关键词： 颅脑创伤   亚低温   骨髓间充质干细胞   干细胞移植   神经运动功能  

摘要： 目的：本研究采用贴壁筛选法分离、培养SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），利用pRNS-1质粒将温度敏感型猿猴病毒40大T抗原基因（temperature sensitive simian virus40 large T antigen gene，tsSV40LTag）转染大鼠BMSCs，获得温度敏感型永生化的BMSCs。观察在不同温度条件下，温度敏感型BMSCs的增殖情况。在亚低温条件下，将其移植至颅脑创伤（traumatic brain injury，TBI）大鼠颅内，观察其对损伤神经功能恢复的影响。　　 方法：（1）大鼠原代。BMSCs的分离、培养：分离新出生10 d内幼鼠的双侧股骨和胫骨，剪开长骨两端骨皮质，露出骨髓腔，用低糖DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，收集细胞悬液，然后接种到塑料培养皿中，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下细胞培养箱中培养。在倒置相差显微镜下观察细胞贴壁生长，至第14天单层贴壁细胞接近90％融合时，按1：2传代。以后随细胞增殖均80％～90％融合时，按1：2持续体外传代培养。（2）大鼠BMSCs表面标志的鉴定：在细胞悬液中，分别加入适量FITC标记CD29、CD31、CD44、CD45、CD90抗体及CD34单克隆抗体进行荧光标记。流式细胞仪进行检测。（3）BMSCs的溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记：取第5代BMSCs以1×105/ml进行细胞爬片，在细胞生长融合前48 h、36 h、24 h、12 h掺入BrdU，使终浓度为10μmol/L，并分别孵育至细胞融合，测定BrdU的最佳标记时间。BrdU标记的BMSCs进行免疫荧光染色。（4）pRNS-1质粒转染BMSCs以及阳性克隆的筛选和扩增：pRNS-1质粒按照脂质体LipoVecTM说明书进行转染，48 h后将细胞移至33℃，用含G418的培养基进行筛选。将筛选后的细胞传代扩增。（5）RT-PCR检测BMSCs中tsSV40LTag的表达：用Trizol试剂提取细胞中的总RNA，按反转录试剂盒说明书将细胞的RNA反转录成cDNA后进行PCR扩增。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果。（6）测定33℃和37℃两种温度下tsSV40LTag-BMSCs生长曲线。（7）实验分组与亚低温治疗：随机将54只成年雄性SD大鼠分为对照组、亚低温治疗组、亚低温+tsSV40LTag-BMSCs移植组。除对照组外所有实验动物接受亚低温治疗，对照组大鼠进行常规处理。（8）制备大鼠液压TBI模型：各实验组大鼠使用液压冲击脑损伤仪制备大鼠中型TBI模型。（9）大鼠颅内移植tsSV40LTag-BMSCs：在亚低温条件下，采用立体定向引导，向移植组大鼠颅内进行多点移植tsSV40LTag-BMSCs。（10）TBI大鼠神经运动功能评分：分别于伤后第1天、7天、14天、21天、28天，由同一位不参与实验分组的评价者在相应日期的同一时间对实验组大鼠进行神经运动功能评分。　　 结果：（1）大鼠原代BMSCs的分离、培养：骨髓细胞悬液接种到塑料培养皿，1 d后可见部分细胞贴壁，此后贴壁细胞不断扩增，第14天细胞汇集成片，进行传代。扩增至第5代时，细胞形状趋于一致，呈梭形。（2）BMSCs表面标志的鉴定：经流式细胞仪检测，体外培养至第5代的细胞表面标志CD29、CD44、CD90呈阳性，CD31、CD34、CD45呈阴性，证实体外培养的细胞为BMSCs。（3）BMSCs的BrdU标记：48 h作为最佳标记时间，细胞标记阳性率>94％。（4）pRNS-1质粒转染BMSCs的筛选结果：筛选14 d后可见转染细胞集落形成，未转染细胞全部死亡。（5）RT-PCR检测tsSV40LTag已转染至BMSCs中。（6）在33℃和37℃两种温度下tsSV40LTag-BMSCs的生长情况：在33℃时，tsSV40LTag-BMSCs生长增殖速度较快，在体外培养条件下可连续传代增殖。37℃时，细胞生长增殖速度明显减慢，甚至停止生长。（7）大鼠液压TBI模型制备结果：各实验组死亡率比较无统计学差异（P>0.05）。（8）TBI大鼠神经运动功能评分结果：大鼠脑创伤后第1天评分无统计学差异（P>0.05），说明创伤模型的神经运动功能障碍程度较一致。伤后第7天、14天、21天、28天，各实验组的神经运动功能评分随时间有上升趋势且亚低温+tsSV40LTag-BMSCs移植组上升更明显，即神经运动功能障碍得到改善，颅脑创伤呈现康复趋势。亚低温治疗组、亚低温+tsSV40LTag-BMSCs移植组的神经运动功能评分均比对照组有明显改善;亚低温+tsSV40LTag-BMSCs移植组的神经运动功能评分比亚低温治疗组有明显改善。说明在亚低温

关键词： 骨髓间充质干细胞   移植   血糖   肾小球肥大   2型糖尿病  

摘要： 目的:探讨移植骨髓来源间充质干细胞治疗经小剂量链脲佐菌素(STZ)加高脂喂养诱导的2型糖尿病高血糖、肾脏病变及胰岛素抵抗的可能性。 方法: 1大鼠MSCs的分离培养和鉴定 1.1无菌条件下取大鼠股骨和胫骨骨髓细胞做原代培养。 1.2流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞CD34、CD44、CD45、CD71、CD105的表达情况。 1.3 Vonkassa和油红O染色分别检测骨髓间充质干细胞成骨、成脂的诱导。 2 2型糖尿病大鼠模型的建立 2.1高脂喂养2月后一次性腹腔注射STZ建立大鼠2型糖尿病模型。 2.2监测大鼠血糖、胰岛素、尿蛋白以确定建模是否成功。 2.3用免疫荧光方法(Insulin抗体)检测胰腺冰冻切片。 3尾静脉注射移植经过BrdU标记的MSCs 3.1用BrdU标记MSCs。 3.2尾静脉注射移植MSCs。 4移植后疗效的检测 4.1监测血糖、总胆固醇、甘油三酯、胰岛素、脂联素及尿白蛋白的变化。 4.2取胰腺、肾脏切片,分别做H-E染色、PAS染色。 4.3胰腺免疫荧光方法检测移植MSCs能在胰腺存在。 4.4肾脏切片免疫荧光方法检测是否有外源MSCs存在。 结果: 1骨髓间充质干细胞培养、鉴定及体外标记:三代骨髓间充质干细胞呈梭形、漩涡状生长。流式细胞仪表面标志鉴定CD34、CD45呈阴性,CD44、CD71、CD105呈阳性,符合骨髓间充质干细胞的生长特性,并成功的用BrdU对其进行了标记。 2骨髓间充质干细胞经成骨、成脂诱导后可表达骨细胞、脂肪细胞特征。 3建立了大鼠糖尿病肾病模型,其血糖值稳定不低于16.7mmol/L,尿白蛋白大于1.9mg/24h。 4免疫荧光检测移植后大鼠体内胰岛素及BrdU标记细胞:STZ胰岛破坏明显,植入骨髓间充质干细胞后胰岛增加;STZ组血清胰岛素维持较高水平,治疗后胰岛素水平有所下降(206.08±3.18pmol/l;193.68±3.06pmol/l),血清脂联素升高(2.02±0.24μg/l;3.57±0.72μg/l),血糖降低(22.51±1.87mmol/l;17.02±1.27 mmol/l),尿白蛋白分泌减少(1.95±0.21mg/24h;1.30±0.15/24h),肾小球平均截面积减少(7.55±0.18μm2×103;5.21±0.45μm2×103),肾小球平均体积缩小(8.12±0.029μm3×105;7.01±0.11μm3×105)。胰腺、肾脏组织中均可见BrdU标记的阳性细胞。(括号中分别为模型组;治疗组) 结论: 经尾静脉注射的骨髓间充质干细胞可定位于2型糖尿病大鼠胰腺及肾脏,并对受损胰腺及肾脏有修复作用,降低血糖,减少尿白蛋白排泄,降低血清胰岛素水平,提高血清脂联素含量,改善胰岛素抵抗。

关键词： 骨髓间充质干细胞   移植部位   链脲霉素   糖尿病   量效关系  

摘要： 目的:探讨移植转胰岛素基因骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)治疗小鼠糖尿病的理想部位及量效关系。 方法: 1.向C57BL/6J小鼠腹腔内注射不同剂量链脲霉素(STZ)制作糖尿病动物模型,观察STZ剂量与糖尿病成模稳定性的关系。2.构建携胰岛素基因的重组逆转录病毒载体(INS-MSCV),转染绿色荧光蛋白(GFP)小鼠的BM-MSCs,经体外扩增后,以5×106个细胞量分别移植到5组(n=5)稳定糖尿病小鼠模型的肝、肾、胰、脾、尾静脉内。根据移植后血糖、体重等指标的变化及移植部位组织切片检查判别最理想的移植部位。3.对10组稳定糖尿病模型鼠(n=5)在最佳移植部位分别给予1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108不同细胞量的转胰岛素基因BM-MSCs移植,观察并分析细胞移植量与移植后血糖浓度的关系。 结果:1.以80-180mg/kg剂量的STZ制模,小鼠糖尿病模型稳定性好,动物造模20d后高血糖状态稳定,成模动物45天生存率>80%。2.肝脏是转胰岛素基因BM-MSCs移植效果最理想的部位,肝内移植组第45日血糖降至6.3±1.2mmol/L,体重增至22.2±0.4g,胰岛素水平升至19.9±1.5μU/ml,与其他部位移植组比较差异有显著意义(P<0.05)。病理学证实移植物在肝脏定植稳定,胰岛素免疫组化染色阳性。3.移植转胰岛素基因BM-MSCs的量与移植后血糖浓度成反相关;当肝内移植细胞量在[5×104,5×108]区间内时,移植后平均血糖浓度(Y)与移植量(X)间的量效方程为:Y=66.574-14.227lgX+ 0.852(lgX)2。 结论:1.80-180mg/kg的STZ剂量是C57BL/6J小鼠行糖尿病制模的理想剂量。2.移植转胰岛素基因BM-MSCs对动物糖尿病有显著的治疗效果,肝脏是移植效果最理想的部位。3.转胰岛素基因BM-MSCs的移植效果在一定范围内随移植量的增多而增强。

关键词： 碱性成纤维细胞生长因子   骨髓间充质干细胞   慢病毒载体   细胞移植   急性心肌梗死  

摘要： 目的:本研究建立大鼠骨髓间充质干细胞(Bone-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)体外分离、培养、传代及诱导分化的实验方法;构建携带促分泌信号肽FGF4碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor, BFGF)和增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的慢病毒载体(Lentivirus vector, LVs);观察FGF4-BFGF&EGFP融合基因重组慢病毒载体修饰BMSCs修复大鼠心肌梗死(Myocardial infarction, MI)的作用及其相关机制,期望为心肌梗死的治疗提供新思路,探索一条新途径。 方法:BMSCs体外分离、培养、传代及诱导分化:取SD大鼠股骨、胫骨,用低糖型DMEM细胞培养基反复冲洗骨髓腔,将冲洗液移入培养瓶培养,以贴壁筛选法分离、培养、传代扩增BMSCs,显微镜观察细胞的形态变化和生长分化情况,并收集第三代(P3)细胞进行流氏细胞仪技术鉴定;以携带EGFP的pGC-FU慢病毒载体系统作为基因转导的媒介,采用In-Fusion技术构建携带促分泌信号肽FGF4的BFGF基因重组慢病毒载体,通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)、酶切和测序的方式鉴定所构建的载体;在脂质体Lipofectamine 2000作用下转染293T细胞,以实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, RT Q-PCR)检测慢病毒滴度,荧光表达、酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)确定最佳感染复数(Multiplicity of infection, MOI)及BFGF蛋白表达分泌水平;采用冠状动脉结扎法建立大鼠心肌梗死模型。120只大鼠随机均分为假手术组(Sham组)、溶剂对照组(Vehic组)、空载慢病毒组(EGFP/BMSCs组)、BFGF重组慢病毒组(BFGF/BMSCs组)和FGF4-BFGF4/BMSCs重组慢病毒组(FGF4-BFGF/BMSCs组),每组24只,按术后3天、7天、14天、28天均分为4个亚组,在心肌梗死模型建立后30-60min,分别以100ul 1×PBS溶液或2×106/只的细胞数散在注入相应实验动物局部心肌组织梗死区。伊红-苏木素(Hematoxylin Eosin, HE)染色观察细胞移植后心肌病理变化;应用激光共聚焦扫描显微镜(Laser scanning confocal microscope, LSCM)观察移植细胞存活及其分化;采用Western-blot检测各实验组大鼠心肌组织梗死区BFGF蛋白表达,免疫组织化学方法(Immunohistochemistry, IHC)检测VIII因子阳性表达;运用Western blot、Real Time Q-PCR分别检测凋亡调控基因BCL-2、BAX mRNA与蛋白表达,原位缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling , TUNEL)检测凋亡指数变化;使用IHC检测MMP-9、TIMP-1蛋白表达;麦松(Masson)染色检测细胞移植后28天心肌组织梗死区胶原纤维改变,并行数字高帧频超声心动图检查,观察心功能状况。 结果:原代培养的BMSCs 24小时内贴壁并伸展成多角形、梭形,前3天为相对抑制期,其后细胞增殖速度逐渐加快,呈对数形式,7天左右至平台期,细胞覆盖率达90%左右,约在2周内传至第3代时可到106个数量级细胞,能够满足细胞移植数量的需要,应用流式细胞仪检测BMSCs的标志,显示CD29、CD44、CD90阳性,而CD34、CD45阴性,符合BMSCs特征;采用In-Fusion技术构建FGF4-BFGF重组慢病毒,经PCR、酶切及测序鉴定完全正确,转染293T细胞能够正确表达,滴度为1×108TU/ml,慢病毒感染BMSCs最佳MOI值为10,且FGF4-BFGF重组慢病毒感染BMSCs能高效表达分泌BFGF。在心肌梗死模型建立后第3、7、14、28日,与Sham组对比,FGF4-BFGF/BMSCs组的心肌组织病理改变均明显轻于其他各组,且在冠脉结扎后第28日存活移植细胞的数量显著高于其他各组(P﹤0.05),但除少许移植细胞与宿主心肌细胞融合外未见明显分化为心肌样细胞的现象。此外,与Vehic组、EGFP/BMSCs组、BFGF/BMSCs组相比,FGF4-BFGF/BMSCs组心肌组织梗死区BFGF、BCL-2、TIMP-1表达上调,BAX、MMP-9水平下降,微血管密度明显

关键词： 骨髓间充质干细胞   自身免疫性重症肌无力   吲哚胺二   三双加氧酶   转移生长因子β   乙酰胆碱受体  

摘要： 目的：通过体内、外实验证实骨髓间充质干细胞(bone mesenchymalstromal ceils，BMSCs)对实验性自身免疫性重症肌无力(Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis，EAMG)的治疗作用并阐述相关机制。　　 方法：1、以含有大鼠来源的AChRa97-116(DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI)多肽片段、弗式不完全佐剂、结核菌素的混合乳剂，尾根部免疫健康Lewis大鼠，建立EAMG实验动物模型。依据Lennon评分法及体重监测，对模型的建立情况予以评定，并设置CFA对照组、EAMG模型组、BMSCs移植治疗组。2、全骨髓贴壁法提取、扩增健康Lewis大鼠胫骨、股骨内的BMSCs，并以EAMG实验动物模型为研究对象，在二次免疫的同时，以同种异体BMSCs 107/只尾静脉移植，依据Lennon评分法及体重监测，初步评定BMSCs尾静脉移植治疗EAMG大鼠模型的效果;同时，H3增殖实验法检测三组大鼠T淋巴细胞的增殖能力，ELISA法检测各组大鼠血清中IL-4、IL-6、IL-17及IFN-γ的含量，流式细胞仪法检测各组大鼠T淋巴细胞中Thl、Th2、Thl7及Treg细胞亚群的分布情况，进一步证实BMSCs尾静脉移植对EAMG模型大鼠的治疗效果;此外，以PKH-67对BMSCs进行膜标记后，以同样的方式移植给EAMG模型大鼠，移植后7天，取大鼠各部分组织制作冰冻切片，荧光显微镜下观察，进行BMSCs示踪。3、免疫磁珠法提取、分离AChR特异性T、B淋巴细胞，并分别以T:BMSCs=10：1,B:BMSCs=1：1的比例进行体外共培养，同时分别以1-甲基-左旋色氨酸(1-methyl-L-tryptophaN,1-MT)、抗转移生长因子-beta (transforming growth factor-β，TGF-β)抗体封闭BMSCs分泌的吲哚胺二、三双加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)和TGF-β，采用H3增殖试验法检测不同处理组T、B细胞的增殖能力，ELISA法检测不同处理组T细胞培养上清中IL-4、IL-6、IL-17及IFN-γ等 细胞因子的表达，B-ELISPOT法检测，BMSCs共培养后AChR特异性B细胞抗体分泌能力的变化，流式细胞仪法检测T细胞分群、B及BMSCs表面标志的表达变化等，从机制上探讨BMSCs对EAMG的治疗效果及可行性。　　 结果：体内实验：1、与CFA对照组相比，EAMG模型组大鼠Th1与th17细胞的比例升高(PTh1<0.001,Pth17<0.001)，Th2、Treg细胞的比例降低(PTh2<0.05，Ptreg<0.01)，而BMSCs移植则降低了Th1、Th17这两种炎性细胞的比例(Pthl<0.05，Pth17<0.05)，而提高了保护性细胞亚群Th2、Treg的比例(PTh2<0.05，Preg<0.05);2、BMSCs移植组大鼠T细胞对AChR多肽片段的增殖活性降低(P<0.01);3、CFA组与EAMG模型组相比较，血清中IFN-γ、IL-17表达量无显著性差异，而IL-4明显高于EAMG组(PIL4<0.001)，IL-6反之(Pu-6<0.01)，BMSCs治疗组大鼠血清中IFN-γ、IL-17、IL-4均明显高于EAMG模型组(PIFN-γ<0.05，PIL-17<0.05，PIL4<0.001);而IL-6则明显降低(PIL-6<0.001);4、以PKH-67绿色荧光标记的BMSCs示踪实验发现，BMSCs向脾、胸腺等淋巴器官趋化。　　 体外共培养实验：1、ELISA结果显示，单纯培养的AChR特异性T淋巴细胞INF-γ、IL-17、IL-6等致病性因子的表达高于BMSCs共培养组(PIFN-γ<0.01,PIL-17<0.05，PIL6<0.05)，IL-4的表达则低于BMSCs共培养组（PIL4<0.01），而流式结果显示，单纯培养的AChR特异性T淋巴细胞Th1、Th17亚群的比例明显高于与BMSCs共培养组(PTh1<0.01,PTh17<0.01)，Th2、Treg细胞亚群的比例则低于BMSCs共培养组(PTh2<0.001,Ptreg<0.001)，而分别以抗TGF-β抗体及1-MT药物拮抗后，能在一定程度上抑制BMSCs的这种免疫调节作用，p值均小于0.05，有统计学意义;2、BMSCs能抑制AChR特异性T、B细胞增殖的能力(PT<0.001, PB<0.01)，而抗TGF-β抗体及1-MT能不同程度地逆转BMSCs的这种抑制作用，p值均小于0.05，有统计学意义。3、此外，BMSCs能降低EAMG-B细胞抗AChR抗体的分泌(P<0.00

关键词： 股骨头坏死   肝细胞生长因子   骨髓间充质干细胞   钻孔减压术  

摘要： 目的:探讨肝细胞生长因子(HGF)修饰的骨髓间充质干细胞(MSCs)对兔股骨头坏死(ONFH)治疗效果。材料与方法:①于兔髂嵴处获取骨髓血,分离获得MSCs并鉴定,传代培养;以重组腺病毒肝细胞生长因子(Ad-HGF)修饰MSCs,观察HGF分泌水平和转染效率。②以Micro-CT、大体测量及组织学等手段观察兔股骨近端骨性解剖特点及骨组织结构,评估兔股骨头钻孔减压可行性;模拟临床手术,于透视下对动物进行经皮股骨头钻孔减压及印度墨水注入,观察墨水弥散情况。③90只动物静脉注射内毒素脂多糖10ug/kg,24h后肌注甲基强的松龙20mg/kg,1次/d,共3d。2周后观察动物体重及血脂变化,存活动物随机分为4组,A组为对照组,B、C、D组于透视下进行经皮股骨头钻孔减压,之后经骨隧道分别注射生理盐水、MSCs悬液、MSCs/Ad-HGF悬液各2mL;术后4周处死动物,观察Micro-CT骨计量学、组织病理学、血管内皮生长因子(VEGF)免疫组化等项目,评估治疗效果。结果:①MSCs在体外可稳定扩增、传代并定向分化,MOI=150的Ad-HGF对MSCs转染率高,转染后细胞可持续分泌HGF12d。②兔股骨近端转子窝较深,股骨颈最薄处直径＞4mm,以2mm克氏针及骨髓穿刺针可有效完成钻孔减压及细胞注入,印度墨水注入后分布较为均匀。③在Micro-CT主要测量参数上,MSCs/Ad-HGF处理组(D组)优于其余3组,在骨陷窝率及骨坏死率方面显著低于其余3组;免疫组化显示MSCs/Ad-HGF处理的标本骨内血管增生活跃。结论:经皮股骨头颈区钻孔减压并注入MSCs/Ad-HGF悬液可增强骨坏死区骨修复和血运重建能力。

关键词： 骨髓间充质干细胞   心肌梗死   移植   途径  

摘要： 目的对比研究经心外膜、冠状动脉及静脉注射三种不同途径移植骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗心肌梗死的效果,探讨MSCs移植的最佳途径。 方法用介入法栓塞冠状动脉左前降支的第二对角支远端建立猪心肌梗死模型,建模成功后将猪随机分为6组,每组5头。4周后进行自体MSCs移植,三个移植组分别经耳缘静脉、冠状动脉、心外膜注射用BrdU标记的MSCs悬液5m(l1×107),每组各设对照组,用同样方法注射DMEM培养液5ml。移植4周后行心脏超声及心脏磁共振检查,评价治疗心肌梗死的效果,组织学检查梗死区心肌形态改变及移植细胞在心肌内的分布情况。 结果与对照组相比,三个移植组左室壁厚度增加、梗死区面积缩小、心功能显著改善(P<0.05),心外膜和冠状动脉移植组各项指标的改善比静脉移植组更明显(P<0.05),而它们两者之间没有差异(P>0.05)。移植组梗死区组织瘢痕化较轻,且均可见BrdU标记阳性的MSCs,心外膜和冠脉移植组中BrdU标记阳性的MSCs要多于静脉移植组。 结论三种途径移植MSCs均能改善心肌梗死后的心功能;心外膜注射和冠状动脉注射的治疗效果比静脉注射更好;冠状动脉注射是MSCs移植治疗心肌梗死的最佳途径。

关键词： 佐剂性关节炎   骨髓间充质子细胞疗法   免疫机制   疗效评价  

摘要： 类风湿关节炎(Rheurmatoid arthritis，RA)是一种慢性进行性的自身免疫性疾病，后期出现骨功能障碍。传统治疗方法以非甾体类抗炎药及免疫抑制药物治疗为主，但并不能改变疾病的进展，不能防止关节的破坏。近年来发现骨髓间充质干细胞(Marrow mesenchymal stem cell s，MSCs)具有低免疫原性和免疫调节作用，并且已经在多种自身免疫性疾病的动物模型中应用，例如系统性红斑狼疮等。本研究采用免疫病理改变与RA类似的佐剂性关节炎(Adjuvantarthritis，AA)大鼠模型，观察MSCs治疗的效果，并探讨其发挥治疗作用的免疫机制，为今后临床使用MSCs治疗RA提供实验理论依据。　　目的:探讨骨髓间充质干细胞和培养上清液对大鼠佐剂性关节炎干预、治疗后的疗效及免疫作用改变。　　方法:取SD(Sprague-Dawley rat)大鼠的股骨和胫骨骨髓，经贴壁筛选法体外分离、培养并纯化MSCs。流式细胞术检测CD71、CD29、CD34和CD45表达并进行鉴定。设模型组（A组）、正常组（B组）、培养液对照组（C组）、MSCs治疗组（D组）、MSCs上清液治疗组（E组）、MSCs干预组（F组）、MSCs上清液干预组（G组）。实验各个阶段，测定每组动物体重及足趾体积。除B组外，其他各组用弗氏完全佐剂(Freund' scomplete adjuvant，CFA)造模。在造模同时，F、G组使用MSCs和培养上清液进行治疗。观察饲养3w后，D组及E组使用MSCs和上清液治疗。C组给予L-DMEM液。上述各组动物饲养观察至第7w，测量各组大鼠的足爪肿胀程度，足爪关节病理及X线骨关节改变，免疫器官脾脏和胸腺大体形态、重量指数。用免疫组化法标记脾脏、胸腺中CD3、CD4和CD8细胞，用Biomias图像分析系统进行灰度值统计学分析，观察治疗前后变化。　　结果:应用贴壁筛选的方法成功分离、培养以及扩增了MSCs，经反复传代纯化的MSCs用流式细胞仪检测CD71、CD29呈阳性表达而CD34、CD45呈阴性表达，符合MSCs的生物学特征。AA大鼠注射弗氏完全佐剂3w后，足爪肿胀，后肢足趾关节X线片可见周围软组织影增厚，骨性关节面模糊不光滑呈锯齿状，滑膜面破坏。MSCs和培养上清液治疗后至实验第7w，原发性关节肿胀和继发性关节肿胀都有明显的被抑制，与模型组相比差异有统计学意义，P＜0.05。周围软组织影增厚减轻，骨性关节面光滑，滑膜细胞少量增生，脾脏胸腺重量指数不同程度的降低。免疫组化检查，从灰度值分析上可见，胸腺中CD3灰度值在模型组为(56.97±1.59)，而MSCs治疗后为(82.26±3.83);脾脏中CD3灰度值在模型组为(63.35±2.54)，而MSCs治疗后为(86.01±0.66)，两者比较差异有统计学意义，显示MSCs降低了AA大鼠胸腺、脾脏中增长的CD3+细胞数量，胸腺中CD4灰度值在模型组为(75.45±5.78)，而MSCs治疗后为(86.90±4.23);脾脏中CD4灰度值在模型组为(74.45±4.73)，而MSCs治疗后为（85.38±3.13），两者比较差异有统计学意义，显示MSCs降低了AA大鼠胸腺、脾脏中增加的CD4+细胞数量。胸腺中CD8灰度值在模型组为(93.94±3.58)，而MSCs治疗后为(75.33±3.29);脾脏中CD8灰度值在模型组为(80.61±4.61)，而MSCs治疗后为(64.32±3.32)，两者比较差异有统计学意义，显示MSCs增加了AA大鼠胸腺、脾脏中减少的CD8+细胞数量。在造膜的同时使用MSCs和培养上清液干预后，动物生长发育基本正常，足趾关节肿胀不明显，关节X线片和病理切片都没有出现明显的关节面破坏和病理改变。　　结论:MSCs及其培养上清液能有效干预大鼠AA的发生及治疗AA的病变，其治疗作用机制是通过有效地调节AA大鼠的免疫功能，使免疫器官发挥正常功能，抵抗炎症对机体的损伤。同时，稳定免疫系统中T细胞亚群的网络平衡，从而调节AA大鼠的细胞免疫，抑制B淋巴细胞产生自身抗体和免疫球蛋白，逐步减轻免疫复合物在关节局部诱发的炎症反应，控制滑膜炎。

关键词： 骨髓间充质干细胞   超顺磁性氧化铁   磁共振成像   糖尿病   移植  

摘要： 研究背景间充质干细胞可自骨髓等多种组织分离得到,近年来,间充质干细胞移植已经成为心血管疾病,神经系统疾病等多种疾病治疗的种子细胞。 研究目的本实验采用磁共振成像(MRI)进行标记细胞的体外示踪及移植细胞的糖尿病体内示踪,探讨不同浓度及时间超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)标记兔骨髓间充质干细胞(MSCs)的标记效率、标记后活力以及标记后体外成像情况,为临床体内MRI寻找最佳标记“浓度——时间”。尝试在常规1.5T磁共振(MR)的成像条件下,对较小动物兔的胰腺、肾脏等器官进行解剖成像和移植细胞的示踪;初步动态观察移植细胞在糖尿病兔体内的活体成像特点及规律,为临床干细胞移植治疗糖尿病疗效评估开创新方法。 研究方法(1)MSCs的培养及鉴定。选择健康家兔,采用密度梯度离心法和贴壁筛选法分离、培养、纯化骨髓MSCs,观察细胞在光镜下的生长特征并记录其生长曲线,Von Kassa方法检测成骨诱导骨髓MSCs,对所获得的细胞进行表面抗原(CD44、CD45和CD71)的检测,确定所获细胞绝大多数为骨髓MSCs。(2)标记细胞的体外成像。配制不同浓度含SPIO的培养基(铁终浓度分别为25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、150μg/ml),加入骨髓MSCs孵育标记。标记后1天、3天、1周、2周、3周、4周行普鲁士蓝染色、细胞活力检测及标记细胞体外MRI,并经MRI确定合适的标记时间和标记浓度。(3)移植细胞糖尿病兔MRI活体示踪。制备兔糖尿病模型,将SPIO标记的骨髓MSCs和未标记的骨髓MSCs经静脉移植入糖尿病兔体内,用测定血糖的方法评价细胞移植前、后对糖尿病高血糖的治疗效果。同时经MR动态观察移植细胞的定位、存活及迁徙。 研究结果(1)骨髓MSCs培养、鉴定:骨髓MSCs呈梭形、漩涡状生长。骨髓MSCs经成骨诱导后表达骨细胞特征。流式细胞仪表面标志鉴定CD45呈阴性,CD44、CD71呈阳性。(2)SPIO可有效标记MSCs,细胞活力检测显示时间为1天和3天时,剂量0μg/ml组与25μg/ml组,0μg/ml组与50μg/ml组,25μg/ml组与50μg/ml组的细胞拒感率没有差别(P＞0.05)。体外MRI示标记3天时,标记浓度为50μg/ml组,T2WI及T2*WI信号降低最明显。(3)建立了兔糖尿病模型,其血糖稳定＞16.8mmol/L。血糖检测显示MSCs移植可有效降低糖尿病血糖升高,MR T2WI、T2*WI序列均可示踪糖尿病兔体内移植SPIO标记骨髓MSCs。MRI可对标记细胞示踪至注射后10天。 研究结论联合采用密度梯度离心和贴壁筛选的方法易于分离、纯化获得纯度较高的MSCs。50μg/ml浓度,标记3天的组合不仅标记效率高,对细胞活力无影响而且细胞体外MRI信号强度降低最明显,为最适标记“浓度——时间”组合。磁标记与未标记的骨髓MSCs均能有效治疗糖尿病高血糖。临床型1.5TMR可对糖尿病兔体内标记细胞进行无创性活体示踪,并较长时间地动态观测细胞的存活与迁徙。

关键词： 银杏叶提取物   骨髓间充质干细胞   抗氧化   氧化应激   糖尿病  

摘要： 糖尿病是目前威胁人类健康的主要的慢性病之一。糖尿病发生时,慢性的高糖血症导致机体出现氧化应激,氧化应激是导致糖尿病并发症的主要机制之一。 骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSC)在生理状态下,是支持造血实质细胞的基质细胞,是最幼稚的细胞。最近研究发现,它还具有明显的“可塑性”,即在特定环境下,它不仅可以向骨髓内各种基质细胞分化,还可向全身组织细胞转化。 有研究表明,BMSC可以分化为胰腺细胞,并具有分泌胰岛素的功能。这一研究结果为利用BMSC治疗糖尿病提供了实验依据。然而进行BMSC移植治疗糖尿病时,由于糖尿病发生、发展过程中,胰腺组织局部出现炎症反应,肿瘤坏死因子、白细胞介素6等炎症因子和促凋亡因子分泌增加。机体出现氧化应激,恶劣的生存环境使得应用BMSC治疗糖尿病时存在移植效果不好的问题。为此,本研究利用银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract,GBE)的抗氧化、清除自由基的作用,对糖尿病大鼠进行腹腔注射,为BMSC移植创造良好的生存环境,然后再进行BMSC移植治疗糖尿病,观察GBE联合BMSC治疗糖尿病的效果,为其床应用提供实验依据。 本研究将糖尿病模型大鼠分为糖尿病组(DM)、GBE组、BMSC组、GBE+BMSC组,并设立正常大鼠为对照。结果发现,GBE+BMSC组大鼠的血糖水平显著低于GBE组、BMSC组和DM组(P<0.05),与正常组大鼠的血糖水平没有显著差异(P>0.05);GBE+BMSC组大鼠的胰岛素水平显著高于GBE组、BMSC组和DM组(P<0.05),与正常组大鼠的胰岛素水平没有显著差异(P>0.05)。细胞实验结果表明,GBE在高糖环境下能够有效清除自由基,保护内皮细胞。电镜下观察,加入GBE的高糖环境下的内皮细胞形态完整,线粒体结果完整,线粒体内嵴清晰可见,高糖组内皮细胞死亡较多,线粒体肿胀,线粒体内嵴消失。 本研究结果表明,GBE能够增强BMSC治疗糖尿病作用。