关键词：
骨髓间充质干细胞
顺铂
化疗
大鼠
卵巢
摘要：
研究背景 卵巢早衰（Premature Ovarian Failure, POF）是指月经初潮正常或青春期延迟、第二性征发育正常的女性,在40岁以前出现持续性闭经和性器官萎缩,并伴有卵泡刺激素（follicle stimulating homone, FSH）和黄体生成素（luteinizing hormone, LH）升高、雌激素（estradiol）降低的综合征。原发闭经中POF占10%-28%,继发闭经中POF占4%-18%。国内报道发病率为1%-3.8%,国外报道POF发病率为1%,近10年来卵巢早衰在育龄妇女中的发生率有逐年升高且向低龄化发展的趋势。POF危害妇女健康,导致一系列生殖内分泌及健康问题。它们的确切病因不清,彻底治疗较为困难,已日益受到重视。 腹腔化疗（Intraperitoneal chemotherapy, IPC）是依据一些肿瘤嗜盆腹腔内种植转移的生物学特性,向腹腔内灌注抗癌药物,以治疗盆腹腔恶性肿瘤的-种区域性化疗方法,其在卵巢癌治疗上的应用已有40多年的历史。 顺铂（Cisplatin,CDDP）属重金属络合物药物,其抗肿瘤作用机理是将所含氮离子解离后与DNA形成单链内两点或链间的交叉联接,破坏DNA结构和功能,抑制细胞有丝分裂与增殖,为一种细胞周期非特异性药物,是目前应用最多的抗癌药,抗癌谱较广。顺铂的分子量较大（300）,在水中溶解度低,腹腔给药后腹腔液中药物有效浓度高,对腹膜刺激小,成为卵巢癌腹腔化疗中应用最广的化疗药物之一。 骨髓间充质干细胞（Mesenchyma stem cells, MSCs）的研究已成为近年来一个热点。其在造血干细胞移植,移植物抗宿主免疫排斥反应（GVHD）,组织损伤与修复、炎症反应、心肌梗死、神经细胞再生中发挥了重要作用。骨髓间充质干细胞以其具有多向分化潜能、来源充足、体外易扩增、无免疫排异等优点,成为再生医学细胞移植治疗重要的种子细胞。 干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞,在一定条件下,它可以分化为多种功能细胞,根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。就分化能力而言,胚胎干细胞最具临床应用前景,但其来源不足、体外培养困难、定向诱导存在许多技术问题,用于临床存在伦理学问题;而成体干细胞来源丰富、取材方便,可避免社会伦理争论,因此,成体干细胞的研究和应用开发具有重大现实意义。造血干细胞和间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是主要的成体干细胞,其中,MSCs主要存在于结缔组织和器官间质中,以骨髓中含量最为丰富。 PKH26是一种高效脂肪族报告分子,这些分子顶端有荧光素或放射性同位素分子群,与细胞浆膜双脂层结合可达到标记细胞的目的,这种探针一旦与细胞膜结合便不易脱离。PKH26荧光染料的激发峰值在488mm,发射峰值在503nm。PKH26可被用于标记神经元细胞、神经胶质细胞、细菌、酵母、淋巴细胞、单核细胞、红细胞、内皮细胞,以及来源于肿瘤或正常组织培养的细胞。PKH26的荧光强度随着被标记细胞的分裂均匀地分配到子细胞中,流式细胞仪能容易地量化荧光衰减的程度。这种染料能高效监测造血干细胞在体内归巢、增殖。除暴露在激发灯光下PKH26标记的细胞会稍引起光毒性外,这种染料几乎对细胞无毒性作用。因此,适合作为一种报告分子来研究细胞在生物体中的分化、定位和转运等。 本课题拟通过摸索腹腔注射顺铂导致大鼠在体卵巢损伤的剂量,建立卵巢早衰的模型;建模后向早衰的卵巢内移植PKH26标记的骨髓间充质干细胞,以此观察骨髓间充质干细胞对化疗后大鼠在体卵巢功能的影响,以确定其对化疗后卵巢功能是否有一定的改善作用。 第一部分顺铂所致大鼠卵巢损伤动物模型的建立 目的： 观察不同剂量的顺铂（cisplatin, CDDP）引起大鼠在体卵巢结构和内分泌功能损伤的情况,确定一个适宜浓度,作为建立顺铂所致大鼠卵巢损伤动物模型的剂量,并用于下一步的实验研究。 方法： 以Wistar雌性大鼠为研究对象,把符合实验标准的56只大鼠随机分为4组,每组14只,分别为实验对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。于实验开始的第1、第8天给予低、中、高剂量组大鼠腹腔注射不同剂量的顺铂溶液3mg·kg-1、4.5mg·kg-1、6.0mg·kg-1),实验对照组于相同时间注射5%葡萄糖溶液1ml。给药后观察大鼠活动、进食、体重及动情周期,全部大鼠在不同时间点（第1次给药前、8d后第2次给药前、12d、30d、45d、60d、75d）经尾静脉取血1ml测雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）,同时于给药后8d、12d、30d、45d、60d、75d备组分别处死2只大鼠,取其卵巢行病理切片,观察卵巢形态学
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