关键词： 骨髓间充质干细胞   白介素-12   干扰素-α   真核载体pcDNA3.1   肾癌治疗  

摘要： 背景：肾癌为我国第二位泌尿系肿瘤，大约占成年人恶性肿瘤的2％-3％。肾癌早期多无临床症状，近一半的肾癌患者首次就诊时即已属晚期。肾癌对放疗、化疗及激素治疗均不敏感，预后不良。随着肿瘤细胞学的迅猛发展，生物反应调节剂，尤其白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-α等的广泛使用使肾癌的预后有了改观。　　 IL-12是由40kD和35kD两个亚基组成的异二聚体，主要由B淋巴细胞、巨噬细胞及树突状细胞等活化的抗原提呈细胞产生的糖蛋白类细胞因子。作为T细胞的生长因子，IL-12能促进Th1介导的CD4+细胞的分化与增殖，控制细胞免疫调节反应;促进T淋巴细胞、NK细胞的发育与增殖，并刺激这些细胞产生IFN-γ;促进NK细胞和细胞毒淋巴细胞的活化;以及抗新生血管形成等多种生物学效应。大量实验已证实IL-12可以对抗肿瘤的生长和转移，然而其抗肿瘤活性需要在较大剂量水平上才能发挥，且往往伴随严重的毒副作用，常引起机体的骨髓造血功能的抑制、肝毒性、脾肿大、肺水肿甚至死亡等副作用，难以在临床上推广应用。若能寻求一种将IL-12基因局限于肿瘤所在部位表达并激发其免疫生物学活性，剂量低毒副作用少而疗效高又持久的途径，无疑会给肾癌治疗带来希望。　　 间充质干细胞(Mesenchyinal Stem Cells，MSCs)是主要存在于成年人骨髓中的一种具有多向分化潜能和很强增殖能力的成体干细胞，在组织损伤修复和器官功能重建等领域已有广泛的研究和应用。近年学者证实注射入循环系统中的骨髓前体细胞能够优先地迁移聚集到肿瘤微环境中。骨髓间充质干细胞向肿瘤趋向迁移的机制目前不是十分清楚，可能的机制：(1)MSCs具有多向分化的潜能，可分化成各种基质成分，当机体的局部稳态平衡打破时(如肿瘤、损伤等)，使局部的组织细胞更新修复加快，从而需要更多的前体细胞迁移到局部参与组织修复。(2)肿瘤微环境中的趋化因子、细胞因子诱导MSCs向肿瘤细胞微环境趋向和迁移。MSCs表达趋化因子受体CXCR4、CX3CR1、CXCR6、CCR1、CCR7等，可分别与相应的趋化因子CXCL12、CX3CL1、CXCL16、CCL3、CCL19等发生反应而诱导MSCs的趋向与迁移。目前认为调控MSCs趋向迁移最重要的趋化因子是基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，CXCL12或SDF-1)。　　 近来人们已逐渐地认识到MSCs拥有许多独特的生物学特征包括：低表达或不表达MHC和共刺激分子，免疫原性弱，同种异体或异种移植几乎不被排斥;繁盛的自我更新与分化潜能;以及有病灶定向迁移，如经静脉输注的MSCs能特异性地聚集于新生组织，如伤口和肿瘤等，从而逐渐显露其具有作为抗肿瘤基因治疗载体的优越性。因此，MSCs以其自身的特点和优势已成为基因疗法中的合适的细胞载体。　　 总之，作为一种新颖的治疗策略，利用MSCs的生物学特性，通过导入目的基因，将细胞工程与基因治疗完美结合，MSCs负载的基因使活性生物分子具有靶向性，能于肿瘤局部有效地表达并抑制肿瘤生成，不伴有明显的副作用，毒性或排斥反应，达到高效能又低毒性的防治肿瘤目标，为肾癌的治疗提供了新的理论基础和新的思路。　　 目的：　　 ***的分离、纯化、培养、鉴定及生物学特性研究。　　 2.构建高效分泌IL-12的双亚基共表达质粒pcDNA3.1(+)/rhIL-12。　　 3.利用脂质体法将质粒pcDNA3.1(+)/rhIL-12转染至hMSCs，构建hMSCs-IL-12，并在培养液中获得高效、稳定的表达IL-12。　　 4.体内、外实验检测hMSCs-IL-12对肾癌的抗肿瘤治疗作用，初步探讨hMSCs-IL-12的抗肾肿瘤机制，为hMSCs-IL-12应用于肾肿瘤的治疗提供实验依据。　　 内容：　　 ***的分离、纯化、培养、鉴定及体内标记实验：健康志愿者骨髓穿刺获取骨髓液，联合应用密度梯度离心法及贴壁筛选法，来分离、纯化hMSCs。绘制hMSCs的生长曲线，流式细胞仪进行hMSCs鉴定，hMSCs诱导成骨、成脂肪、成软骨等多向分化特性观察。裸鼠皮下注射hMSCs检测成瘤性。用DAPI体外标记hMSCs，将DAPI-hMSCs悬液注射荷瘤鼠体内，注射结束后的10天取肿瘤部位组织、肝脏、肺脏、脾脏等脏器组织，分别做冰冻切片和石蜡切片，荧光显微镜观察DAPI阳性细胞(DAPI-hMSCs)在肿瘤和各脏器组织中的分布。　　 2.双亚基共表达质粒pcDNA3.1(+)/rhIL-12的构建与鉴定：含hIL-12 p35和p40亚单位编码序列的质粒为模板，进行常规PCR。以其为模板进行over-lap PCR，获得rhIL-12融合基因片段。插入pGEM-T中间载体，KpnⅠ和X

关键词： 间充质干细胞   骨髓   内皮抑素   胶质瘤   基因  

摘要： 脑胶质瘤是目前神经外科治疗中最棘手的难治性肿瘤之一,由于其恶性度高、生长快、病程短,侵袭性强,手术完全切除困难,死亡率高,严重威胁人类健康。 目前,脑胶质瘤的基本治疗手段还是手术切除加放疗和化疗,尽管术后辅以积极的放、化疗,但术后仍然很快复发。近年来,免疫治疗、抗血管生成及基因治疗等新的治疗手段的兴起,为胶质瘤的治疗带来了希望。 采用基因转导系统将抑制血管生成基因转染肿瘤细胞或载体细胞并使其长时间、高效表达,抑制血管和肿瘤生长,是胶质瘤治疗的新策略。本研究采用了具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞联合抑制血管生成基因-内皮抑素基因治疗大鼠脑胶质瘤,以观察其联合治疗效果。 从大鼠骨髓中分离、提取出MSCs,进行原代及传代培养,通过加入成骨、成脂及成神经诱导剂,对MSCs进行了体外的分化培养,成功的向成骨细胞、成脂细胞、神经元样细胞方向转化,证实了其多向分化潜能;在成功的构建重组真核表达质粒pcDNA3-Endo并建立pcDNA3-Endo稳定转染MSCs体系后,将pcDNA3-Endo-MSCs以立体定向方式注射大鼠胶质瘤脑内模型进行治疗,并设立多组对照;从治疗后的大鼠生存期、各时段肿瘤体积、各时段病理切片、透射电镜、肿瘤坏死率和血管计数等检测结果显示,pcDNA3-Endo-MSCs组治疗效果明显好于其它各对照组,证实了endostatin基因联合MSCs治疗胶质瘤比单一应用endostatin基因和单独使用MSCs更加有效。 本实验利用了内皮抑素强烈抑制血管生成以及MSCs的多向分化潜能和良好的组织修复能力等特性来治疗胶质瘤,并取得了良好的效果,为今后将这一技术手段应用于临床奠定了基础。

关键词： 周围神经缺损   骨髓间充质干细胞   神经营养素-3   轴突再生   生物学效应  

摘要： 尽管周围神经的再生能力比中枢神经系统要强得多，周围神经损伤的病人要获得完全的功能恢复依然是十分困难的，尤其是由于运动神经元的再生能力差以及所占支配肌肉不可逆的萎缩、纤维化，运动功能的恢复极不理想。功能性的恢复依赖于多种因素，包括损伤的部位、损伤的严重程度、患者的年龄等等。各种细胞因子在周围神经的再生过程中起着重要作用，比如它们操控着细胞的存活、迁徙、增殖以及各种细胞的分化。因此，近些年来，与细胞因子相关的各种治疗手段受到了越来越多的关注。神经营养因子(neurotrophic factor)能够促进轴突的再生，它们包括：nerve growth factor(NGF)，brain-derived neurotrophicfactor(BDNF)，neurotrophin-3(NT-3)and neurotrophin-4/5(NT-4/5)，insulin-likegrowth factors(IGF-Ⅰ and IGF-Ⅱ)，ciliary neurotrophic factor(CNTF)，basicfibroblast growth factor(FGF-2)and glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF).在神经元的发生、发育和再生的过程中，多种神经营养因子参与其中，而不是单个神经营养因子的单独作用。因此在治疗周围神经损伤的过程中，也应当运用多种神经营养因子来达到治疗目的，特别是分属不同家族以及有着不同的治疗机制的神经营养因子。　　 神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)是由774个氨基酸残基组成的、与神经结构和功能密切相关的家族蛋白。NT-3与TrkC相结合发挥其生物学效应。调控着神经元的发育、生长、分化和生存，维持神经系统正常的功能。NT-3是神经生长因子家族的成员之一，NT-3的神经营养作用表现为维持神经干细胞(neuralstem cells，NSCs)存活，促进其增殖和分化;维持周围神经系统的感觉神经元和交感神经元及中枢神经系统的运动神经元的存活。胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor GDNF)是强大运动神经元营养因子，属于转化生长因子-β(transforming growth factorβ TGF-β)超家族的成员。与NT-3不同，GDNF与GDNF-family receptor-1(GFR-1)相结合，通过复杂的组合系统发挥其生物学效应。　　 本课题将骨髓间充质干细胞Mesenchymal stem cells(MSCs)作为种子细胞，以Lentivirus介导的神经营养因子(NT3，GDNF)分别转染至骨髓间充质干细胞，并结合细胞外基质凝胶构建神经移植复合体共同移植入兔人为造成的20mm坐骨神经缺损处，结果显示组合应用NT3和GDNF对比单个神经营养因子，有较强的促进周围神经损伤再生作用。　　 另一方面，细胞移植是治疗神经缺损的一种重要方法，最常用的细胞是Schwann细胞，但是自体的Schwann细胞很难扩增到足够的数量去移植。MSCs因取材简便，可以在体外大量扩增，日益受到重视。在体外适当的条件下，MSCs可以被诱导成Schwann样细胞，并用它移植修复大鼠的坐骨神经损伤获得成功。但一些专家对此提出了疑问，经化学药物处理后转分化的MSCs虽然表达了Schwann细胞的标志物，但并不代表其拥有Schwann细胞的功能[7，8]。　　 其他专家的研究结果表明，在脱髓鞘的动物模型中，将MSCs直接移植到局部或者通过静脉移植，都可以在脱髓鞘的部位发现MSCs，并且这些标记的MSCs参与了髓鞘形成，分化成为了髓鞘形成细胞[9，10]。由此我们设想神经元在MSCs的转分化过程中起到了重要的作用，并且这种诱导不同于化学药物刺激，是一种生物学的诱导方法。　　 本课题将MSCs与背根神经元dorsal root ganglionneuros(DGR)共培养，建立了一种生物学的诱导方法。共培养一段时间，MSCs开始表达Schwann细胞的标志物(GFAP和S100)，随着时间的延长，MSCs开始包绕着轴突形成鞘膜，并且表达了形成髓鞘的标志物MBP。结果显示生物学诱导的MSCs来源的Schwann样细胞具有一定的Schwann细胞功能。

关键词： 间充质干细胞   类风湿关节炎   免疫调节   治疗   细胞培养  

摘要： 类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种高度致残的自身免疫性疾病,是我国造成劳动力丧失和致残的主要病因之一。RA目前尚无根治的方法,临床上所用药物仪能够在一定范围和程度上改善症状、延缓病情进展,且这些药物的副作用较大。另外,迄今为止的研究认为,RA造成的关节滑膜和软骨的破坏是不可逆转的,药物治疗无效,后期关节变形只能借助外科手术矫正。所以目前临床上急需寻找一种有效控制甚至根治类风湿关节炎的方法。 骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)是一种具有高度自我增殖能力和多向分化潜能的干细胞。研究表明它具有免疫调节特性,MSCs在维持机体免疫平衡耐受、移植免疫耐受、自身免疫和肿瘤免疫逃逸以及胎-母免疫耐受方面都起到了一个重要作用。MSCs可以作用于T、B淋巴细胞,NK细胞,DC细胞等参与机体免疫调节。另外组织修复是MCSs又一个重要的特性,它参与多种组织的再生和修复。MSCs是一种基质千细胞,在特定的诱导条件下可以分化成多系组织细胞,同时MSCs可以分泌多种基质分子,改善局部受损环境加速损伤修复。近几年临床上MSCs在免疫方面的特性和免疫调节作用越来越受到关注,并有望成为治疗免疫性疾病的工具。所以利用骨髓间充质干细胞定向趋化、调节免疫、促血管和软骨修复等作用有可能为治疗类风湿关节炎找到新的出路。因此,MSCs是否可以治疗RA,以及其治疗机制值得深入研究。本文主要在MSCs治疗类风湿关节炎方面进行了一部分相关的研究。为临床上利用MSCs治疗RA提供可靠的实验基础和理论依据。 本文的第一部分主要是骨髓间充质干细胞调节类风湿关节炎患者免疫机制的体外研究。体外实验中我们采集了类风湿关节炎患者的骨髓标本,分离、培养和扩增了RA患者骨髓间充质干细胞,观察了原代和传代的类风湿关节炎患者骨髓间充质千细胞的细胞形态,体外增殖能力、集落形成状况、细胞表面标记、以及电镜超微结构等一般生物学特性;另外在体外实验中我们将MSCs与RA患者T,B淋巴细胞共培养,观察了不同比例状态下MSCs共培养对RA患者T,B淋巴细胞的增殖,活化和功能成熟以及对其免疫调节和产生细胞因子等的影响。实验结果显示,来自RA患者的MSCs呈典型的成纤维样细胞形态、表型鉴定CD45阴性,SH2(CD105)、CD71、CD44均阳性,其增殖能力和CFU-F集落形成状况、以及电镜超微结构等方面都与来源于健康对照组的MSCs无明显差异;MSCs与RA患者T、B淋巴细胞共培养研究发现,正常骨髓来源的MSCs对PHA和SAC刺激的RA患者T、B淋巴细胞的增殖均有抑制作用,并且这种抑制作用与BM-MSC的剂量呈依赖性;MSCs可以阻止T细胞进入细胞增殖周期;MSCs可以明显抑制活化的RA患者T淋巴细胞凋亡;但是MSC能促进B细胞功能成熟,分泌IgG增加。结果提示MSCs在多个环节对T,B淋巴细胞有免疫调节作用,并且上述的免疫调节作用不受MHC的限制。在MSCs对细胞因子产生影响的研究中,我们分别用ELASA方法检测了MSCs与RA患者淋巴细胞共培养上清液中IL-1、TNF-a、TGF-β1的含量,同时用RT-PCR检测了细胞内IL-1、TNF-a、TGF-β1的基因表达。我们看到MSCs与患者淋巴细胞共培养时可以影响IL-1、TNF-a及TGF-β1等细胞因子的产生和表达。 在第二部分的研究中,我们利用动物实验主要探讨了在机体内环境下,MSCs对类风湿关节炎大鼠模型的免疫紊乱调节和关节滑膜、软骨损伤的修复效应,以及MSCs治疗类风湿关节炎的可行性、作用机制和治疗途径。我们将体外培养扩增后的MSCs经Brdu标记后从实验动物尾静脉注入,对模型大鼠进行异基因MSCs移植治疗。观察了治疗前后实验动物一般状况和关节肿胀的变化,同时从整体角度,动态观察了MSCs治疗前后实验动物外周血象变化;血清中IL-1、TNF-a及TGF-β1等细胞因子的变化,从局部角度观察了MSCs在受损关节局部滑膜、软骨区的趋化和聚集,以及对受损关节局部滑膜、软骨破坏的保护和修复作用。实验结果提示异基因MSCs移植治疗方法是安全的,并可有效改善RA实验动物的关节肿胀症状。经局部关节滑膜、软骨组织病理切片,BrdU和OPG(骨保护素)免疫组化结果显示,在受损关节滑膜、血管内膜及软骨中均可见大量棕黄色颗粒的BrdU阳性细胞,而正常关节滑膜处棕黄色颗粒出现BrdU阳性细胞数相对较少,同时MSC治疗组关节滑膜中OPG阳性率增加。说明经外周静脉输入的MSCs可集中趋化到实验动物炎症损伤部位,阻止局部组织损伤。并对模型鼠机体免疫紊乱状态起调节作用。MSCs在类风湿关节炎大鼠模型移植治疗有效的研究结果,为利用MSCs的免疫调节和损伤修复特性治疗类风湿关节炎的临床应用提供了有价值的实验基础。 在

关键词： 糖尿病/外科学   骨髓细胞   间质干细胞   细胞分化   综述[文献类型]   人类  

摘要： 糖尿病已成为严重危害人类健康的疾病之一。目前,移植胰岛治疗糖尿病已初见疗效,但由于胰岛来源匮乏和免疫排异反应而受阻,离广泛临床应用还有一定的距离。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCS)取材方便,容易进行体外分离、培养和纯化,且具有跨越分化潜能,可望解决细胞来源和免疫排异问题。本文通过回顾最近的文献,根据BM-MSCS定向诱导分化、自体移植和联合移植三种方法总结了这方面的进展。[第一段]

关键词： 骨髓间充质干细胞   肝纤维化   细胞替代治疗   基因治疗  

摘要： 骨髓间充质干细胞是一种多能干细胞,具有分化成肝细胞的潜力.近年研究表明,骨髓间充质干细胞还具有很强的抗肝纤维化的作用,并且不发生同种异体移植排斥反应,这为肝纤维化、肝硬化的治疗带来了新的策略.

关键词： 人骨髓间充质干细胞   重组逆转录病毒载体   糖尿病模型   干细胞移植  

摘要： 目的通过基因转染构建分泌胰岛素的人骨髓间充质干细胞(IPhMSCs);移植IPhMSCs治疗大鼠糖尿病。方法将人胰岛素基因插入逆转录病毒载体pLNCX的多克隆位点中,构建重组表达载体pLNCX/hIns,经包装细胞PT67包装后转染人骨髓间充质干细胞(hMSCs),经G418筛选出阳性克隆后培养,获得IPhMSCs。将IPhMSCs移植到链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠肾包膜下观察疗效。结果重组表达载体pLNCX/hIns转染hMSCs后,人胰岛素基因在hMSCs中稳定表达3周以上,但IPhMSCs体外葡萄糖刺激释放试验阴性。糖尿病大鼠在移植IPhMSCs后,血糖水平下降(P<0.05),体内胰岛素水平上升,体质量增加,糖尿病症状改善,生存时间延长,腹腔糖耐量试验(IPGTT)接近正常水平。结论通过基因工程技术可使外源性胰岛素基因在hMSCs中有效表达;构建的IPhMSCs能够降低糖尿病大鼠血糖,改善症状,延长生存时间。

关键词： 骨髓间充质干细胞   心室颤动   心跳骤停   心肺复苏   心肌梗死   射血分数   心功能  

摘要： 【目的】探索大鼠心肌梗死并经骨髓间充质干细胞(MSC)治疗后,心功能的变化及对其后进行的心肺复苏结果的影响。【方法】18只雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为两组,MSC注射组和磷酸缓冲液(PBS)注射组,每组9只大鼠。先开胸结扎左前降支冠状动脉,4周后再次开胸接受PKH26荧光标记的悬浮在PBS中的5×106MSC或仅用PBS梗死部位注射治疗,注射后2周及4周用超声心动图测量射血分数,4周时诱导心室颤动及进行心肺复苏,测量心肺复苏前及心肺复苏后4 h内的血液动力学参数的变化。并在心肺复苏72 h后取心肌组织进行病理切片检查。【结果】与注射磷酸缓冲液相比,注射MSC 2周(67%±4%vs 56%±5%,P<0.001)及4周后(67%±6%vs 53±13%,P<0.01)射血分数明显提高,心肺复苏前后的血液动力学参数包括心脏指数、dp/dt40、-dp/dt、左心室舒张末期压明显改善;虽然2组的复苏成功率没有明显区别,但72 h生存率2组比较有明显差异(58.6±20.6 vs 26.1±21.6,P<0.05)。心肌组织病理切片发现有大量的PKH26标记的细胞存在。【结论】心肌梗死后MSC治疗能明显改善心功能,同时也能明显改善心肺复苏前后的血流动力学参数及72 h生存时间。

关键词： 胰岛素   糖尿病   胰岛素依赖型   基因疗法   骨髓间充质干细胞   干细胞移植  

摘要： 目的观察转人胰岛素基因的小鼠骨髓间充质干细胞(mMSCs)植入1型糖尿病小鼠肝脏对糖尿病的治疗作用。方法分离绿色荧光蛋白(GFP)mMSCs,构建人胰岛素逆转录病毒载体,转染干细胞并移植到糖尿病小鼠肝脏。检测小鼠体重、血糖、血清胰岛素水平变化并作组织学分析。结果治疗组糖尿病小鼠6周内体重增加6%;血糖值在移植后7、42d 分别为(10.4±2.8)mmol/L和(6.5±0.9)mmol/L,未经移植患病小鼠分别为(26.8±2.5)mmol/L 和(25.4±4.1)mmol/L,二组间差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组小鼠血清及肝脏中检测到人胰岛素分泌。结论肝内移植表达外源性胰岛素的 mMSCs 能有效降低糖尿病小鼠的血糖水平,缓解糖尿病症状,是一种糖尿病基因治疗的新途径。

关键词： 骨髓干细胞   间充质干细胞   造血干细胞   脑缺血   综述文献  

摘要： 学术背景:近年来研究发现骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,在缺血性脑卒中、脑损伤等疾病中可替代神经细胞,并具有修复神经系统的功能。目的:缺血性脑血管病的发病机制复杂,骨髓间充质干细胞作为神经干细胞的来源,深入认识其在治疗缺血性脑血管疾病中的作用。检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库和Highware数据库2002-01/2007-05的相关文献,检索词"Mesenchymal stem cells(MSCs),cerebral ischemia",并限定文章语言种类为English。共检索到119篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①涉及骨髓间充质干细胞的特点。②与骨髓间充质干细胞在缺血性脑血管病或脑卒中的研究进展相关。排除标准:①重复研究。②Meta分析。文献评价:文献的来源主要是通过对骨髓间充质干细胞的特点及其在缺血性脑血管病或脑卒中的应用进行汇总分析。所选用的36篇文献中,17篇为综述,其余均为临床或基础实验研究。资料综合:①骨髓间充质干细胞具有跨胚层分化潜能,可在中枢神经系统内存活并能分化为神经样细胞,在体外也可通过诱导向神经细胞转化,②骨髓间充质干细胞取材方便、体外扩增迅速,且能以多种途径移植包括静脉移植、脑内移植,对脑缺血、脑外伤等疾病的神经功能的缺损有改善作用。③目前尚存在如何提高骨髓间充质干细胞向有功能的神经细胞转化,如何提高其在体内的成活率和向神经细胞定向分化的能力,移植时机、移植途径及移植安全性,寻找和鉴定骨髓间充质干细胞所特有的细胞表面标志分子,明确其移植后改善缺血性脑损伤功能的机制等问题。结论:骨髓间充质干细胞能在体内外分化为神经细胞,易获得、增殖快,能够进行自体移植,为缺血性脑血管病的治疗开辟了一条新的技术平台,在中枢神经系统损伤修复领域的临床应用前景广阔。