关键词： 佐剂性关节炎   骨髓间充质子细胞疗法   免疫机制   疗效评价  

摘要： 类风湿关节炎(Rheurmatoid arthritis，RA)是一种慢性进行性的自身免疫性疾病，后期出现骨功能障碍。传统治疗方法以非甾体类抗炎药及免疫抑制药物治疗为主，但并不能改变疾病的进展，不能防止关节的破坏。近年来发现骨髓间充质干细胞(Marrow mesenchymal stem cell s，MSCs)具有低免疫原性和免疫调节作用，并且已经在多种自身免疫性疾病的动物模型中应用，例如系统性红斑狼疮等。本研究采用免疫病理改变与RA类似的佐剂性关节炎(Adjuvantarthritis，AA)大鼠模型，观察MSCs治疗的效果，并探讨其发挥治疗作用的免疫机制，为今后临床使用MSCs治疗RA提供实验理论依据。　　目的:探讨骨髓间充质干细胞和培养上清液对大鼠佐剂性关节炎干预、治疗后的疗效及免疫作用改变。　　方法:取SD(Sprague-Dawley rat)大鼠的股骨和胫骨骨髓，经贴壁筛选法体外分离、培养并纯化MSCs。流式细胞术检测CD71、CD29、CD34和CD45表达并进行鉴定。设模型组（A组）、正常组（B组）、培养液对照组（C组）、MSCs治疗组（D组）、MSCs上清液治疗组（E组）、MSCs干预组（F组）、MSCs上清液干预组（G组）。实验各个阶段，测定每组动物体重及足趾体积。除B组外，其他各组用弗氏完全佐剂(Freund' scomplete adjuvant，CFA)造模。在造模同时，F、G组使用MSCs和培养上清液进行治疗。观察饲养3w后，D组及E组使用MSCs和上清液治疗。C组给予L-DMEM液。上述各组动物饲养观察至第7w，测量各组大鼠的足爪肿胀程度，足爪关节病理及X线骨关节改变，免疫器官脾脏和胸腺大体形态、重量指数。用免疫组化法标记脾脏、胸腺中CD3、CD4和CD8细胞，用Biomias图像分析系统进行灰度值统计学分析，观察治疗前后变化。　　结果:应用贴壁筛选的方法成功分离、培养以及扩增了MSCs，经反复传代纯化的MSCs用流式细胞仪检测CD71、CD29呈阳性表达而CD34、CD45呈阴性表达，符合MSCs的生物学特征。AA大鼠注射弗氏完全佐剂3w后，足爪肿胀，后肢足趾关节X线片可见周围软组织影增厚，骨性关节面模糊不光滑呈锯齿状，滑膜面破坏。MSCs和培养上清液治疗后至实验第7w，原发性关节肿胀和继发性关节肿胀都有明显的被抑制，与模型组相比差异有统计学意义，P＜0.05。周围软组织影增厚减轻，骨性关节面光滑，滑膜细胞少量增生，脾脏胸腺重量指数不同程度的降低。免疫组化检查，从灰度值分析上可见，胸腺中CD3灰度值在模型组为(56.97±1.59)，而MSCs治疗后为(82.26±3.83);脾脏中CD3灰度值在模型组为(63.35±2.54)，而MSCs治疗后为(86.01±0.66)，两者比较差异有统计学意义，显示MSCs降低了AA大鼠胸腺、脾脏中增长的CD3+细胞数量，胸腺中CD4灰度值在模型组为(75.45±5.78)，而MSCs治疗后为(86.90±4.23);脾脏中CD4灰度值在模型组为(74.45±4.73)，而MSCs治疗后为（85.38±3.13），两者比较差异有统计学意义，显示MSCs降低了AA大鼠胸腺、脾脏中增加的CD4+细胞数量。胸腺中CD8灰度值在模型组为(93.94±3.58)，而MSCs治疗后为(75.33±3.29);脾脏中CD8灰度值在模型组为(80.61±4.61)，而MSCs治疗后为(64.32±3.32)，两者比较差异有统计学意义，显示MSCs增加了AA大鼠胸腺、脾脏中减少的CD8+细胞数量。在造膜的同时使用MSCs和培养上清液干预后，动物生长发育基本正常，足趾关节肿胀不明显，关节X线片和病理切片都没有出现明显的关节面破坏和病理改变。　　结论:MSCs及其培养上清液能有效干预大鼠AA的发生及治疗AA的病变，其治疗作用机制是通过有效地调节AA大鼠的免疫功能，使免疫器官发挥正常功能，抵抗炎症对机体的损伤。同时，稳定免疫系统中T细胞亚群的网络平衡，从而调节AA大鼠的细胞免疫，抑制B淋巴细胞产生自身抗体和免疫球蛋白，逐步减轻免疫复合物在关节局部诱发的炎症反应，控制滑膜炎。

关键词： 骨髓间充质干细胞   超顺磁性氧化铁   磁共振成像   糖尿病   移植  

摘要： 研究背景间充质干细胞可自骨髓等多种组织分离得到,近年来,间充质干细胞移植已经成为心血管疾病,神经系统疾病等多种疾病治疗的种子细胞。 研究目的本实验采用磁共振成像(MRI)进行标记细胞的体外示踪及移植细胞的糖尿病体内示踪,探讨不同浓度及时间超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)标记兔骨髓间充质干细胞(MSCs)的标记效率、标记后活力以及标记后体外成像情况,为临床体内MRI寻找最佳标记“浓度——时间”。尝试在常规1.5T磁共振(MR)的成像条件下,对较小动物兔的胰腺、肾脏等器官进行解剖成像和移植细胞的示踪;初步动态观察移植细胞在糖尿病兔体内的活体成像特点及规律,为临床干细胞移植治疗糖尿病疗效评估开创新方法。 研究方法(1)MSCs的培养及鉴定。选择健康家兔,采用密度梯度离心法和贴壁筛选法分离、培养、纯化骨髓MSCs,观察细胞在光镜下的生长特征并记录其生长曲线,Von Kassa方法检测成骨诱导骨髓MSCs,对所获得的细胞进行表面抗原(CD44、CD45和CD71)的检测,确定所获细胞绝大多数为骨髓MSCs。(2)标记细胞的体外成像。配制不同浓度含SPIO的培养基(铁终浓度分别为25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、150μg/ml),加入骨髓MSCs孵育标记。标记后1天、3天、1周、2周、3周、4周行普鲁士蓝染色、细胞活力检测及标记细胞体外MRI,并经MRI确定合适的标记时间和标记浓度。(3)移植细胞糖尿病兔MRI活体示踪。制备兔糖尿病模型,将SPIO标记的骨髓MSCs和未标记的骨髓MSCs经静脉移植入糖尿病兔体内,用测定血糖的方法评价细胞移植前、后对糖尿病高血糖的治疗效果。同时经MR动态观察移植细胞的定位、存活及迁徙。 研究结果(1)骨髓MSCs培养、鉴定:骨髓MSCs呈梭形、漩涡状生长。骨髓MSCs经成骨诱导后表达骨细胞特征。流式细胞仪表面标志鉴定CD45呈阴性,CD44、CD71呈阳性。(2)SPIO可有效标记MSCs,细胞活力检测显示时间为1天和3天时,剂量0μg/ml组与25μg/ml组,0μg/ml组与50μg/ml组,25μg/ml组与50μg/ml组的细胞拒感率没有差别(P＞0.05)。体外MRI示标记3天时,标记浓度为50μg/ml组,T2WI及T2*WI信号降低最明显。(3)建立了兔糖尿病模型,其血糖稳定＞16.8mmol/L。血糖检测显示MSCs移植可有效降低糖尿病血糖升高,MR T2WI、T2*WI序列均可示踪糖尿病兔体内移植SPIO标记骨髓MSCs。MRI可对标记细胞示踪至注射后10天。 研究结论联合采用密度梯度离心和贴壁筛选的方法易于分离、纯化获得纯度较高的MSCs。50μg/ml浓度,标记3天的组合不仅标记效率高,对细胞活力无影响而且细胞体外MRI信号强度降低最明显,为最适标记“浓度——时间”组合。磁标记与未标记的骨髓MSCs均能有效治疗糖尿病高血糖。临床型1.5TMR可对糖尿病兔体内标记细胞进行无创性活体示踪,并较长时间地动态观测细胞的存活与迁徙。

关键词： 银杏叶提取物   骨髓间充质干细胞   抗氧化   氧化应激   糖尿病  

摘要： 糖尿病是目前威胁人类健康的主要的慢性病之一。糖尿病发生时,慢性的高糖血症导致机体出现氧化应激,氧化应激是导致糖尿病并发症的主要机制之一。 骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSC)在生理状态下,是支持造血实质细胞的基质细胞,是最幼稚的细胞。最近研究发现,它还具有明显的“可塑性”,即在特定环境下,它不仅可以向骨髓内各种基质细胞分化,还可向全身组织细胞转化。 有研究表明,BMSC可以分化为胰腺细胞,并具有分泌胰岛素的功能。这一研究结果为利用BMSC治疗糖尿病提供了实验依据。然而进行BMSC移植治疗糖尿病时,由于糖尿病发生、发展过程中,胰腺组织局部出现炎症反应,肿瘤坏死因子、白细胞介素6等炎症因子和促凋亡因子分泌增加。机体出现氧化应激,恶劣的生存环境使得应用BMSC治疗糖尿病时存在移植效果不好的问题。为此,本研究利用银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract,GBE)的抗氧化、清除自由基的作用,对糖尿病大鼠进行腹腔注射,为BMSC移植创造良好的生存环境,然后再进行BMSC移植治疗糖尿病,观察GBE联合BMSC治疗糖尿病的效果,为其床应用提供实验依据。 本研究将糖尿病模型大鼠分为糖尿病组(DM)、GBE组、BMSC组、GBE+BMSC组,并设立正常大鼠为对照。结果发现,GBE+BMSC组大鼠的血糖水平显著低于GBE组、BMSC组和DM组(P<0.05),与正常组大鼠的血糖水平没有显著差异(P>0.05);GBE+BMSC组大鼠的胰岛素水平显著高于GBE组、BMSC组和DM组(P<0.05),与正常组大鼠的胰岛素水平没有显著差异(P>0.05)。细胞实验结果表明,GBE在高糖环境下能够有效清除自由基,保护内皮细胞。电镜下观察,加入GBE的高糖环境下的内皮细胞形态完整,线粒体结果完整,线粒体内嵴清晰可见,高糖组内皮细胞死亡较多,线粒体肿胀,线粒体内嵴消失。 本研究结果表明,GBE能够增强BMSC治疗糖尿病作用。

关键词： 骨髓间质干细胞   慢病毒载体   BDNF   脑源性神经营养因子   骨髓间质干细胞   周围神经损伤   辣根过氧化物酶  

摘要： 目的将携带大鼠BDNF基因之慢病毒载体感染大鼠骨髓间质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs),获得有生物活性BDNF修饰的rMSCs(BDNF-rMSCs)。 方法将本实验室已构建好的质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP,在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。提取新鲜骨髓,体外分离rMSCs并培养、鉴定。浓缩病毒测定滴度后感染2～4代rMSCs,荧光激发及细胞免疫组织化学以鉴定。(本方法是按福建医科大学附一医院神研所张志坚课题组关于BDNF基因修饰的大鼠骨髓间质干细胞构建及鉴定的方法和步骤进行。) 结果三质粒共转染293T细胞后荧光激发可见大量绿色荧光。收集、浓缩病毒后测定滴度为6.5×107 TU/ mL,提取的病毒经PCR证实BDNF基因已成功插入。病毒感染rMSCs后荧光激发可见绿色荧光,细胞免疫组织化学检测有BDNF蛋白表达。 结论成功获得BDNF-rMSCs基因工程干细胞,该细胞可大量表达BDNF蛋白,为下一步BDNF-rMSCs移植治疗坐骨神经损伤奠定了基础。 目的观察植入脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞后坐骨神经损伤大鼠神经纤维的再生及运动功能的恢复情况。 方法180只成年F344大鼠,采用钳夹法制作成右坐骨神经损伤模型,随机分为磷酸盐缓冲液组(PBS组),骨髓间质干细胞组(空载体-rMSCs组),脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞组(BDNF-rMSCs组)。各组在损伤处分别注射磷酸盐缓冲液2μL,骨髓间质干细胞混悬液2μL和脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞混悬液2μL。在移植术后2,4周,通过辣根过氧化物酶示踪观察损伤侧L4,5脊髓前角存活的神经细胞数目,通过测量坐骨神经功能指数值观察大鼠损伤侧肢体运动功能恢复情况,同时应用荧光激发及免疫组化技术检测骨髓间质干细胞存活和脑源性神经营养因子表达情况。 结果BDNF-rMSCs组损伤侧L4,5脊髓前角细胞的存活数目多于PBS组,空载体-rMSCs组,并且神经功能恢复也比这两组好。空载体-rMSCs组,BDNF-rMSCs组可观察到神经损伤处有较多的骨髓间质干细胞存活,并且BDNF-rMSCs组脑源性神经营养因子表达明显比空载体-rMSCs组多。 结论:脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞移植对周围神经损伤后神经功能恢复有促进作用。

关键词： 充血性心力衰竭   干细胞治疗   骨髓间充质   心肌细胞功能   细胞数量   临床综合征   疾病发展   心室重塑  

摘要： 充血性心力衰竭是各种心血管疾病发展最终的一种临床综合征，其发病与有功能的心肌细胞数量减少和进行性心室重塑有关。尽管目前有研究表明心肌细胞可发生有丝分裂，但发生分裂增生的细胞数量少，不能代偿坏死和凋亡的心肌细胞功能。

关键词： 骨髓间充质干细胞   骨性关节炎   早期   兔  

摘要： 目的:用骨髓间充质干细胞(BMSCs)治疗兔早期骨性关节炎(OA),探讨其可行性及疗效评价。方法:将72只新西兰大白兔随机分成对照组、OA组和BMSCs治疗组,每组24只。治疗组在造模后第4周左膝关节腔内注射BMSCs。观察动物的一般情况,TNF-α和IL-1β水平,MRI扫描,取膝关节标本行大体及病理观察并进行Mankin’s评分。结果:与OA组相比,BMSCs治疗组术后步态逐渐好转;血清TNF-α和IL-1β水平降低;MRI示低信号区缩小,关节软骨厚度接近正常,无关节腔积液;大体标本见关节软骨表面趋于平坦完整,有软骨覆盖,但光泽欠佳;病理检查提示有透明样软骨形成,细胞排列整齐,厚薄基本一致,软骨相连。结论:BMSCs关节腔内可成软骨分化,为早期OA患者提供了一种新的有效疗法。

关键词： 骨髓间充质干细胞   治疗   股骨头坏死   实验研究  

摘要： 目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSC)治疗早期股骨头坏死的疗效及机制。方法:60只新西兰大白兔造模后选取其中确诊为股骨头坏死的36只,随机分为3组:对照组:不予以任何处理;单纯减压组和减压+MSC移植组。术后4周及8周各组随机挑选6只兔先行MRI扫描,之后处死动物取股骨头行常规H-E染色及CD34免疫组化染色,用扫描电镜观察超微结构。结果:术后第8周,减压+MSC移植组MRI示低信号区明显缩小,组织病理学及扫描电镜表现空骨陷窝减少,成骨细胞多,新骨形成,空骨陷窝阳性数和微血管密度与单纯减压组和对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:MSC移植能促进兔股骨头坏死的修复。

关键词： 间质干细胞移植   眼疾病   细胞分化  

摘要： 骨髓间充质干细胞是一类具有自我更新能力、高度增殖及多向分化潜能的特殊细胞。其“可塑性”的特性在组织和器官损伤修复的临床应用中发挥了重要作用。随着不断深入的研究进展，骨髓间充质干细胞的取材方便、增殖迅速及多向分化潜能等特点，使其在损伤修复和组织再生的领域中备受关注。眼科学者对骨髓间充质干细胞的深入研究将会拓展其在眼科应用的前景，为临床治疗眼科疾病提供新的方法。

关键词： 骨髓移植   间质干细胞移植   心肌梗死   CXCR4受体  

摘要： 目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)及CXCR4转基因MSCs(CXCR4-MSCs)治疗心肌梗死(MI)的机制、效果及简单有效的移植方法。方法:将SD大鼠随机分为假手术组、生理盐水组、细胞治疗的MSCs组及CXCR4-MSCs组。生理盐水组及细胞治疗组左冠状动脉前降支结扎60min后再灌注。术后24h,细胞治疗组分别经尾静脉注射2.5×106个DiI标定的体外扩增的MSCs/CXCR4-MSCs。生理盐水组注射1mL生理盐水。分别于术后3d及30d检查移植细胞MI区归巢情况及在MI区生存及分化情况。测定MI区胶原含量、胶原Ⅰ/Ⅲ比率。用超声心动图评估MI30d后各组鼠左心室功能等。结果:CXCR4-MSCs治疗组移植细胞归巢至MI区数目是MSCs治疗组的2.5倍,体外迁移实验中CXCR4-MSCs治疗组细胞向基质细胞衍生因子-1(SDF-1)迁移数目是MSCs治疗组的3.8倍,超声心动图评估MI区室壁变薄及心功能下降均轻于MSCs治疗组,与大体组织形态学改变吻合。细胞治疗组胶原Ⅰ/Ⅲ比率比生理盐水组明显下降75%以上。结论:CXCR4-MSCs恢复了植入的MSCs向梗死心肌的靶向迁移能力,提高了静脉移植MSCs治疗MI的效果。

关键词： 心肌梗死   骨髓间充质干细胞  

摘要： 干细胞移植是目前心肌梗死治疗方法的进展,而骨髓间充质干细胞(BMSCs)是其中有临床应用前景的细胞之一。本文通过介绍BMSCs向心肌样细胞的分化;BMSCs的促血管新生作用;BMSCs对心肌细胞保护和抗凋亡作用;改善心室重构等总结了骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的机制。