关键词： 转移生长因子β   骨髓间充质干细胞   自身免疫性重症肌无力  

摘要： 目的:通过体内、外实验探讨骨髓间充质干细胞(bone mesenchymalstromal ceils,BMSCs)对治疗实验性自身免疫性重症肌无力(Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis,EAMG)的效果及相关机制。　　 方法:1、用含有大鼠来源的AChRαt97-116多肽片段、结核菌素、弗式不完全佐剂的混合乳剂,免疫健康Lewis大鼠的尾根部,建立EAMG实验动物模型。根据Lennon评分法及体重监测,对模型的建立情况予以评定,并设置CFA对照组、EAMG模型组、BMSCs移植治疗组。2、全骨髓贴壁法提取、扩增健康Lewis大鼠股骨、胫骨内的BMSCs,并以EAMG实验动物模型为研究对象,在二次免疫的同时,以同种异体BMSCs107/只尾静脉移植,依据Lennon评分法及体重监测,初步评定BMSCs尾静脉移植治疗EAMG大鼠模型的效果;同时,H3增殖实验法检测三组大鼠T淋巴细胞的增殖能力,流式细胞仪法检测各组大鼠T淋巴细胞中Th17及Treg细胞亚群的分布情况,进一步证实BMSCs尾静脉移植对EAMG模型大鼠的治疗效果。3、免疫磁珠法提取、分离AChR特异性T淋巴细胞,并分别以T:BMSCs=10:1的比例进行体外共培养,抗转移生长因子-beta(transforming growth factor-β,TGF-β)抗体封闭BMSCs分泌的TGF-β,采用H3增殖试验法检测不同处理组T细胞的增殖能力,ELISA法检测不同处理组T细胞培养上清中IL-6、IL-17等细胞因子的表达,从机制上探讨BMSCs对EAMG的治疗效果及可行性。　　 结果:体内实验:1、与CFA对照组相比,EAMG模型组大鼠Th17细胞的比例升高(PTh17＜0．001),Treg细胞的比例降低(Ptreg＜0．01),而BMSCs移植则降低了Th17这种炎性细胞的比例(PTh17＜0．05),而提高了保护性细胞亚群Treg的比例(Ptreg＜0．05);2、BMSCs移植组大鼠T细胞对AChR多肽片段的增殖活性降低P＜0．01)。　　 体外实验:1、ELISA结果显示,单纯培养的AChR．特异性T淋巴细胞IL-17、IL-6等致病性因子的表达高于BMSCs共培养组(PIL-17＜0．05,PIL-6＜0．05),而流式结果显示,单纯培养的AChR．特异性T淋巴细胞Th17亚群的比例明显高于与BMSCs共培养组(PTh17＜0．01),Treg细胞亚群的比例则低于BMSCs共培养组(Ptreg＜0．001),而分别以抗TGF-β抗体拮抗后,能在一定程度上抑制BMSCs的这种免疫调节作用,有统计学意义;2、BMSCs能抑制AChR特异性T增殖的能力(PT＜0．001),而抗TGF-β抗体能不同程度地逆转BMSCs的这种抑制作用,有统计学意义。　　 结论:1、BMSCs尾静脉移植治疗能有效缓解EAMG的临床症状;2、BMSCs通过逆转EAMG中Th17/Treg两种辅助性T细胞亚群的失衡状态起到免疫治疗效果;3、BMSCs能够抑制．AChR特异性T的增殖活性;4、BMSCs对EAMG的免疫调节功能是部分通过分泌。TGF-β抑制性因子来完成的。

关键词： 骨髓间充质干细胞   Exendin-4   细胞治疗   分化   胰岛素分泌细胞   2型糖尿病   再生   凋亡  

摘要： 2型糖尿病(T2DM)是由遗传和环境共同作用而引起的一组以糖代谢紊乱为主要表现的临床综合征,由于胰岛素分泌、作用或两者同时存在缺陷引起碳水化合物、脂肪、蛋白质、水和电解质等代谢紊乱,可以引起多个系统器官同时损伤的慢性并发症,是致残致死的主要原因。目前的治疗以降糖为主,一定程度上能够改善胰岛素抵抗、代谢综合征,但不能根治糖尿病,尤其是对包括胰岛细胞在内的多器官组织的损伤疗效甚微,间充质干细胞(MSCs)因其具有损伤修复和多向分化潜能,成为糖尿病及其并发症治疗领域的研究热点。 研究显示,骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植后对大多数组织损伤的修复起效快,具有直接的修复能力,课题组前期的研究结果显示,BMSCs对T2DM多种器官组织的损伤具有良好的直接修复作用,对T2DM并发症及一般状况的改善非常明显,对胰岛的修复也有一定的作用,但是短期内还未能观察到胰岛功能的完全恢复,也未见到同类报道。同时我们看到,BMSCs还具有一定的改善胰岛素抵抗及降糖作用,但是短期内直接降糖作用较弱。杨卫红等的研究显示,高糖可以抑制BMSCs的增殖,促进BMSCs的凋亡,我们的研究也显示,高糖高脂培养的BMSCs凋亡增加,高糖高脂还可以导致β细胞分泌胰岛素的能力下降。因此,如果无辅助的治疗,移植入体内的BMSCs在发挥作用时可能会受到T2DM病因的影响,而且在T2DM病因的作用下不利于BMSCs向胰岛细胞分化,单独使用BMSCs治疗还具有一定的局限性。 Exendin-4是从蜥蜴唾液腺分离出来的GLP-1 (glucagon-like peptide-1)的类似物,具有较长的血浆半衰期和较强的生物活性。它能够针对T2DM的多个病理生理靶点发挥降糖效应,改善胰腺局部的微环境,同时能够促进胰岛细胞的再生及干细胞向胰岛细胞的分化。但是,它进入体内发挥作用相对较慢,刺激胰岛细胞再生需较长周期,而且对于全身并发症的改善是一种间接的作用,依赖体内的干细胞体系,BMSCs与Exendin-4在T2DM及其并发症的治疗上具有很好的互补作用。为探索一条副作用低的、有效的治疗T2DM胰岛细胞损伤的方法,本研究课题将探讨在BMSCs移植的过程中联合使用Exendin-4是否有利于BMSCs进入体内更好地发挥作用,Exendin-4在体外是否能够促进BMSCs向胰岛素分泌细胞(IPCs)的分化,Exendin-4是否能够促进BMSCs在体内分化为IPCs, BMSCs是否通过促进胰岛β细胞再生,减少β细胞凋亡发挥治疗作用,联合使用Exendin-4是否能协同增强BMSCs的治疗作用。各部分研究结果分别简述如下。 一、正常大鼠BMSCs的分离培养和鉴定 采用全骨髓贴壁培养法分离、培养、纯化大鼠BMSCs,观察细胞在光镜下的生长特征并记录其生长曲线,对所获得的细胞进行成骨及成脂肪细胞诱导分化,流式细胞仪分析其表面标记(CD34, CD44, CD45, CD71, CD105)。结果显示,BMSCs呈梭形、漩涡状生长,BMSCs成骨和成脂诱导可以使BMSCs出现钙盐沉积和脂滴,表达成骨细胞、脂肪细胞特征,表面标志鉴定CD34、CD45呈阴性,CD44、CD71、CD105呈阳性,确定所获细胞绝大多数为BMSCs。本部分实验建立了大鼠BMSCs的体外培养体系,为后续的干细胞研究提供了稳定的细胞模型。 二、Exendin-4在BMSCs转分化为胰岛样细胞中作用的体外研究 本部分研究中我们采用两步法诱导BMSCs分化为胰岛样细胞,同时加入不同浓度的Exendin-4 (5、10、20、40、80nM),观察其对分化的影响。双硫腙染色鉴定胰岛样细胞团,免疫细胞化学染色法对胰岛素分泌细胞进行鉴定,用放射免疫分析法观察诱导后细胞对葡萄糖刺激试验的反应,Real time-PCR检测胰岛β细胞相关基因Ngn3、PDX-1、Insl及Glut2的表达。结果表明,在Exendin-4作用下,BMSCs向胰岛样细胞转化增多,体外培养细胞上清液中胰岛素含量明显升高,胰岛β细胞相关基因Ngn3、PDX-1、Insl及Glut2 mRNA的表达增加,在一定范围内呈剂量依赖性。 三、Exendin-4在BMSCs移植治疗T2DM中的作用 建立T2DM大鼠的模型,分为正常对照组、T2DM模型组、BMSCs移植组、Exendin-4处理组及BMSCs+Exendin-4治疗组,将Brdu标记的BMSCs从大鼠尾静脉移植入T2DM模型大鼠体内,观察不同的干预措施对各组大鼠的体重、血糖、血脂及血浆胰岛素、脂联素水平的影响,并通过免疫组化、免疫荧光双标技术观察BMSCs在大鼠胰腺组织的分布及分化情况。结果表明,BMSCs能够迁移至T2DM模型大

关键词： 慢性酒中毒   骨髓间充质干细胞   氧化应激   信号转导通路   脑损害   动物模型  

摘要： 目的：在建立慢性酒中毒动物模型和体外细胞模型的基础上，探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)能否改善慢性酒中毒大鼠的认知功能损害以及MSCs条件培养基(MSCs conditioned medium，MSC-CM)是否能对慢性酒精暴露造成的脑神经细胞损害起到保护作用，通过体内、体外两条途径证明骨髓MSCs治疗慢性酒中毒性脑损害的可能性;并阐述其相关的作用机制。　　 方法：体内实验：雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠通过高浓度酒精(50％)逐渐加量灌胃8周，建立慢性酒中毒动物模型。将实验大鼠(n=32)随机分为对照组、慢性酒中毒组、MSCs回输治疗组和PBS(phosphate buffered solution)回输组。体外分离、培养、扩增并鉴定SD大鼠骨髓MSCs，并以慢性酒中毒动物模型为研究对象，分别以荧光染料PKH-26膜标记的MSCs(107个细胞/只)或者PBS经尾静脉进行移植。通过Morris水迷宫检测评定认知功能;荧光显微镜进行MSCs示踪观察;免疫印迹法检测各组大鼠海马抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表达;比色法检测各组大鼠海马组织氧化应激指标[超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)]的含量;免疫组化、RT-PCR(Reverse transcription-ploymerase chain reaction)和免疫印迹法比较各组大鼠海马神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的表达;免疫印迹法检测各组大鼠海马信号通路PI3K/Akt(phospha-tidylinositol-3-kinase/Akt)和ERKl/2(extracellular signal-regulated kinase l/2)中转导分子p-Akt和p-ERKl/2的表达。　　 体外实验：培养PC12细胞;分离、纯化并培养原代皮质神经元细胞。在体外培养骨髓MSCs的基础上，收集MSCs条件培养基(MSCs conditioned medium，MSC-CM)。PC12细胞和原代皮质神经元分别在存在或不存在酒精暴露(100mM)的情况下，预先给予或不给予MSC-CM进行干预，共培养4天。通过MTT和LDH方法检测细胞活性;细胞核DAPI染色法和Annexin V/PI双染的流式细胞术检测细胞凋亡的情况;流式细胞术和比色法检测不同处理的细胞内氧化应激指标[SOD、GSH、MDA和活性氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS)]的活性;ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)法检测MSC-CM中营养因子的含量;免疫印迹法检测不同处理的细胞内信号转导分子p-Akt和p-ERK1/2的表达情况。另外，通过添加上述两条信号通路的阻断剂，进一步证实MSC-CM抗氧化作用的相关分子机制。　　 结果：体内实验：(1)Morris水迷宫实验中，MSCs回输治疗组各时间点逃避潜伏期[(33.83±3.26)s，(13.14±2.64)s，(6.53±0.98)s，(4.45±0.85)s]明显短于慢性酒中毒组[(53.78±4.29)s，(36.53±2.39)s，(18.28±2.13)s，（8.67±0.46）s](P<0.01);平台象限时间百分比(73.99±1.49％)明显长于慢性酒中毒组(51.25±3.69％)(P<0.01)，显著改善了慢性酒中毒模型鼠的学习记忆功能(P<0.01)，且与对照组无显著差异（P>0.05）。(2)以PKH-26红色荧光标记的MSCs示踪实验发现，MSCs可向慢性酒中毒鼠海马内趋化。(3)与对照组相比，慢性酒中毒鼠海马抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低(P<0.01)，促凋亡蛋白Bax表达明显升高(P<0.01)：而MSCs回输治疗明显降低了慢性酒中毒鼠Bax的表达(P<0.01)，提高了Bcl-2的表达(P<0.01）。(4)与对照组相比，慢性酒中毒鼠海马内MDA的含量明显增高(P<0.01)，SOD和GSH的活性明显降低(P<0.O1);而MSCs回输治疗能够明显抑制慢性酒中毒造成的大鼠海马氧化应激指标的恶化(P<0.01)。(5)RT-PCR结果显示慢性酒中毒鼠海马中NGF和BDNF mRNA表达比对照组明显降低(P<0.01)，而MSCs治疗后可使两者表达明显上调(P<0.01)，免疫组化和免疫印迹方法检测也得到了同样的结

关键词： 骨髓间充质干细胞   百草枯   肺损伤   转化生长因子-β1  

摘要： 研究背景 百草枯（PQ)是目前广泛使用的一种有机杂环类速效触杀型除草剂，由于肺内存在着胺类物质转运系统,而百草枯和二胺、多胺、及二硫胱胺具有结构上的相似性,百草枯可与胺类物质竞争通过肺泡Ⅱ型细胞的能量依赖性多胺摄取途径而积聚在肺内。因此，肺脏是百草枯中毒的主要靶器官(俗称百草枯肺）。大量口服百草枯后会出现急性中毒反应，表现为肺泡上皮细胞受损，肺泡内出血水肿，炎性细胞浸润，死亡率极高。少量口服百草枯后，早期肺部症状比较轻微或不明显，随着毒性作用时间加长，肺部损伤逐渐由炎性反应过渡到不可逆的肺纤维化（此过程大约需要28天），患者生存质量严重下降，继而进行性呼吸困难，最后导致呼吸衰竭甚至死亡。这种慢性肺纤维化是临床百草枯中毒的常见死亡原因之一。因此，为改善生存状况、降低死亡率，就要积极预防或者减轻肺纤维化的形成.虽然目前[1-4]对百草枯中毒有过很多机制及治疗方面的研究与探索，且获到一些成效，但都未取得突破性进展，仍无有效解毒药物，仍以激素、免疫抑制剂治疗和对症支持治疗为主，中毒者病死率高达50％－60％。所以，寻求PQ中毒引起肺损伤的新的治疗策略，降低PQ中毒病死率具有重要现实意义。 目前医学界研究和探讨的重点是如何将干细胞成功应用于各类临床严重疾患的治疗方面，为诸多患者带来佳音。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells，MSCs)也称骨髓基质来源干细胞，是存在于骨髓中除造血干细胞以外另一类具有多向分化潜能的干细胞。在一定诱导条件下，这类细胞可定向分化为多种造血以外的组织，特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞[5]，例如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞、肌肉细胞、神经细胞等。因此,我们认为MSCs移植有可能替代百草枯中毒肺部受损细胞，从而改善和恢复肺的通气换气，降低肺纤维化的形成。近年来已将MSCs引入到各种肺损伤的治疗中，包括肺纤维化损伤，但研究多集中在MSCs的移植对博莱霉素、放射性骨髓抑制以及LPS诱导的肺损伤的动物疾病模型的治疗作用方面，而关于MSC移植对PQ中毒所致肺损伤的研究还没有报道。观察骨髓间充质干细胞(MSCs)对大鼠百草枯(PQ)中毒肺损伤的疗效及可能机制。 实验方法与结果 1.分离、培养和鉴定大鼠骨髓MSC 取SPF级Wistar大鼠100-130g,雌雄不拘,全骨髓贴壁分离法培养大鼠骨髓间充质干细胞，至第四代镜下观察细胞贴壁生长，形态统一，呈一致的梭形或长条形。取四代MSCs分别行流式细胞仪细胞表型检测及成骨、成脂诱导分化实验，结果显示四代MSCs均表达CD90,不表达CD45和CD34,即CD34-/CD45-/CD90+，且在一定诱导条件下，成功向成骨、成脂肪诱导转化。这就说明我们用的全骨髓贴壁分离筛选法可以获得足够量、生长旺盛、高纯度、具有多向分化潜能的大鼠骨髓见充质干细胞。 2.增强型绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞在百草枯中毒大鼠肺组织中的植入 60只SPF级Wistar大鼠,体重200g左右,雌雄不拘，随机分为4组，每组15只:A组，正常对照组;B组，肺损伤模型组(PQ+PBS)，腹腔注射质量分数为20%的百草枯18mg/kg,4h后经尾静脉注射1mlPBS;C组，MSCs治疗组(PQ+MSCs)，腹腔注射质量分数为20%的百草枯18mg/kg,4h后经尾静脉注射MSCs-EGFP，1×106/只(重悬于1mlPBS中);D组，MSCs对照组(MSCs+PBS)，腹腔注射等量的PBS，4h后经尾静脉注射MSCs-EGFP，1×106/只(重悬于1mlPBS中)。 取第三代MSCs，加入携带增强型绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体Ad5-EGFP，转染成功后,在染毒后4h经尾静脉注射入大鼠体内，分别在给予MSCs后1d、3d、7d随机处死每组大鼠各5只，行肺组织病理切片，荧光倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞的迁移。结果显示细胞在转染前后，生长状况良好，形态相同，基本不受病毒影响。在大鼠肺组织中，荧光显微镜下可见MSCs治疗组大鼠在给予MSCs后一天、三天肺组织中有少量绿色荧光标记的细胞，分布散在，无明显规律，而肺损伤组，MSCs对照组，及正常对照组均未发现绿色荧光标记的细胞。染毒后7天均未见到阳性细胞。 3.骨髓间充质干细胞对百草枯致大鼠肺损伤的保护作用 20只SPF级wistar大鼠，体重200g左右,雌雄不拘，按上述方法随机分为4组,观察各组大鼠的一般情况，染毒后28d处死各组大鼠取相应标本,检测肺系数、肺匀浆中羟脯氨酸（HYP）的含量及血清转化生长因子-β1(TGF-β1)水平,同时行实验目的:肺组织病理学观察。结果显示MSCs治疗组大鼠肺纤维化及实变程度较百草枯中毒模型组轻。与正常对照组比较,各组血清转化生长因子-β1(TGF-β1)，肺系数、肺匀浆中经脯氨酸（HYP

关键词： 间充质干细胞   系统性红斑狼疮   细胞生物治疗   狼疮鼠  

摘要： 目的:研究间充质干细胞(MSC)的输注是否可以减轻系统性红斑狼疮(SLE)小鼠的自身免疫反应,改善其免疫损伤,并探讨MSC治疗SLE机制。 方法:1)分离大鼠骨髓MSC:分离雄性SD大鼠(80g)股骨、胫骨,采用全骨髓培养法分离、扩增、传代、冻存、复苏MSC,并描绘MSC生长曲线。2)动物实验分组:将雌性MRL/mp(fas)lpr小鼠随机分为2组,每组5只,试验组:在14周龄时尾静脉输注MSC(0.3×106/0.15ml.只);对照组:以生理盐水代替MSC作尾静脉输注。3)实验持续8周,进行下列指标观察:①每天观察小鼠一般情况:进食、精神、毛发、体重、存活时间直至处死。②每3天收集小鼠尿液,行bradrord法尿蛋白浓度测定。③每周剪尾采血50ul,分离血清,放射免疫法测血清抗ds-DNA抗体浓度。④小鼠22周龄时切取肾脏作病理切片检查,观察狼疮性肾炎肾症病理改变,同时作免疫复合物免疫组织化学检查。⑤流式细胞术测外周血、脾脏、胸腺CD4﹢CD25﹢T细胞水平。 结果:1)采用全骨髓培养法,7-10天后细胞可铺满培养瓶底85-95%,传至第2、3代后收集细胞,生长曲线示原代至3代的MSC生长状态较好。2)尾静脉输注后,小鼠局部、整体无不良反应。3)在实验观察的8周时间内:①2组小鼠均存活8周直至处死,进食、精神状态、活动度、体重、毛发大致相同。②实验前两组尿蛋白浓度无统计学差异(P>0.05);MSC输注组,尿蛋白浓度显著低于对照组(P<0.05);③MSC输注组,血清抗ds-DNA抗体浓度显著低于对照组(P<0.05)。④肾脏病理HE染色观察:MSC输注组小鼠间质性肾炎病理改变较对照组小鼠减轻。肾脏病理免疫组化染色观察:MSC输注组小鼠的肾小球系膜区免疫复合物沉积量减少,范围缩小呈点状分布;对照组小鼠的肾小球系膜区免疫复合物沉积量较多,范围较大呈片状分布,两组有显著性差异(P<0.05)。⑤试验组外周血、胸腺中CD4﹢CD25﹢T细胞水平显著高于对照组(P<0.05);试验组脾脏CD4﹢CD25﹢T细胞略高于对照组,无显著差别(P>0.05)。 结论:MSC易于在体外分离扩增,输注无明显不良反应。MSC输注可以改善MRL/mp(fas)lpr小鼠的自身免疫反应损伤的状况,其机制可能通过上调雌性MRL/mp(fas)lpr小鼠CD4﹢CD25﹢T细胞水平,减少自身抗ds-DNA抗体的产生,改善肾脏免疫病理损伤。

关键词： 骨髓间充质干细胞   树突状细胞   再生障碍性贫血   细胞培养  

摘要： 研究背景:再生障碍性贫血(aplastic anemia, AA,简称再障)发病机理较为复杂,近年研究认为与造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)内在增殖或分化缺陷,造血微循环系统异常及机体免疫功能紊乱有关,三种机制在不同个体单独或联合作用,导致造血功能衰竭。目前认为,AA是一种以造血系统为靶目标的自身免疫性疾病,其中T细胞的功能异常发挥着关键作用。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是来源于骨髓基质的一类具有自我更新能力和具有免疫调节作用的干细胞,许多临床研究报告指出,MSC可以治疗一些自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮、硬皮病,移植物抗宿主病(GVHD)等。目前研究发现MSC调节免疫反应的可能机制为:MSC具有独特的免疫表型,不表达MHCII分子和FasL,不表达或极低表达MHCI分子,不表达共刺激分子B7-1,B7-2,CD40,CD40L,因此它具低免疫原性,很难被免疫系统识别。体外实验表明,MSC能抑制T细胞在混合淋巴细胞培养或有丝分裂刺激下的增殖。而在细胞免疫应答时,环境中的可溶性外来抗原不能直接触发T细胞的免疫应答,是由抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)以特定的方式呈递给T细胞,而T细胞的激活和产生细胞因子与不同类型的APC相关。树突状细胞(dendritic cells,DCs)是目前已知体内功能最强的专职性APC,能够在体内外直接刺激初始型T细胞(naive T cells)增殖。MSC对AA患者T细胞增殖的影响国内仅见少量报道,而MSC是否通过调节DCs来影响AA患者T细胞的增殖,国内未见报道,其机制值得深入研究。 研究目的:(1)研究MSC是否对AA患者的T细胞具有抑制增殖作用;(2)探讨MSC是否通过调节DCs的分化成熟来影响AA患者T细胞的增殖。 研究内容:(1)将正常人骨髓的MSC与AA患者的T细胞共培养,流式细胞仪检测共培养前后的T细胞表面抗原和T细胞亚群的变化,以及免疫相关的细胞因子IL-2,IL-4,IL-10,IFN-γ在培养前后表达的变化(ELISA法),研究MSC对AA患者的T细胞活化和增殖的影响。(2)从正常人外周血单个核细胞诱导DCs,将未成熟DCs在脂多糖(LPS)刺激下与正常人骨髓的MSC共培养,检测有或无MSC共培养前后,流式细胞仪检测DCs表面抗原和共刺激分子CD80和成熟标记物抗原CD83的表达,研究MSC对DCs发育的影响。(3)将正常人外周血单个核细胞诱导DCs,在LPS的刺激下获成熟DCs后与正常人骨髓的MSC与共培养,DCs表面抗原和共刺激分子CD80和成熟标记物抗原CD83的表达(流式细胞仪),研究MSC对成熟DCs的影响。 研究方法:(l)体外分离培养正常人的MSC,观察细胞形态,同时用流式细胞仪检测其分子表面抗原CDl05,CD29,CD34,CD44,HLA-DR。(2)提取20例再障患者(未经抗胸腺球蛋白等免疫治疗)的外周血单个核细胞,用T淋巴细胞尼龙毛柱分离法提取T淋巴细胞。用流式细胞仪进行T细胞表面抗原和T细胞亚群的检测鉴定。(3)取健康人外周血,分离单个核细胞,在重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和重组人白介素-4(IL-4)的培养条件下制备DCs。在LPS诱导下获得成熟树突细胞,用流式细胞仪进行DCs成熟前后的表型鉴定。(4)用正常人骨髓MSC与再障患者来源的T细胞共培养,流式细胞仪检测T细胞亚群的变化,以及与免疫相关的细胞因子IL-2,IL-4、IFN-γ、IL-10的蛋白水平在共培养前后的表达(ELISA法)。(5)从正常人外周血单个核细胞诱导DCs,将未成熟DCs在LPS刺激下与正常人骨髓的MSC共培养,流式细胞仪检测有或无MSC共培养前后,DCs表面抗原CD1a、共刺激分子CD80和成熟标记物抗原CD83的表达。(6)将正常人外周血单个核细胞诱导DCs,在LPS的刺激下获成熟DCs后与正常人骨髓的MSC与共培养,在显微镜下观察细胞形态的变化,流式细胞仪检测DCs表面抗原CD1a和共刺激分子CD80和成熟标记物抗原CD83的表达。 研究结果:(1)正常骨髓间充质干细胞与AA外周血T淋巴细胞共培养后,流式细胞仪检测T细胞的CD8+细胞比例由(38.65士1.89)%下降为(29.69士1.62)%,CD4+细胞比例由(24.89士1.35)%上升至(34.89士1.89)%,差异具有统计学意义(P<0.05);ELISA检测IL-2蛋白水平由(38.89士4.36)?ng/L下降为(6.8士2.12)ng/L;IFN-γ由(38.46士1.64)ng/L下降为(6.62士1.78)

关键词： 慢性特发性血小板减少性紫癜   骨髓间充质干细胞   治疗   免疫调节   巨核细胞集落形成单位  

摘要： 目的体外探讨同种异体骨髓间充质干细胞( bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSCs)用于治疗慢性特发性血小板减少性紫癜(chronic idiopathic thrombocytopenic purpura, cITP)的可行性。 方法1.正常人BM-MSCs的分离、扩增;倒置显微镜下观察BM-MSCs的细胞形态和生长特性。***患者外周血单个核细胞( peripheral blood mononuclear cells ,PBMNCs)的分离、纯化与培养。3.同种异体BM-MSCs与经美洲商陆刺激的cITP患者PBMNCs细胞共培养,用MTT法检测共培养前后淋巴细胞增殖能力的变化;通过流式细胞仪检测各组淋巴细胞中CD19+CD5+B1淋巴细胞比例的变化; ELISA法检测各组细胞培养上清液中PAIgG的含量。4.在正常人骨髓巨核祖细胞集落培养体系中分别加入50%、25%或不加骨髓间充质干细胞培养上清( BM-MSCs -LCM),通过计数各组CFU-MK的个数,观察BM-MSCs–LCM在体外对正常人骨髓巨核祖细胞集落形成的影响。 结果1.正常人的骨髓MSCs呈梭形贴壁生长,能在体外连续传代,能冷冻保存;2、与对照组相比,与BM-MSCs共培养的cITP患者PBMNCs中淋巴细胞的增殖能力被显著抑制(P<0.01);3.与对照组相比,同种异体BM-MSCs能下调cITP患者外周血淋巴细胞中CD19+CD5+B1淋巴细胞比例(P<0.01),能显著抑制cITP患者外周血淋巴细胞分泌PAIgG(P<0.01)(PBMNCs: BM-MSCs=10:1);4.发现在体外培养实验中BM-MSCs–LCM对CFU-MK的生成并无明显影响( P>0.05)。 结论1.正常人骨髓间充质干细胞能显著抑制由美洲商陆(PWM)丝裂原刺激引起的cITP患者外周血淋巴细胞的增殖;能显著抑制cITP患者外周血B淋巴细胞分泌PAIgG;能显著下调cITP患者外周血淋巴细胞中CD19+CD5+B1细胞的比例。***-MSCs -LCM对体外正常人骨髓巨核祖细胞集落形成无明显影响。3.我们的体外实验表明同种异体BM-MSCs具有治疗cITP的可能性。

关键词： 间充质干细胞   脑源性神经生长因子   酪氨酸激酶B   阿尔茨海默病   pIRESneo质粒  

摘要： 研究目的：1.建立大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外分离、扩增方法;2.探索携带BDNF的高拷贝质粒的构建以及转染骨髓MSCs的方法;3.探讨经侧脑室移植骨髓MSCs、空质粒修饰骨髓MSCs、BDNF修饰骨髓MSCs对AD大鼠行为学、海马CA1区组织病理学改变的影响;4.探讨经侧脑室移植骨髓MSCs、空质粒修饰骨髓MSCs、BDNF修饰骨髓MSCs对AD大鼠海马区BDNF、TrkB表达的影响。 研究方法：1.取SD大鼠股骨骨髓,经贴壁筛选法进行体外培养,采用免疫荧光方法鉴定骨髓MSCs表面的抗体CD29,CD44,CD34;2.将pEGFP-BDNF质粒进行改造与pIRESneo相连结,构建携带BDNF的高拷贝质粒pIRESneo-EGFP-BDNF,采用电穿孔技术转染骨髓MSCs,经G418筛选,通过倒置荧光显微镜在蓝色光下激发绿色光判断转染效率,采用Western blot方式判定转染细胞是否表达BDNF蛋白;3.40只健康雄性成年SD大鼠随机分为Sham组,AD组,MSCs组,CON组,BDNF组。采用双侧海马注射Aβ25～35诱导AD大鼠模型,经侧脑室移植骨髓MSCs、空质粒修饰骨髓MSCs、BDNF修饰骨髓MSCs观察对AD大鼠在定位航行试验以及空间探索试验中行为学改变,光镜下海马CA1区HE染色、尼氏体染色的变化以及电镜下海马CA1区神经元及突触超微结构的变化;4.采用RT-PCR及Western blot方式,观察经侧脑室移植骨髓MSCs、空质粒修饰骨髓MSCs、BDNF修饰骨髓MSCs对AD大鼠海马区BDNF、TrkB表达的影响。 结果：***大鼠长骨骨髓经过贴壁培养获得的细胞具有MSCs的表型,并且经过反复贴壁传代获得纯度较高,活性较好的MSCs;***-EGFP-BDNF经过双酶切鉴定,携带EGFP及BDNF基因,以EGFP基因为报告基因,质粒构建成功：通过电穿孔技术以及G418筛选,明显提高pIRESneo-EGFP-BDNF转染骨髓MSCs的效率;***水迷宫实验结果提示：AD组与Sham组大鼠比较平均逃避潜伏期（AEL）延长、跨越平台次数明显减少（P＜0.05或P＜0.01）, MSCs组、CON组、BDNF组与AD组大鼠比较AEL明显缩短、跨越平台次数显著增加（P＜0.05或P＜0.01）, BDNF组与CON组或MSCs组大鼠比较AEL显著缩短（P＜0.05或P＜0.01）,跨越平台次数明显增加（P＜0.05）,而MSCs组与CON组比较无统计学意义（P＞0.05）;病理组织学结果;AD组大鼠海马CA1区神经元细胞数目减少,细胞排列不整齐,细胞器损害较重,突触小泡减少,突触间隙模糊,突触数目减少;MSCs组、CON组、BDNF组SD大鼠海马CA1区锥体细胞带保持较好的完整性,细胞排列较整齐,细胞器超微结构损害较轻,突触小泡及突触数目减少有所减轻,突触间隙比较清楚,以BDNF组改善更为明显;4. RT-PCR结果表明：各组大鼠海马组织中均表达BDNFmRNA、TrkBmRNA, AD组与Sham组比较表达量明显减低（P＜0.01）;MSCs组、CON组、BDNF组BDNFmRNA、TrkBmRNA的表达均较AD组明显提高（P＜0.01）,其中CON组与MSCs组比较无明显差异（P＞0.01）,而BDNF组与CON组或MSCs组比较表达均显著提高（P＜0.05）;Western blot结果表明：各组大鼠海马组织中均表达BDNF蛋白、TrkB蛋白,AD组与Sham组比较表达量明显减低（P＜0.01）;MSCs组、CON组、BDNF组BDNF蛋白、TrkB蛋白的表达均较AD组明显提高（P＜0.01）,其中CON组与MSCs组比较无明显差异（P＞0.01）,而BDNF组与CON组或MSCs组比较均显著提高（P＜0.05）。 结论：1.通过体外贴壁筛选法扩增培养,获得大量纯度较高、活性较好的骨髓MSCs;2.电转染是很好的基因转染干细胞,提高转染效率的方法,使用电转染方法转染骨髓MSCs可以提高转染效率;3.双侧海马注射Aβ25～35成功诱导AD大鼠模型,方法简单,成功率高;经过侧脑室移植BDNF修饰骨髓MSCs或MSCs可以提高AD大鼠学习记忆能力,减轻大鼠海马CA1区的神经元及突触的损伤,以前者改善更为明显,因此认为BDNF在神经修复中起着重要作用;4.经侧脑室移植BDNF修饰的骨髓MSCs或骨髓MSCs干预AD大鼠模型,可以提高海马区BDNF、TrkB的表达,以前者更为明显,有可能是干预治疗AD的机制之一。

关键词： 骨髓间充质干细胞   脊髓损伤   血管生成素-1   神经特异性巢蛋白   皮层体感诱发电位  

摘要： 目的：(1)分离、培养及鉴定SD大鼠BMSCs,将其诱导分化为Nestin阳性的BMSCs,并通过分子生物学技术将Ang-1基因转染入细胞内；(2)构建SD大鼠T10脊髓钳夹损伤模型,评估其可行性；(3)通过Ang-1基因修饰的Nestin阳性BMSCs局部注射对损伤脊髓进行治疗,检测Nestin阳性的BMSCs是否能够分化为神经元细胞,检测Ang-1对移植入体内的Nestin阳性的BMSCs,新生及损伤后残留的神经元细胞是否具有保护作用。 方法：(1)采用全骨髓差速贴壁分离培养法将SD大鼠双后肢股骨、胫骨骨髓内的BMSCs进行分离培养。通过显微镜下观察细胞生长性状；流式细胞仪检测其细胞表面标志物CD29、CD34、CD45和CD90的表达；向成骨样细胞、成脂肪样细胞及成神经样细胞分化证明其具有多向分化潜能；同时将BMSCs诱导分化为Nestin阳性的BMSCs,并通过腺病毒载体将Ang-1基因转染入Nestin阳性的BMSCs中,Weston blot检测转染后的细胞是否表达Ang-1。(2)构建SD大鼠T10脊髓钳夹损伤模型,造模后1周内通过运动功能评价、神经电生理检测及组织病理学检测等方法检测模型的可行性；(3)造模后1周对随机分组的大鼠实施局部注射移植细胞进行治疗,在随后的1～4周内通过运动功能评价、神经电生理检测及脊髓组织的免疫组织化学检测等方法检测Ang-1基因修饰的Nestin阳性BMSCs对损伤后脊髓的相关作用。 结果：(1)通过全骨髓差速贴壁分离培养的BMSCs增殖速度快,扩增能力强,传代培养3代后细胞可获较高纯度；通过流式细胞仪检测细胞表面标记物,细胞表达CD29和CD90,阳性率均达99%以上；在体外通过诱导分化后细胞可分化为成骨细胞、成脂肪细胞及成神经样细胞；通过Weston blot检测转染后的Nestin阳性BMSCs出现Ang-1条带。(2)造模后1周内,大鼠出现明显截瘫(BBB<4分),经神经电生理检测无法引出CSEP波形,脊髓组织出现大量炎性细胞浸润,脊髓空泡变性。(3)移植后1-4周,A组大鼠后肢神经功能无明显变化,B、C组大鼠均有不同程度的恢复,C组较B组明显(P<0.05)；神经电生理检测,C组亦明显优于B组(P<0.05)；损伤脊髓经免疫组织化学染色后,B、C两组均表达BrdU、Nestin、NSE,随着时间的延长,阳性细胞数逐渐减少,但移植4周后C组仍保持一定量的阳性细胞,且明显多于A、B两组(P<0.05)。C组还可观察到BrdU阳性细胞向血管腔周围聚集。 结论：(1)通过全骨髓差速贴壁分离培养法能够获取较高纯度的BMSCs,细胞具有多向分化潜能,经神经诱导后,细胞能分化为Nestin阳性BMSCs,通过分子生物学技术,Ang-1基因转染入Nestin阳性BMSCs中获得成功。(2)成功构建SD大鼠T10脊髓钳夹型损伤模型。(3)经Ang-1基因修饰后的Nestin阳性BMSCs移植入体内后能进一步分化为成熟的神经元细胞,同时其分泌的Ang-1对Nestin阳性的BMSCs、新生及残留神经细胞具有保护作用,对脊髓损伤具有一定的修复作用。

关键词： 间充质干细胞   心肌梗死   治疗   实验研究  

摘要： 目的:用超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide, SPIO)标记的乳猪骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs),分别通过冠脉途径和外周静脉途径移植治疗小型猪急性心肌梗死,观察MSCs是否能够迁移至心肌梗死的部位,是否能存活及能否转分化为心肌细胞,为临床应用MSCs治疗急性心肌梗死提供参考。 材料与方法 10头贵州种乳猪,取其双侧股骨、胫骨、肱骨和尺骨,采用直接贴壁法从其骨髓中分离和培养MSCs。 11头贵州种小型猪,在介入引导下将丝线线段推送到左冠状动脉前降支或回旋支远端,建立急性心肌梗死模型。手术成功的小猪于术前和术后24h抽血行实验室检查(检测心肌酶谱及肌钙蛋白水平),手术前后并做超声心动图和MRI检查,以确定建模是否成功。 MRI检查:扫描序列包括:FIESTA两腔心长轴位、四腔心长轴位及心脏短轴位,Fiesta和Tags序列轴位动态扫描,平扫Double、Triple序列,Gd-DTPA灌注扫描及延迟扫描,延迟期Double及Triple序列扫描。灌注扫描参数:扫描参数:TR:8.2ms,TE:2.6ms,TI: 167.4ms,经耳缘静脉快速推注Gd-DTPA 0.1mmol/kg,注射速度4ml/s,推注造影剂同时启动扫描。FIESTA和平扫Double、Triple序列观察心脏大小、形态及信号;Fiesta和Tags序列观察室壁运动情况;灌注扫描观察有无灌注缺损或延迟灌注,最大灌注斜率、峰值信号、达峰时间。延迟扫描及延迟期Double、Triple序列扫描观察有无延迟强化。作术前、术后自身对照。 8头建模成功的小猪,以其中2头为对照组,6头为治疗组(其中3头为冠脉移植组,3头为静脉移植组)。治疗组用SPIO标记的第二代乳猪MSCs分别通过冠状动脉途径和外周静脉途径移植,每头小猪接受细胞移植数量约1×107,移植时间为栓塞后7～10天。对照组不接受治疗。 对照组栓塞后5周、治疗组细胞移植后4周,将小猪全部处死,所有小猪术后总生存时间一致。取出心脏,观察心脏大小、形态,梗死的位置和范围,比较MRI表现与大体病理是否符合。HE染色后显微镜下观察,比较对照组和治疗组梗死瘢痕区微血管密度。普鲁士蓝染色观察治疗组瘢痕区有无MSCs;免疫组织化学检测肌钙蛋白表达情况(用SP三步法)初步判断MSCs是否转分化为心肌细胞。 结果 1、用贴壁法分离和培养MSCs,随更换培养液次数和传代次数的增加,造血细胞逐渐减少,MSCs纯度提高,形态趋于一致,呈梭形,分布均匀。 2、11头小型猪,1头因股动脉痉挛穿刺失败,1头在术中发生室颤死亡,1头于术后第2天死亡,其余8头建模成功。术前、术后实验室检查及超声心动图检查心功能(主要指标取射血分数和短轴缩短率)结果比较,P值均<0.05,具有统计学意义。 3、MRI检查:术前心脏大小、形态、运动及信号未见异常,室壁灌注均匀,无延迟强化。术后心脏大小、形态无明显改变,梗死部位运动减弱或消失;平扫梗死部位有3例(3/8)在FIESTA序列呈稍高信号,其余信号无明显改变, Double及Triple序列8(8/8)例均呈稍高信号;灌注扫描梗死部位均呈低灌注,延迟扫描有强化,延迟期梗死部位Double及Triple序列呈明显高信号。MRI显示梗死部位及范围与大体病理一致。 4、HE染色,冠脉移植组瘢痕区微血管密度明显增加,高于静脉移植组,对照组瘢痕区仅有少量新生血管。普鲁士蓝染色,治疗组在瘢痕区见胞质内有蓝色颗粒的细胞,其中冠脉组多于静脉组,而对照组无此类细胞。免疫组织化学检查肌钙蛋白表达情况:治疗组瘢痕区散在有肌钙蛋白呈强阳性表达的细胞,其中冠脉组阳性表达高于静脉组。对照组未见阳性表达细胞。 结论:用同种异体(乳猪)的MSCs通过冠脉或外周静脉移植途径治疗小型猪心肌梗死,部分MSCs能“归巢”到梗死部位并存活,其中部分细胞可能转分化为心肌细胞,并能促进微血管生成,其中冠脉途径效果优于外周静脉途径。本研究对异体MSCs移植治疗急性心肌梗死的临床应用有一定的参考价值。