关键词：
间充质干细胞
腺相关病毒
BMP-7
IgA肾病
细胞移植
摘要：
背景和目的:
IgA肾病（IgA nephropathy,IgAN）是以反复发作性肉眼或镜下血尿,肾小球系膜细胞增生,基质增多,球囊基底膜变形、裂解伴广泛IgA沉积为特点的原发性肾小球疾病,是我国慢性肾小球肾炎中最常见的一种类型,约25%的患者在确诊IgAN后5年25年内发展为终末期肾脏疾病（end stage renal disease,ESRD）。迄今为止,本病尚无满意的治疗方案,治疗仍定位在糖皮质激素、环磷酰胺、雷公藤多甙、ACEI等非特异性治疗上,因此研究新的抑制IgA沉积,促进肾小球功能恢复的治疗方法是迫切需要解决的问题。近几年研究结果提示骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）移植可能是一种很有潜力的治疗肾病疾病的方法。BMSCs是存在于骨髓中的一类成体干细胞,具有易获得、易培养、可以跨胚层分化、能在宿主体内长期存活、易于携带外源基因和长期表达等优点。目前研究发现BMSCs具有向肾脏实质细胞分化的潜能,可以参与肾脏损伤后的再生和修复,具有保护肾脏,改善肾功能的作用。
骨形态发生蛋白-7（bone morphogenetic protein-7,BMP-7）是TGF-β超家族成员之一,不仅能促进胚胎后肾间质细胞向上皮细胞转分化,而且还可诱导系膜细胞、上皮细胞、内皮细胞的分化和发育,拮抗TGF-β对系膜细胞的刺激作用,减少系膜基质的增多,具有抗炎、抗纤维化等特点,在维持正常肾脏功能,抑制肾小球和肾间质纤维化中具有重要作用。
因此,本研究以骨髓间充质干细胞移植能否应用于IgA肾病的治疗以及BMP-7基因修饰的BMSCs移植是否更有治疗潜力为研究目的,建立IgA肾病模型,选择BMP-7作为治疗基因,GFP作为报告基因,将携带GFP或BMP-7基因的BMSCs移植入IgAN鼠体内,观察BMSCs在肾脏的分布、分化及改善肾功能的情况,观察和评价BMP-7基因修饰的BMSCs移植是否更有利于肾功能恢复,为探讨IgA肾病新的治疗手段提供实验基础。
方法:
1.用密度梯度离心和贴壁培养相结合的方法分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪和免疫细胞化学方法对细胞表型进行鉴定,同时对培养细胞进行成骨、成脂诱导分化,采用碱性磷酸酶、茜素红及油红O染色观察BMSCs诱导分化情况。
2.采用分子克隆技术,构建重组质粒pAAV-BMP-7。采用磷酸钙沉淀法,重组质粒或pAAV-GFP与pAAV-RC、pHelper共转染HEK-293细胞,产生具有传染性的病毒颗粒。将此病毒颗粒转染骨髓间充质干细胞,用免疫细胞化学方法及荧光显微镜观察BMSCs表达BMP-7及GFP的情况。
3.建立小鼠IgA肾病模型,随机分为模型组,GFP移植组及BMP-7移植组。将转染GFP或BMP-7基因的骨髓间充质干细胞通过尾静脉移植入IgA肾病鼠体内,分别于移植后第7d、21d、56d处死小鼠,采用免疫组化和激光扫描共聚焦显微镜观察BMSCs在肾脏的分布情况,激光扫描共聚焦显微镜观察GFP阳性的BMSCs表达desmin及CD31情况;采用Western blot方法观察BMP-7基因修饰的BMSCs移植后肾脏是否有更多的BMP-7蛋白表达;通过血液、尿液生化及病理切片分析BMSCs移植后肾脏恢复情况,以及携带BMP-7基因的BMSCs移植是否比单纯BMSCs移植更有利于IgA肾病肾功能的恢复。
结果:
1.小鼠原代骨髓间充质干细胞呈集落样生长,细胞形态呈梭形,传代后细胞生长迅速,形态比较均一,大部分细胞为成纤维样或多角形;流式细胞仪检测结果显示,细胞强表达CD29、CD44、CD90、CD166,不表达CD34、CD45;免疫细胞化学染色结果显示BMSCs明显表达vimentin（间充质细胞标志蛋白）,不表达E-cadherin（上皮细胞标志蛋白）;BMSCs在特定诱导条件下可以向成骨细胞、脂肪细胞分化,在加入成骨诱导培养基第14d,细胞碱性磷酸酶染色阳性,随着时间的延长,可见圆形或卵圆形矿化结节,茜素红染色呈红色;加入成脂肪诱导培养基2w后,细胞内可见多个折光性强的圆形脂肪滴,油红O染色呈红色。
2.重组腺相关病毒rAAV-GFP和rAAV-BMP-7被成功包装和产生,经纯化后滴度达到3-4×1010IU/ml以上;转染BMSCs后,经荧光显微镜及免疫组化观察证实了GFP或BMP-7在BMSCs中的表达,转染率在70%左右。
3.使用饮食BSA和注射细菌毒素SEB复合造模的方法,建立了小鼠IgA肾病模型,表现为出现蛋白尿,免疫荧光显示肾小球系膜区有线状或团块状IgA免疫复合物沉积,肾脏病理可见肾小
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