关键词： 间充质干细胞   移植   血管内皮细胞生长因子  

摘要： 目的探讨转染血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因的大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）同种异体移植促进缺血皮瓣的血管新生，从而提高皮瓣存活率的可能性。方法体外分离、培养、鉴定SD大鼠MSCs，PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染MSCs，免疫荧光方法检测MSCs体外表达VEGF的情况，CM-DiI标记MSCs。SD大鼠随机分3组：A组[PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染的MSCs移植]、B组（单纯MSCs移植）、C组（DMEM-F12培养基）。每只大鼠背侧皮下按组分别注射细胞悬液和培养基，注射后ELISA法连续检测大鼠血浆VEGF浓度，注射后第4天掀起1个蒂在尾侧的9cm×2cm的随意皮瓣。在术后第14天分别观察皮瓣的存活率、激光多普勒血液监测仪监测血流灌注、CD34免疫组织化学检测皮瓣毛细血管密度、荧光显微镜检测MSCs在皮瓣内的分布和存活状况。结果转染VEGF165基因的MSCs体外和体内检测均高表达VEGF165蛋白。A、B、C三组的皮瓣存活率分别为（83．1±2．6）％、（66．4±6．1）％、（51．5±7．5）％（P〈0．05）；A、B、C三组的毛细血管密度（条／mm^2）分别为：89．2±6．1、57．1±4．7、28．7±2．8（P〈0．05）；血流灌注比值A组高于B、C两组，B组高于C组（P〈0．05）；转染VEGF165基因的MSCs移植SD大鼠皮瓣后，MSCs存活并参与血管新生。结论转染VEGF基因的大鼠MSCs体外培养后异体移植可促进缺血皮瓣的血管新生，提高存活率。

关键词： 骨髓细胞   间质干细胞/细胞学   干细胞   移植,自体   脊髓损伤  

摘要： 目的:观察自体骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤患者的近期疗效及其安全性。方法:选择2005-04/2006-02在山东省残疾人康复中心住院的脊髓损伤患者24例,采用随机表法分为治疗组和对照组。患者知情同意并签署知情同意书。治疗组11例,对照组13例,均经CT或MRI确诊并行手术治疗。两组在年龄、病程、损伤程度(ASIA分级)等方面均具有可比性(P>0.05)。治疗组在综合康复治疗的基础上给予自体骨髓间充质干细胞治疗,经髂骨穿刺采集自体骨髓156～180mL,分离提取骨髓间充质干细胞后经静脉途径和/或蛛网膜下腔1次性或分次注射。对照组仅给予综合康复治疗。两组均于入院当天、治疗后7,15,30,60,90d进行运动与感觉、日常生活能力、膀胱功能评定。结果:24例患者均进入结果分析。①治疗组11例患者均有不同程度的感觉、运动和自主神经功能改善,与对照组比较,差异不显著。②治疗组ASIA分级A级8例,有2例在第60天、1例在第90天评估中恢复为B级。C级1例,在第30天评估中恢复为D级,第90天评估中恢复为E级,能独立行走,生活完全自理。D级2例,其中1例在第90天评估中恢复为E级。对照组A级9例,1例在第90天评估中恢复为B级。B级1例,治疗后无变化。C级2例,1例在第90天评估中恢复为D级。③骨髓间充质干细胞移植常见的不良反应包括低热(7/11例)、头痛(2/11例)、腹胀(1/11例),其中1例于蛛网膜下腔注射后出现双下肢麻木和脑膜刺激征,均于两三天内自行消失。结论:骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤近期有一定疗效而且安全,但远期疗效有待于进一步观察。

关键词： 干细胞   移植   心肌梗死   治疗  

摘要： 心肌梗死是近年来导致人类死亡的主要疾病之一,骨髓间充质干细胞移植在一定程度上能改善心功能,且具有取材方便、不涉及伦理道德问题等优点,成为研究的热点。近年来有关骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化、心功能的改善、细胞移植方法等方面的研究取得很大的进展,但同时也发现了不少问题。

关键词： 骨髓间充质干细胞   胰腺细胞   共培养   糖尿病   细胞移植  

摘要： 目的通过移植骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的方法试治疗大鼠糖尿病。方法贴壁生长的MSC与大鼠胰腺的细胞共培养以检测其向胰岛细胞分化的潜能。并将体外培养扩增的MSC移植入糖尿病大鼠体内,观测其能否改善糖尿病病情及其在大鼠体内微环境中的分化情况。结果共培养法可使MSC分化为胰岛样细胞。对大鼠的MSC移植能明显缓解糖尿病病情。结论MSC移植的方法对大鼠糖尿病有一定的治疗作用。

关键词： 骨髓   干细胞移植   脑卒中   大脑中动脉梗塞   磁共振成像  

摘要： 目的探索利用磁共振技术活体追踪干细胞的可行性以及干细胞对卒中大鼠脑梗死体积的影响。方法采集大鼠后肢股骨和胫骨骨髓,采用密度梯度离心法分离并培养骨髓间充质干细胞(BMSCs)。利用超顺磁性氧化铁和多聚左旋赖氨酸的混合物标记BMSCs,普鲁士蓝染色检测标记率。线栓法建立18只大鼠脑缺血2h再灌注动物模型,分为缺血对侧BMSCs移植组(细胞数1.5×105/15μl)、缺血同侧纹状体移植组(细胞数1.5×105/15μl)和对照组(15μlD-Hanks液)3组,每组6只。分别在脑缺血后第1天、细胞移植后第1天及第14天进行磁共振扫描,对各时间点梗死体积的变化进行统计学分析。结果超顺磁性氧化铁对BMSCs的标记率为96%。磁共振追踪显示移植后第14天缺血同侧移植组BMSCs向缺血灶边缘迁移,缺血对侧移植组BMSCs沿胼胝体弥散,但是3组之间的脑梗死体积变化差异无显著性(P>0.05)。结论超顺磁性氧化铁对干细胞标记率高,磁共振活体追踪有利于了解干细胞移植后的存活和迁移。BMSCs脑内移植对于卒中大鼠脑梗死体积的影响无统计学意义。

关键词： 人骨髓间充质干细胞   细胞移植   心肌梗塞   大鼠  

摘要： 目的:在大鼠心肌梗死模型上移植冠心病患者来源的骨髓间充质干细胞,探讨人骨髓间充质干细胞改善心肌梗死后心功能的作用机制。方法:抽取冠心病患者骨髓,用人骨髓间质细胞专用培养液进行体外培养、扩增、标记。结扎大鼠冠状动脉左前降支制作心肌梗死模型,2周后使用超声筛选出合格的动物模型。然后动物随机分为细胞移植组(n=14)和培养液注射组(对照组,n=13)。在移植前后对心脏的收缩、舒张功能和心室重构指标进行超声评价和对比,取材后进行病理学检查和分子生物学检测。结果:移植后进行超声评价,治疗组较对照组射血分数值和缩短分数值显著改善。免疫组化显示移植细胞在宿主体内可以向肌源性细胞分化。逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)显示细胞治疗组梗死区心肌Ⅰ型、Ⅲ型胶原基因表达水平明显高于对照组,而在非梗死区低于对照组。细胞治疗组梗死区间质细胞源因子、血管内皮生长因子、Bcl-2基因表达水平均明显高于对照组。结论:冠心病患者骨髓间质细胞移植后可以提高心肌梗死后心脏收缩功能,减轻左心室重塑。作用机制可能为新血管生成增加、细胞外基质改变、旁分泌、抗凋亡和心肌再生等共同作用的结果。

关键词： 骨髓   干细胞移植   脑卒中   大脑中动脉梗塞   细胞分化  

摘要： 目的研究骨髓间充质干细胞(BMSC)对大鼠缺血性脑卒中的治疗作用及治疗机制。方法采集人志愿者骨髓,密度梯度离心法分离、培养 BMSC;建立大脑中动脉栓塞缺血2 h 再灌注大鼠模型,根据神经损伤评分将符合标准的60只脑缺血模型大鼠随机分为治疗组(BMSC 移植组,48只)和对照组(D-Hanks 液注射组,12只),24 h 后在脑缺血边缘区皮层分别注射 hBMSC 悬液和 D-Hanks 液;移植后第4天开始进行粘贴物移除实验、转棒实验及 Morris 水迷宫实验的循环测试至第32天;治疗组分别在移植后1、2、3及4周分批次处死大鼠,通过免疫荧光技术动态追踪 BMSC 并检测细胞的迁移和分化。结果移植后第1、2周细胞大量存活并向病灶迁移,第3周细胞存活数量明显减少,第4周存活细胞极少;hBMSC 在大鼠脑内没有明确表达微管相关蛋白(MAP)2、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷脂(GalC)等神经细胞的特异蛋白。治疗后1周水迷宫平均逃逸时间,治疗组为(69±10)s,对照组为(120±0)s,P<0.05,至第4周两组差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后第10天转棒实验(10 r/min)平均潜伏期,治疗组为(167±18)s,对照组为(37±19)s,P<0.05,至实验终期差异仍有统计学意义。治疗后第13天粘贴物移除实验平均潜伏期,治疗组为(33±8)s,对照组为(84±13)s,P<0.05,至实验终期差异仍有统计学意义。结论 BMSC 脑内移植可以显著改善脑缺血大鼠神经功能的恢复;移植细胞在大鼠脑内可以向病灶周围迁移,但是细胞存活有一定时限性;BMSC 在大鼠脑内没有明确分化为经细胞。

关键词： 急性肺损伤   LPS   急性呼吸窘迫综合征   ALI   肺组织匀浆   肺泡灌洗液   骨髓间充质干细胞   细胞标志物  

摘要： 急性肺损伤(acute lung injury，ALI)／急性呼吸窘迫综合征(acute respiratorydistress syndrome，ARDS)是临床上比较常见的危重病症，死亡率高达40％。ALI是ARDS的前期。ALI／ARDS的主要病理改变是弥漫性的肺泡-毛细血管膜的损伤，可由严重感染、创伤、休克、酸中毒及有害气体吸入等多种因素引起，临床表现为呼吸窘迫和顽固性低氧血症。除机械通气外，目前对ALI／ARDS的治疗仍缺乏有效的手段。寻找新的治疗措施是目前ALI／ARDS研究中的重点。 上世纪九十年代以来，干细胞研究领域取得了一系列突破性进展，为利用干细胞修复组织损伤，治疗一些疑难和复杂疾病提供了可能性。文献相继报道了干细胞在治疗心力衰竭、糖尿病等方面的一些进展，展示了其作为一种新型治疗手段的良好前景。干细胞是一类具有无限自我更新能力和多向分化潜能的细胞，按发生学来源可分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)和成体干细胞(somatic stem cell)。成体干细胞存在于机体的各种组织器官中，在病理状态或外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。某些情况下，成体干细胞表现出很强的跨系或跨胚层分化潜能，即具有“可塑性(plasticity)”。 骨髓(bone marrow)间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)属于成体干细胞，目前报道它具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、心肌细胞甚至肝脏细胞和神经细胞等方向分化的多种潜能。而且骨髓间充质干细胞通过骨髓吸取就可以得到，取材容易，并在体外有很大的扩增潜能，因此利用MSCs治疗疾病具有突出的优点。 本研究观察骨髓间充质干细胞在脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导的急性肺损伤中的作用，主要进行了以下几方面的工作： 1．小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定。取小鼠后肢股骨和胫骨，吸取骨髓进行全骨髓培养，得到MSCs，并做细胞免疫化学染色，检测MSCs特异表面标记。 2．建立LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型。利用小鼠咽后壁吸入LPS的方法造成小鼠肺损伤；称重计算肺水肿指数；肺组织切片HE染色观察组织病理改变；ELISA检测肺泡灌洗液和肺组织匀浆中IL-1β含量。 3．供体骨髓间充质干细胞的移植和效果评价。将供体MSCs用Brdu标记后行免疫细胞化学染色，观察细胞核中Brdu标记效果；将标记过的MSCs制成细胞悬液，通过尾静脉移植入肺损伤小鼠体内，移植后4天做肺组织切片进行免疫组织化学染色及双染色观察移植细胞的植入和分化状态；检测肺水肿指数，肺泡灌洗液和肺组织匀浆中IL-1β含量。 结果表明： 1、培养的MSCs细胞多呈集落样生长，体积较小，成梭形或柳叶形，细胞核明显，核浆比大。细胞免疫组织化学染色显示，表面标记CD44阳性，而造血系表面标记CD34阴性。 2、吸入LPS后，小鼠出现典型的肺损伤病理改变，炎症细胞浸润，肺泡间隔增厚，毛细血管充血，肺泡内可见透明膜形成，严重者肺泡正常结构消失。损伤小鼠肺水肿指数和肺组织匀浆1L-1β含量明显增加。 3、用Brdu标记小鼠MSCs后，利用抗Brdu单克隆抗体进行免疫细胞化学染色，显示标记的细胞出现Brdu阳性；标记的MSCs移植入同种异体的小鼠肺损伤模型内，小鼠肺部出现外源性MSCs，这些细胞表现出上皮细胞表型，免疫组织化学双染色显示Brdu阳性细胞也表达上皮细胞标志物——细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)。治疗后小鼠与治疗前相比，肺水肿指数和肺组织匀浆IL-1β含量下降。 上述研究结果提示：利用全骨髓培养法培养的MSCs特点符合已知MSCs的特征；吸入LPS后小鼠出现典型的急性肺损伤病理改变；将用Brdu标记的外源性MSCs通过尾静脉移植到肺损伤小鼠体内，MSCs可迁移至肺损伤部位，并表现出上皮细胞表型，参与损伤的肺上皮的修复，并减轻肺水肿程度，减少炎症因子释放。

关键词： 骨髓间充质干细胞   再生障碍性贫血   治疗   细胞培养  

摘要： 目的:探讨骨髓间充质干细胞治疗再生障碍性贫血的机制。方法:（1）体外分离培养正常人和再障患者的骨髓问充质干细胞,观察其形态学的差异,同时用流式细胞仪检测其分子表面抗原以及PCR法检测成脂肪细胞的差异。（2）提取56例再障患者的骨髓单个核细胞按发病机制进行分组培养。（3）①用正常骨髓MSC与再障的MNC共孵育,每周计数总细胞数,集簇、集落数,进一步分析增殖动力学。②用正常骨髓MSC与再障的T细胞共孵育,流式细胞仪检测T细胞表面抗原和T亚群的变化,以及与免疫相关的细胞因子IL-2,IL-4,IL-10、IFN-γ、TNF-α、TGF-β六种细胞因子的基因（RT-PCR法）和蛋白（ELISA法）两个水平在共孵育前后表达的变化。（4）正常骨髓MSC输注再生障碍性贫血小鼠模型中,观察其一般状况、骨髓、脾脏病理组织的改变。结果:1、（1）正常组和AA组MSC细胞形态和表面标志无明显差别。（2）体外AAMSC向脂肪细胞诱导分化较正常组早。（3）AA-BMSCs表面有mIL-15的异常表达。2、AA发病机制分组结果属干细胞缺陷组14例（28%）,免疫介导组27例（44.8%）,微环境缺陷组15例（24.1%）。3、正常骨髓MSC能够支持AA红系集落、粒-单系集落、HPP-CFC集落的增殖。4、（1）AA患者外周血Treg细胞数量减少,提示AA属于自身免疫病。（2）AA患者外周血T细胞长期表达CD69,提示AA T细胞处于预激活状态。（3）AA外周血T淋巴细胞与正常骨髓间充质干细胞共培养T细胞的生长曲线以及淋巴细胞增殖率均下降。（4）AA外周血T淋巴细胞与正常骨髓间充质干细胞共培养后,T细胞的表面标志Annexin-V无变化,而CD8表达下降,CD4/CD8回升。（5）骨髓间充质干细胞下调AAIL-2、IFN-γ、TNF-α的表达,同时上调IL-4、IL-10、TGF-β1的表达,从而调节AA紊乱的免疫。5、（1）联合应用3.0GY 60Co-γ线照射全身一次照射后,第4d,5d,6d ipCY 50.0 mg/kg和CH 62.5 mg/kg,小鼠外周血HB,WBC,PLT及造血器官病理检查均符合AA标准,模型建立成功。（2）造模后,加用正常骨髓MSC可使WBC,PLT,HB的回升,修复骨髓和脾脏的病理结构,提高造血功能。结论:1、正常组和AA组MSC细胞形态和表面标志无明显差别,但体外AAMSC易成脂性和表面有mIL-15的异常表达可能参与了再生障碍性贫血的发生。2、再生障碍性贫血是一种T细胞异常激活的自身免疫性疾病。3、正常骨髓MSC能够支持从红系集落、粒-单系集落、HPP-CFC集落的增殖。4、正常骨髓间充质干细胞可能通过下调AA IL-2、IFN-γ、TNF-α、CD8的表达,同时上调IL-4、IL-10、TGF-β1、CD4的表达,而调节AA紊乱的免疫。5、正常骨髓MSC输注能改善再障模型小鼠的一般情况,回升外周血象,修复骨髓和脾脏的组织结构,改善造血功能。

关键词： 骨髓间充质干细胞   细胞移植   心室重构   急性心肌梗死   缺氧  

摘要： [背景]：骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种从骨髓中分离获得的成体干细胞。骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性心脏病是近年来新兴的一种治疗方法。骨髓间充质干细胞生存的骨髓环境本身处于低氧状态，体外缺氧预处理骨髓间充质干细胞能否对心功能改善有额外益处尚不甚明确。[目的]：初步探讨缺氧预处理骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对大鼠心梗后心室重构和心功能的影响，并初步探讨相关机制。[方法]：取大鼠的骨髓，体外分离、扩增培养MSCs，Brdu标记。在结扎冠脉后1周分别将大鼠MSCs和缺氧预处理MSCs、缺氧培养基，分点注射到大鼠心脏梗死边缘区。1周及4周后采用超声心动图和解剖直测法获得大鼠心功能、心室重构和病理学资料。[结果]：与对照组比较，细胞移植组、缺氧预处理干细胞移植组、缺氧培养基组心功能改善，1周时缺氧培养基组效果最明显，而4周后缺氧MSCs组效果明显。组织病理发现细胞移植组心梗区心肌数目增加，胶原形成明显减少，血管周围胶原沉积减少，血管密度上调，心梗区可见Brdu阳性细胞。[结论]：缺氧预处理骨髓干细胞能改善心功能，改善心梗后心室重构，部分机制可能为旁分泌作用和促进血管生成作用。