移植,且在体外长期培养过程中,始终保持其多向分化潜能,遗传背景稳定,自体移植可避免免疫排斥反应,是理想的可供移植的种子细胞。探索人自身的骨髓间充质干细胞的细胞替代治疗具有广阔的应用前景,方法比较简便,而且没有伦理学和细胞来源的限制。 已有研究证实MSC移植入糖尿病大鼠体内,在胰腺发现了可分泌胰岛素的移植的MSC。但也有研究者认为没有证据支持MSC在体内能分化成胰岛β细胞。在本实验中采用了新的方法,进一步验证应用骨髓间充质干细胞治疗糖尿病的可能性。我们尝试首先建立大鼠糖尿病模型,再将BrdU标记的MSC移植入大鼠体内,监测大鼠血糖和体重变化,并观察MSC在糖尿病鼠体内微环境是否能向胰岛β细胞分化,及其对糖尿病病情的恢复作用,为糖尿病治疗提供理论基础。 方法 1 大鼠MSC的分离培养和鉴定

关键词： 骨髓间充质干细胞   衰老   D-半乳糖   超氧化物歧化酶   丙二醛   谷胱甘肽过氧化物酶   骨髓间充质干细胞   SA-β-Gal   p16 Ink4a   p53   p21Cip1/waf1  

摘要： 第一部分 骨髓间充质干细胞治疗D-半乳糖衰老模型小鼠的实验研究 研究目的：研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC)对D—半乳糖诱导的衰老模型小鼠衰老指标的影响，了解骨髓间充质干细胞在抗衰老中的作用。 研究方法：采用5％D-半乳糖(0.25ml／10g)连续8周皮下注射建立衰老小鼠模型，并于模型建成后给予骨髓间充质干细胞输注。用PCR方法检测间充质干细胞在受体小鼠中的植入；并检测间充质干细胞治疗前后衰老相关指标：小鼠体重、免疫器官重量，肝组织、血清SOD活力和MDA含量，全血GSH-PX活力的变化。 研究结果：骨髓间充质干细胞在受体小鼠中定植，并且骨髓间充质干细胞治疗后衰老小鼠肝组织和血清MDA含量降低、SOD活力升高；全血GSH-PX活力、小鼠体重、胸腺及脾脏指数增加。 结论：BMMSC能改善D—半乳糖衰老模型小鼠的衰老相关指标，提示MSC可能具有抗衰老作用。