关键词： 间充质干细胞   脑源性神经生长因子   酪氨酸激酶B   阿尔茨海默病   pIRESneo质粒  

摘要： 研究目的：1.建立大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外分离、扩增方法;2.探索携带BDNF的高拷贝质粒的构建以及转染骨髓MSCs的方法;3.探讨经侧脑室移植骨髓MSCs、空质粒修饰骨髓MSCs、BDNF修饰骨髓MSCs对AD大鼠行为学、海马CA1区组织病理学改变的影响;4.探讨经侧脑室移植骨髓MSCs、空质粒修饰骨髓MSCs、BDNF修饰骨髓MSCs对AD大鼠海马区BDNF、TrkB表达的影响。 研究方法：1.取SD大鼠股骨骨髓,经贴壁筛选法进行体外培养,采用免疫荧光方法鉴定骨髓MSCs表面的抗体CD29,CD44,CD34;2.将pEGFP-BDNF质粒进行改造与pIRESneo相连结,构建携带BDNF的高拷贝质粒pIRESneo-EGFP-BDNF,采用电穿孔技术转染骨髓MSCs,经G418筛选,通过倒置荧光显微镜在蓝色光下激发绿色光判断转染效率,采用Western blot方式判定转染细胞是否表达BDNF蛋白;3.40只健康雄性成年SD大鼠随机分为Sham组,AD组,MSCs组,CON组,BDNF组。采用双侧海马注射Aβ25～35诱导AD大鼠模型,经侧脑室移植骨髓MSCs、空质粒修饰骨髓MSCs、BDNF修饰骨髓MSCs观察对AD大鼠在定位航行试验以及空间探索试验中行为学改变,光镜下海马CA1区HE染色、尼氏体染色的变化以及电镜下海马CA1区神经元及突触超微结构的变化;4.采用RT-PCR及Western blot方式,观察经侧脑室移植骨髓MSCs、空质粒修饰骨髓MSCs、BDNF修饰骨髓MSCs对AD大鼠海马区BDNF、TrkB表达的影响。 结果：***大鼠长骨骨髓经过贴壁培养获得的细胞具有MSCs的表型,并且经过反复贴壁传代获得纯度较高,活性较好的MSCs;***-EGFP-BDNF经过双酶切鉴定,携带EGFP及BDNF基因,以EGFP基因为报告基因,质粒构建成功：通过电穿孔技术以及G418筛选,明显提高pIRESneo-EGFP-BDNF转染骨髓MSCs的效率;***水迷宫实验结果提示：AD组与Sham组大鼠比较平均逃避潜伏期（AEL）延长、跨越平台次数明显减少（P＜0.05或P＜0.01）, MSCs组、CON组、BDNF组与AD组大鼠比较AEL明显缩短、跨越平台次数显著增加（P＜0.05或P＜0.01）, BDNF组与CON组或MSCs组大鼠比较AEL显著缩短（P＜0.05或P＜0.01）,跨越平台次数明显增加（P＜0.05）,而MSCs组与CON组比较无统计学意义（P＞0.05）;病理组织学结果;AD组大鼠海马CA1区神经元细胞数目减少,细胞排列不整齐,细胞器损害较重,突触小泡减少,突触间隙模糊,突触数目减少;MSCs组、CON组、BDNF组SD大鼠海马CA1区锥体细胞带保持较好的完整性,细胞排列较整齐,细胞器超微结构损害较轻,突触小泡及突触数目减少有所减轻,突触间隙比较清楚,以BDNF组改善更为明显;4. RT-PCR结果表明：各组大鼠海马组织中均表达BDNFmRNA、TrkBmRNA, AD组与Sham组比较表达量明显减低（P＜0.01）;MSCs组、CON组、BDNF组BDNFmRNA、TrkBmRNA的表达均较AD组明显提高（P＜0.01）,其中CON组与MSCs组比较无明显差异（P＞0.01）,而BDNF组与CON组或MSCs组比较表达均显著提高（P＜0.05）;Western blot结果表明：各组大鼠海马组织中均表达BDNF蛋白、TrkB蛋白,AD组与Sham组比较表达量明显减低（P＜0.01）;MSCs组、CON组、BDNF组BDNF蛋白、TrkB蛋白的表达均较AD组明显提高（P＜0.01）,其中CON组与MSCs组比较无明显差异（P＞0.01）,而BDNF组与CON组或MSCs组比较均显著提高（P＜0.05）。 结论：1.通过体外贴壁筛选法扩增培养,获得大量纯度较高、活性较好的骨髓MSCs;2.电转染是很好的基因转染干细胞,提高转染效率的方法,使用电转染方法转染骨髓MSCs可以提高转染效率;3.双侧海马注射Aβ25～35成功诱导AD大鼠模型,方法简单,成功率高;经过侧脑室移植BDNF修饰骨髓MSCs或MSCs可以提高AD大鼠学习记忆能力,减轻大鼠海马CA1区的神经元及突触的损伤,以前者改善更为明显,因此认为BDNF在神经修复中起着重要作用;4.经侧脑室移植BDNF修饰的骨髓MSCs或骨髓MSCs干预AD大鼠模型,可以提高海马区BDNF、TrkB的表达,以前者更为明显,有可能是干预治疗AD的机制之一。

关键词： 骨髓间充质干细胞   脊髓损伤   血管生成素-1   神经特异性巢蛋白   皮层体感诱发电位  

摘要： 目的：(1)分离、培养及鉴定SD大鼠BMSCs,将其诱导分化为Nestin阳性的BMSCs,并通过分子生物学技术将Ang-1基因转染入细胞内；(2)构建SD大鼠T10脊髓钳夹损伤模型,评估其可行性；(3)通过Ang-1基因修饰的Nestin阳性BMSCs局部注射对损伤脊髓进行治疗,检测Nestin阳性的BMSCs是否能够分化为神经元细胞,检测Ang-1对移植入体内的Nestin阳性的BMSCs,新生及损伤后残留的神经元细胞是否具有保护作用。 方法：(1)采用全骨髓差速贴壁分离培养法将SD大鼠双后肢股骨、胫骨骨髓内的BMSCs进行分离培养。通过显微镜下观察细胞生长性状；流式细胞仪检测其细胞表面标志物CD29、CD34、CD45和CD90的表达；向成骨样细胞、成脂肪样细胞及成神经样细胞分化证明其具有多向分化潜能；同时将BMSCs诱导分化为Nestin阳性的BMSCs,并通过腺病毒载体将Ang-1基因转染入Nestin阳性的BMSCs中,Weston blot检测转染后的细胞是否表达Ang-1。(2)构建SD大鼠T10脊髓钳夹损伤模型,造模后1周内通过运动功能评价、神经电生理检测及组织病理学检测等方法检测模型的可行性；(3)造模后1周对随机分组的大鼠实施局部注射移植细胞进行治疗,在随后的1～4周内通过运动功能评价、神经电生理检测及脊髓组织的免疫组织化学检测等方法检测Ang-1基因修饰的Nestin阳性BMSCs对损伤后脊髓的相关作用。 结果：(1)通过全骨髓差速贴壁分离培养的BMSCs增殖速度快,扩增能力强,传代培养3代后细胞可获较高纯度；通过流式细胞仪检测细胞表面标记物,细胞表达CD29和CD90,阳性率均达99%以上；在体外通过诱导分化后细胞可分化为成骨细胞、成脂肪细胞及成神经样细胞；通过Weston blot检测转染后的Nestin阳性BMSCs出现Ang-1条带。(2)造模后1周内,大鼠出现明显截瘫(BBB<4分),经神经电生理检测无法引出CSEP波形,脊髓组织出现大量炎性细胞浸润,脊髓空泡变性。(3)移植后1-4周,A组大鼠后肢神经功能无明显变化,B、C组大鼠均有不同程度的恢复,C组较B组明显(P<0.05)；神经电生理检测,C组亦明显优于B组(P<0.05)；损伤脊髓经免疫组织化学染色后,B、C两组均表达BrdU、Nestin、NSE,随着时间的延长,阳性细胞数逐渐减少,但移植4周后C组仍保持一定量的阳性细胞,且明显多于A、B两组(P<0.05)。C组还可观察到BrdU阳性细胞向血管腔周围聚集。 结论：(1)通过全骨髓差速贴壁分离培养法能够获取较高纯度的BMSCs,细胞具有多向分化潜能,经神经诱导后,细胞能分化为Nestin阳性BMSCs,通过分子生物学技术,Ang-1基因转染入Nestin阳性BMSCs中获得成功。(2)成功构建SD大鼠T10脊髓钳夹型损伤模型。(3)经Ang-1基因修饰后的Nestin阳性BMSCs移植入体内后能进一步分化为成熟的神经元细胞,同时其分泌的Ang-1对Nestin阳性的BMSCs、新生及残留神经细胞具有保护作用,对脊髓损伤具有一定的修复作用。

关键词： 间充质干细胞   心肌梗死   治疗   实验研究  

摘要： 目的:用超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide, SPIO)标记的乳猪骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs),分别通过冠脉途径和外周静脉途径移植治疗小型猪急性心肌梗死,观察MSCs是否能够迁移至心肌梗死的部位,是否能存活及能否转分化为心肌细胞,为临床应用MSCs治疗急性心肌梗死提供参考。 材料与方法 10头贵州种乳猪,取其双侧股骨、胫骨、肱骨和尺骨,采用直接贴壁法从其骨髓中分离和培养MSCs。 11头贵州种小型猪,在介入引导下将丝线线段推送到左冠状动脉前降支或回旋支远端,建立急性心肌梗死模型。手术成功的小猪于术前和术后24h抽血行实验室检查(检测心肌酶谱及肌钙蛋白水平),手术前后并做超声心动图和MRI检查,以确定建模是否成功。 MRI检查:扫描序列包括:FIESTA两腔心长轴位、四腔心长轴位及心脏短轴位,Fiesta和Tags序列轴位动态扫描,平扫Double、Triple序列,Gd-DTPA灌注扫描及延迟扫描,延迟期Double及Triple序列扫描。灌注扫描参数:扫描参数:TR:8.2ms,TE:2.6ms,TI: 167.4ms,经耳缘静脉快速推注Gd-DTPA 0.1mmol/kg,注射速度4ml/s,推注造影剂同时启动扫描。FIESTA和平扫Double、Triple序列观察心脏大小、形态及信号;Fiesta和Tags序列观察室壁运动情况;灌注扫描观察有无灌注缺损或延迟灌注,最大灌注斜率、峰值信号、达峰时间。延迟扫描及延迟期Double、Triple序列扫描观察有无延迟强化。作术前、术后自身对照。 8头建模成功的小猪,以其中2头为对照组,6头为治疗组(其中3头为冠脉移植组,3头为静脉移植组)。治疗组用SPIO标记的第二代乳猪MSCs分别通过冠状动脉途径和外周静脉途径移植,每头小猪接受细胞移植数量约1×107,移植时间为栓塞后7～10天。对照组不接受治疗。 对照组栓塞后5周、治疗组细胞移植后4周,将小猪全部处死,所有小猪术后总生存时间一致。取出心脏,观察心脏大小、形态,梗死的位置和范围,比较MRI表现与大体病理是否符合。HE染色后显微镜下观察,比较对照组和治疗组梗死瘢痕区微血管密度。普鲁士蓝染色观察治疗组瘢痕区有无MSCs;免疫组织化学检测肌钙蛋白表达情况(用SP三步法)初步判断MSCs是否转分化为心肌细胞。 结果 1、用贴壁法分离和培养MSCs,随更换培养液次数和传代次数的增加,造血细胞逐渐减少,MSCs纯度提高,形态趋于一致,呈梭形,分布均匀。 2、11头小型猪,1头因股动脉痉挛穿刺失败,1头在术中发生室颤死亡,1头于术后第2天死亡,其余8头建模成功。术前、术后实验室检查及超声心动图检查心功能(主要指标取射血分数和短轴缩短率)结果比较,P值均<0.05,具有统计学意义。 3、MRI检查:术前心脏大小、形态、运动及信号未见异常,室壁灌注均匀,无延迟强化。术后心脏大小、形态无明显改变,梗死部位运动减弱或消失;平扫梗死部位有3例(3/8)在FIESTA序列呈稍高信号,其余信号无明显改变, Double及Triple序列8(8/8)例均呈稍高信号;灌注扫描梗死部位均呈低灌注,延迟扫描有强化,延迟期梗死部位Double及Triple序列呈明显高信号。MRI显示梗死部位及范围与大体病理一致。 4、HE染色,冠脉移植组瘢痕区微血管密度明显增加,高于静脉移植组,对照组瘢痕区仅有少量新生血管。普鲁士蓝染色,治疗组在瘢痕区见胞质内有蓝色颗粒的细胞,其中冠脉组多于静脉组,而对照组无此类细胞。免疫组织化学检查肌钙蛋白表达情况:治疗组瘢痕区散在有肌钙蛋白呈强阳性表达的细胞,其中冠脉组阳性表达高于静脉组。对照组未见阳性表达细胞。 结论:用同种异体(乳猪)的MSCs通过冠脉或外周静脉移植途径治疗小型猪心肌梗死,部分MSCs能“归巢”到梗死部位并存活,其中部分细胞可能转分化为心肌细胞,并能促进微血管生成,其中冠脉途径效果优于外周静脉途径。本研究对异体MSCs移植治疗急性心肌梗死的临床应用有一定的参考价值。

关键词： 人骨髓间充质干细胞   心肌梗死   年龄差异   血管形成   间质重构  

摘要： 目的：既往的动物研究已经证实，移植同源或者自体骨髓间充质干细胞能有效改善心脏功能。然而，在临床研究中发现，应用自体间充质干细胞治疗心梗效果并不明显。年龄差异有可能是造成这一结果的主要原因，因此我们通过移植不同年龄的人间充质干细胞来确定年龄是否对心梗后的细胞治疗效果产生影响。　　 方法：骨髓取自不同年龄患者，年轻组为1～5岁，老年组为50～70岁，进行细胞培养，并取第3代细胞应用流式细胞仪鉴定细胞表面抗原。制作大鼠心梗模型，把2.0xl06个培养的不同年龄人骨髓间充质干细胞（对照组为相同体积培养基）注射到大鼠心梗边缘区，并每天给予5mg/kg的环孢素A以预防排斥反应。术后第1、2和4周进行心动超声检查以评价大鼠心脏功能。于术后1周取部分大鼠心脏进行RT-PCR和Western Blot的方法检测TIMP-3、MMP-9和VEGF基因和蛋白表达情况;并用酶谱和反酶谱方法检测MMP-2、MMP-9和TIMP-3蛋白活性情况。术后4周时取大鼠心脏组织进行人线粒体和CD31染色对比不同年龄细胞存活和新生血管数量情况。　　 结果：术后超声心动检查发现，年轻组大鼠心功能（射血分数和左室短轴缩短率）明显好于对照组和老年组(P<0.05)，左室收缩和舒张末期容积也要明显小于对照组和老年组(P<0.01)。术后1周，与对照组和老年组相比，年轻组大鼠心脏TIMP-3和VEGF基因和蛋白水平明显升高，而MMP-9水平明显降低(P<0.05)。与之一致的是，年轻组MMP-2、MMP-9蛋白活性低于对照组和老年组，而TIMP-3蛋白活性高于对照组和老年组(P<0.05)。术后4周，年轻组新生血管和存活细胞数量也明显多于老年组和/或对照组(P<0.05)。　　 结论：人间充质干细胞再生能力随着年龄增长明显减弱。移植年轻人间充质干细胞可以显著改善大鼠梗死后心功能，可能的机制是抑制心肌间质重构和促进血管形成。这说明临床进行干细胞移植治疗心梗有必要选取年轻来源的干细胞。

关键词： 骨髓间充质干细胞   干细胞治疗   心肌梗死   成心肌细胞   定向分化   移植治疗   MSCs   生物学基础  

摘要： 1999年Makino等[1]首次在体外应用5-氮胞杂苷（5-Aza）将骨髓间充质干细胞（mesenchymal stemcells MSCs）定向分化成心肌细胞,为MSCs移植治疗心肌梗死提供了细胞生物学基础。2001年,Orlic等[2]将Lin-C-Kit＋干细胞注射到心肌梗死小鼠的存活心肌内，发现其分化为心肌样细胞，开创了干细胞在体内移植治疗心肌梗死的先河。然而，随着研究的不断深入，众多学者对MSCs能否分化为心肌细胞、其改善心功能机制等方面产生质疑，本文就干细胞移植治疗心肌梗死存在问题与争议综述如下。

关键词： 糖尿病肾病   骨髓间充质干细胞  

摘要： 目的探索骨髓间充质干细胞(MSCs)经体外扩增培养后移植入糖尿病肾病大鼠体内能否改善或者治疗糖尿病肾病。方法SD大鼠60 mg/kg STZ一次性腹腔注射,糖尿病成模后4周,成功制备糖尿病肾病大鼠被随机分为:糖尿病肾病对照组(n=12)和干细胞移植组(n=12),另选6只正常大鼠作为对照组。MSCs经体外培养、鉴定、BrdU标记后,心脏注射到干细胞移植组大鼠体内(2×106MSCs/200μL),一周后再次注射等量干细胞。于末次注射后1、2、8周测定大鼠血糖、体质量、24 h尿总蛋白、肌酐清除率、肾脏肥大指数,观察大鼠肾脏病理变化和标记干细胞体内作用情况。结果MSCs体外扩增培养后表达间充质细胞的表型抗原,能多向分化为成骨、成脂细胞。在体内能趋化到受损肾脏,但在干细胞定植部位未发现增殖细胞。干细胞移植组和糖尿病肾病对照组在各观察时点血糖、尿总蛋白、肌酐清除率、肾脏肥大指数均明显高于正常对照组(P<0.05),体质量均低于正常对照组(P<0.01)。干细胞治疗后1周移植组较糖尿病肾病对照组血糖降低〔(26.7±2.8)vs(29.9±1.6)mmol/L,P<0.05〕。在第2、8周,移植组较糖尿病肾病对照组24 h尿总蛋白降低,但差异无统计学意义。干细胞移植组肌酐清除率低于糖尿病肾病对照组,在治疗后2周两组差异有统计学意义〔(8.6±1.9)vs(17.1±1.6)mL/min,P<0.05〕。在第2周干细胞移植组的肾脏肥大指数较糖尿病肾病对照组减少(5.5±0.1 vs 6.2±0.3,P<0.05),但高于正常对照组(3.2±0.2)。结论发现MSCs经体外培养标记后在体内能趋化到糖尿病肾病大鼠肾脏,可以暂时改善糖尿病肾病。

关键词： 糖尿病足   骨髓   干细胞   护理  

摘要： 总结了8例骨髓间充质干细胞治疗糖尿病足的护理经验。主要包括心理护理,局部伤口处理,骨髓的采集,骨髓间充质干细胞的回输,血糖监测及低血糖反应的观察,健康教育等。认为精心的护理有助于提高骨髓间充质干细胞治疗糖尿病足的疗效。

关键词： 移植   自体   骨髓间充质干细胞   骨不连  

摘要： 目的:探讨体外培养经皮移植自体骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗四肢骨折骨不连的效果.方法:12例四肢骨折骨不连患者采用体外培养经皮移植自体MSCs治疗.结果:9例获得了骨性愈合,骨折愈合平均时间为5个月(4～7月),X线显示骨折线消失,骨痂形成.骨折愈合率为75%(9/12).结论:体外培养经皮移植自体MSCs治疗四肢骨折骨不连创伤小、安全、并发症少,临床效果满意.

关键词： 骨髓间充质干细胞   刀豆蛋白A   急性肝损伤  

摘要： 为了探讨骨髓原间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)治疗急性肝损伤的可行性及有效性,本研究分离培养小鼠MSC,并建立刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)诱导的小鼠急性肝损伤模型。在ConA静脉注射后立即给予MSC静脉输注,24小时后进行小鼠血清转氨酶、肝脏组织病理学和原位细胞凋亡检测,并用实时定量RT-PCR的方法检测小鼠肝脏组织内炎症介质表达变化。结果显示,ConA静脉注射后立即给予MSC静脉输注,小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平降低(p<0.05),肝脏坏死和肝细胞凋亡减轻,肝脏组织内TNF-α、IFN-γ的水平明显降低(p<0.05),iNOS、IL-2和IL-10的表达水平基本不受影响(p>0.05)。结论:静脉输注MSC能减轻ConA诱导的小鼠急性肝损伤。

关键词： 骨髓间充质干细胞   贫血   再生障碍性   模型鼠   存活率   肿瘤坏死因子α  

摘要： 背景:骨髓间充质干细胞在体外抑制再生障碍性贫血T淋巴细胞的活化与增殖,并有支持骨髓造血作用。目的:观察骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血模型鼠存活率的影响,探讨其治疗再生障碍性贫血的机制。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2009-01/04在安徽医科大学第一附属医院中心实验室完成。材料:清洁级雌性BALB/C小鼠40只,8～10周龄,体质量16～18g,作为受体。清洁级DBA/2小鼠5只,6～10周龄,体质量15～19g为淋巴细胞供体。方法:取BALB/c小鼠骨髓进行间充质干细胞体外增殖培养,传至3～5代的细胞用于实验。建立免疫介导再生障碍性贫血小鼠模型。40只BALB/C小鼠随机分为3组,治疗组(n=15):造模后将1×106个骨髓间充质干细胞输注到治疗组小鼠体内进行治疗;模型组(n=15):仅造模不进行任何治疗;对照组(n=10):不进行任何干预。主要观察指标:分别于第1,2,3,4周观察各组小鼠的存活率;流式细胞仪及酶联免疫吸附法测定骨髓间充质干细胞治疗后第28天各组小鼠T淋巴细胞亚群及血浆肿瘤坏死因子α的表达。结果:①模型组小鼠3只于第2周内死亡,7只于第3周内死亡,2只于第4周内死亡,28天存活率20%;治疗组小鼠4只于第3周内死亡,28天存活率73%。②与模型组相比,治疗组和对照组CD4的表达增高[(27.12±4.23)%,(32.18±6.73)%,(38.44±7.88)%,P<0.01];CD8和肿瘤坏死因子α表达均降低[CD8:(34.42±5.13)%,(27.33±5.09)%,(23.31±5.24)%,P<0.01;肿瘤坏死因子α:(47.27±10.11),(12.34±5.87),(9.31±3.77)ng/L,P<0.01]。结论:骨髓间充质干细胞可以提高再生障碍性贫血小鼠存活率,其治疗机制可能与调节T淋巴细胞亚群及抑制T淋巴细胞分泌的肿瘤坏死因子α有关。