关键词： 骨髓间充质干细胞   自体移植   脊髓损伤   骨髓间充质干细胞   脑神经损伤   自体移植  

摘要： 目的脊髓损伤(SCI)严重威胁人类健康,给家庭和社会带来沉重负担。对SCI的治疗包括外科手术、药物治疗以及康复训练等,但均作用有限。近年来,干细胞的临床应用给SCI的治疗带来了新希望,其相关研究备受关注。研究表明,骨髓间充质干细胞(MSCs)对SCI患者造成的神经功能缺失具有治疗作用,而自体MSCs有取材方便、无免疫排斥反应、不存在伦理道德问题等优点,已成为了研究的热点。但临床尚缺乏足够资料证实其疗效。本文首次报道采用自体MSCs经根动脉和蛛网膜下腔移植法治疗SCI患者,观察比较研究2种治疗方法的近期治疗效果以及治疗安全性。 方法选择经CT或MRI确诊并行手术或非手术治疗、暴力引起的、病程1月～2年、年龄15岁～60岁之间、无昏迷及其他并发症、能至少接受标准康复治疗一月、自愿并签署知情同意书的SCI患者26例,其中16例除做标准康复治疗外,接受干细胞移植治疗(8例为经根动脉途径移植治疗组,简称根动脉组;8例为经蛛网膜下腔途径移植治疗组,简称蛛网膜下腔组),10例为只做标准康复治疗的对照组病例。所有受试者标准康复治疗时间为一月,感觉、运动功能评定采用美国脊柱损伤协会(ASIA)与国际脊髓学会(ISCoS)制定的脊髓损伤神经学分类国际标准(第六版,2006)进行评定。两组在年龄、性别、病程、损伤程度等方面无统计学差异(均p>0.05),具有可比性。根动脉组与蛛网膜下腔组在标准康复治疗的基础上给予自体MSCs移植治疗,经髂骨穿刺采集自体骨髓,分离提取后经根动脉或蛛网膜下腔注入;对照组仅给予常规标准的康复治疗。根动脉组与蛛网膜下腔组于移植术前和后一月、对照组于标准康复治疗前和后一月进行运动与感觉神经功能评分、日常生活活动能力(ADL)评定。由两名非参与治疗的且经过专业训练的医师进行评估。 结果1)、神经功能评分变化:治疗后一月和治疗前相比,根动脉组患者浅感觉、深感觉及运动功能评分有改善,统计学处理后差异有显著性(均p<0.01);蛛网膜下腔组患者运动功能评分有改善,统计学处理后差异有显著性(p<0.01);对照组患者浅感觉评分有所改善,统计学处理后差异有显著性(p<0.05)。 2)、日常生活活动能力(ADL)评分:治疗后一月与治疗前相比,根动脉组与蛛网膜下腔组患者的ADL评分均提高,差异有统计学意义(均p<0.05);对照组ADL评分统计学差异没有显著性(P>0.05)。 3)、不同治疗途径的治疗效果比较:治疗后一月将根动脉组、蛛网膜下腔组与对照组之间的治疗效果进行比较,根动脉组和蛛网膜下腔组的浅深感觉、运动功能评分统计学处理差异没有显著性(均P>0.05);三组ADL评分统计学差异没有显著性(P>0.05);根动脉组与蛛网膜下腔组之间进行比较,浅深感觉、运动功能、ADL评分统计学差异也没有显著性(P>0.05)。 4)、不良反应:有1例经蛛网膜下腔治疗患者发生了术后的发热,原因不明,肌肉注射地塞米松后缓解,无复发。根动脉组患者未有任何不良反应出现。 结论自体MSCs经根动脉或蛛网膜下腔移植治疗SCI,术后一月患者的浅深感觉、运动功能及ADL评分有所改善,未有严重副反应发生,其中经根动脉途径移植治疗SCI为首次报道。临床初步研究表明:自体MSCs移植治疗SCI有一定的近期临床疗效,操作简便,安全可行,值得做大样本双盲多中心的进一步临床研究与探索。 目的初步观察自体骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗脑神经损伤的临床效果和存在的问题。 方法选取自愿并签署知情同意书的2例脑神经损伤患者(脑梗塞患者1例,脑干挫裂伤患者1例),首先抽取自体骨髓细胞悬液,在体外经过分离提取后,制成骨髓间充质干细胞悬液,经L4-5注入蛛网膜下腔,分离后剩余的血液立即经静脉回输给患者,术后常规标准康复治疗。采取手法肌力检查(MMT)进行肌力评定分级,日常生活活动能力(ADL)评定采用Barthel指数评分,偏瘫分级采用Brunnstrom偏瘫运动分级标准。 结果脑梗塞患者(病例1)自体移植MSCs术后1月功能评定无明显变化。脑干挫裂伤患者(病例2)自体移植MSCs术后1月ADL评分提高10分,Brunnstrom偏瘫分级右下肢提升1级;术后3月ADL评分提高15分,右上肢肌力提升1级,Brunnstrom偏瘫分级右侧手指与上肢分别提升了1级。 结论自体MSCs移植治疗脑神经损伤有一定的效果,本报告病例2的肌力评定、ADL评分、Brunnstrom偏瘫分级有所改善,治疗后无副反应发生。但是否真正为MSCs治疗所起的作用,还有待对比研究证实;对MSCs移植的时机、途径、个体差异、效果等还需更深入的研究与探讨。

关键词： 呼吸机所致肺损伤   骨髓间充质干细胞   干细胞移植   中性粒细胞  

摘要： 研究背景及目的 SARS、甲型H1N1流感病毒等引起的重症肺部感染可导致急性肺损伤(Acute lung injury, ALI)/急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome, ARDS)。由于ALI/ARDS病情危重、预后差,其救治已成为目前全世界的重点话题。目前对于ALI/ARDS在内的急、慢性呼吸衰竭患者的有效救治手段主要有机械通气、ECMO等。其中机械通气作为最主要的手段之一,其使用不当即可导致呼吸机所致的肺损伤(Ventilator-induced lung injury, VILI)。 虽然目前对于VILI的发生机制不完全清楚,但在VILI模型上可发现其病理上以弥漫肺泡损伤、肺泡—毛细血管渗透性增加并继发以中性粒细胞(Neutrophil, polymorphonuclear neutrophil, PMN)肺部浸润显著增加并伴随以BALF及全身循环中PMN升高为主的炎症反应等特征。既往研究显示PMN的过度激活可加重肺损伤,在VILI模型中PMN的过度激活与肺损伤程度密切相关,而针对PMN激活及其功能的各种干预手段[如中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)阻滞剂、PMN趋化因子MIP-2受体敲除等]可显著降低肺损伤的严重程度,故对PMN激活及其功能的干预有望成为防治VILI的有效手段。 骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs)是一种多能分化的干细胞,其在特定环境下可诱导分化为多种细胞(如软骨细胞、肌肉细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经细胞等)。在一些严重烧伤及损伤情况下使用MSCs时,MSCs可迅速趋向于损伤部位、获得一些损伤部位细胞的表型而发挥作用,且在肺损伤的研究中也显示其可获得肺部细胞表型、起到促进损伤修复等重要作用。此外,在脓毒症肺损伤的动物研究中显示MSCs使用可改善动物的预后,然而MSCs在VILI中使用是否也有类似作用目前仍缺乏相关报道。 MSCs具有抑制免疫活性的功能,这可能是其促进损伤动物组织损伤修复的一个重要原因。其中MSCs与循环中的PMN、巨噬细胞、淋巴细胞、DC细胞及自然杀细胞等的相互作用在MSCs发挥其损伤修复作用时具有重要意义。新近研究表面MSCs-PMN的体外细胞实验、动物实验结果均提示MSCs可抑制PMN的激活。然而,MSCs在VILI模型中是否也能抑制PMN的激活目前仍未知。 本研究假设MSC的输注可以通过调节PMN功能的激活在内的炎症反应和(或)通过MSC移植入肺并获得肺部细胞表型、重建损伤肺的结构及功能的途径进而减轻甚至预防大潮气量机械通气导致的肺损伤,对VILI模型起到保护作用。为此,本研究采用大潮气量机械通气来制备VILI模型,并在该模型中防治性使用MSCs以评价MSCs在VILI的作用。 第一章大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离、培养及鉴定 目的体外分离、培养雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并研究其生物学特性、表型特征及分化能力。 方法在无菌条件下取出雄性SD大鼠股骨、胫骨,用冰L-DMEM培养基冲洗骨髓腔,离心取有核细胞,采用密度梯度离心法结合贴壁法分离、纯化大鼠MSCs,用含10%胎牛血清的L-DMEM培养基培养MSCs,去除非贴壁细胞。待细胞铺满瓶底面积约90%时,按1：2进行传代培养。用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率(Annexin-V/PI法),以明确体外培养目标细胞的生长特征；用MTT法通过描述细胞生长曲线以评价目标细胞的增殖活性；用流式细胞仪(FCM)检测培养的目标细胞表面CD分子CD34、CD45、CD29、CD44的表达,以鉴定目标细胞的纯度；用软骨细胞基础培养基加转化生长因子—β诱导目标细胞分化为软骨细胞,用免疫细胞化学法观察诱导的细胞表达Ⅱ型胶原的情况,以明确目标细胞的定向分化能力。 结果从骨髓分离到的目标有核细胞大部分呈圆形,接种于培养基后72 h大部分细胞贴培养瓶壁、呈集落性生长,细胞形状变为梭形。培养10d-15d后,集落增多大部分融合成片并达到传代标准。细胞传代之后,细胞生长速度增快,约1周即可进行再次传代。在细胞传3代后,细胞形态仍为梭形、且形态较为均一。P3细胞中大部分细胞处于合成前期(G1期),其比例>80.0%；其次为处于DNA复制期(S期,约10.0%-12.0%)及DNA合成后期(G2期,约占6.0%-7.5%)的细胞,而静止期(G0期)及有丝分裂期(M期)的细胞占比例极少(G0+M期,约占0.0%-0.4%)；Annexin V/PI法检测目标细胞凋亡率均<5.0%。细胞在传代后第3d进入指数生长期,

关键词： 激素性股骨头缺血性坏死   骨髓间充质干细胞   自体骨移植   基因转染技术   VEGF165基因   动物模型  

摘要： 目的：探讨使用基因转染技术将VEGF165基因转染入造模后实验动物的骨髓间充质干细胞中并结合自体骨移植治疗兔激素性股骨头缺血性坏死。　　方法：　　1.成年新西兰大白兔（18～23周龄）42只，体重2.5±0.5kg。每只使用马血清10ml/kg，经兔耳缘静脉注射一次，间隔两周后再注射一次。两周后肌肉注射醋酸泼尼松龙8mg/kg，间隔一天注射一次，共5次。以最后一次注射激素4周后，随机处死2只实验动物检查造模情况。　　2.选取胫骨近端外侧，无菌条件下抽取5ml骨髓液，使用密度为1.073g/ml的Percoll分离液分离骨髓间充质干细胞并进行贴壁培养。检测造模后实验动物的骨髓间充质干细胞的增殖水平，并进行超微结构观察。　　3.根据随机区组设计原则将造模后的实验动物分A组（股骨头不作处理）;B组（行髓心减压+自体骨移植）;C（行髓心减压+骨髓间充质干细胞+自体骨移植）;D（行髓心减压+腺病毒转染骨髓间充质干细胞+自体骨移植）。每组10只实验动物。取髋关节后外侧切口暴露股骨头进行髓心减压，钻孔直径2mm，深4mm。分别对各组进行治疗。　　4.术后3周处死实验动物进行病理学、免疫组织化学检查及WesternBlot检测股骨头内VEGF的表达。　　结果：　　1.携带有VEGF165基因的腺病毒可以转染从造模后动物模型体内提取的骨髓间充质干细胞并可以表达目的蛋白。表达目的蛋白的量较正常细胞少，差别据有统计学意义。　　2.通过对实验各组进行病理学、免疫组织化学及WesternBlot检测我们发现：A组：空骨陷窝率（24.76±1.20％）;软骨下血管（2.27±0.84个）;VEGF平均灰度值（70.78±2.95）;VEGF阳性面积百分比（8.72±1.83%）;股骨头内VEGF的相对浓度（0.314±0.125）。B组：空骨陷窝率（21.82±1.78%）;软骨下血管（2.85±0.85个）;VEGF平均灰度值（61.07±2.91）;VEGF阳性面积百分比（14.82±1.44%）;股骨头内VEGF的相对浓度（0.664±0.090）。C组：空骨陷窝率（17.52±1.39%）;软骨下血管（4.26±1.03个）;VEGF平均灰度值（57.50±3.27）;VEGF阳性面积百分比（17.61±1.79%）;股骨头内VEGF的相对浓度（0.863±0.079）。D组：空骨陷窝率（12.92±1.79%）;软骨下血管（7.19±1.72个）;VEGF平均灰度值（49.20±1.91）;VEGF阳性面积百分比（21.99±2.14%）;股骨头内VEGF的相对浓度（1.029±0.097）。通过比较我们发现D组在软骨下血管、VEGF阳性面积百分比、股骨头内VEGF的相对浓度高于其他各组;在VEGF平均灰度值、空骨陷窝率低于其他各组，并且各组之间的差异具有统计学意义，说明D组的治疗具有一定效果。　　结论：　　1.兔激素性股骨头缺血性坏死实验动物体内的骨髓间充质干细胞可以作为基因治疗的受体细胞。　　2.这种转染后的骨髓间充值干细胞对兔激素性股骨头缺血性坏死具有一定的治疗作用。

关键词： 骨髓间充质干细胞   脑缺血再灌注模型   颈动脉   尾静脉   立体定向   移植途径  

摘要： 目的：分别采用颈动脉、尾静脉和立体定向三途径移植骨髓间充质干细胞(BMSCs)治疗大脑中动脉栓塞(MCAO)模型大鼠,比较三途径移植BMSCs对MCAO模型大鼠的疗效及其详细的作用机制。 方法：直接贴壁法分离培养、纯化和扩增BMSCs;流式细胞仪鉴定BMSCs表面抗原CD90、CD29、CD106、CD34、CD45、CD11b; 10μmol/L的Brdu标记示踪BMSCs;线栓法制作MCAO模型大鼠；经颈动脉、尾静脉和立体定向途径分别移植3×106 BMSCs治疗MCAO建模后第7天的SD大鼠；建模后第1、7、14、21、28、35天分别采用改良神经功能损伤评分(mNSS)、粘附实验和体重评估大鼠的神经功能和体能恢复情况；建模后第35天处死大鼠,取脑组织做组织学,免疫荧光及免疫组化染色：Bielshowsky's-Luxol Fast Blue双染检测神经纤维的再生情况；直接免疫荧光法检测Brdu标记的BMSCs;免疫组织化学检测大鼠脑组织NSE、Nogo-A、SYN、Ki-67、GFAP及VEGF表达。 结果:BMSCs贴壁生长,形态呈梭形,加入10μmol/L的Brdu孵育48h后BMSCs标记率达95.0±8.40%。BMSCs高表达CD90 (91.70%)、CD29 (88.40%)、CD106 (52.20%),低表达CD34 (2.70%)、CD45 (5.65%)、CD11b (7.82%)。与PBS对照组比较,颈动脉途径组的大鼠神经功能于建模第14天后显著好转(P<0.05),尾静脉和立体定向途径组于建模第21天后显著好转(P<0.05),且建模后第35天颈动脉途径组的大鼠神经功能显著优于其它两途径组(P<0.05)。三途径BMSCs移植组与PBS对照组比较,梗死侧胼胝体的面积均显著增大(P<0.05),且颈动脉途径组的胼胝体面积大于其它两途径组(P<0.05)。脑组织SYN、Ki-67、GFAP和VEGF的表达增多(P<0.05), Nogo-A表达降低(P<0.05), NSE无显著变化(P>0.05)。动脉途径组的SYN、Ki-67阳性细胞数显著高于尾静脉和立体定向途径组(P<0.05),同时Nogo-A的表达显著低于尾静脉和立体定向途径组(P<0.05)。三途BMSCs移植组的脑梗死体积和胶质瘢痕与PBS对照组比较无统计学差异(P>0.05)。脑组织的下述抗原阳性细胞数的相关性分析：GFAP与VEGF、GFAP与Ki-67呈高度正相关(r=0.725, r=0.742, p<0.05), Nogo-A与SYN呈高度负相关(r=-0.842,p<0.05)。 结论：不同途径移植BMSCs均能促进脑梗死大鼠的神经功能恢复,但动脉途径起效更快且后期疗效优于静脉和立体定向途径。BMSCs治疗脑梗死的作用机制可能包括促进内源性细胞增殖、血管再生和突触重建,增强神经纤维修复和星形胶质细胞保护功能。

关键词： 粒细胞集落刺激因子   骨髓干细胞   肝损伤   动员   移植   大鼠  

摘要： 目的：了解肝损伤大鼠在自体动员和移植骨髓干细胞后肝功能、肝病理变化情况,为临床应用提供实验依据.方法：将大鼠随机分为正常对照组和造模组.造模组采用腹腔注射四氯化碳的方法构建大鼠肝损伤模型,然后随机分为粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员组、干细胞移植组和模型对照组,G-CSF动员组采用注射G-CSF、干细胞移植组经门静脉输注骨髓间充质干细胞.比较两种治疗方法治疗肝损伤的效果.结果：治疗3周后,干细胞移植组的肝功能、肝病理变化较模型对照组明显好转,但G-CSF动员组效果不明显且两者均未使肝功能等恢复到正常.结论：骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠肝损伤,疗效好于G-CSF动员.

关键词： 骨髓间充质干细胞   肝星状细胞   肝纤维化  

摘要： 肝纤维化(hepatic fibrosis)是严重威胁人类健康的疾病之一,肝移植是目前最行之有效的治疗方法,但世界范围的肝源缺乏,导致学者努力向细胞替代方面加以探索.鉴于骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymalstem cells,BMSCs)的诸多优势,BMSCs在肝纤维化治疗上的应用价值已受到广泛关注,其优点已通过动物实验和临床研究初步证实,而关于细胞和分子层面的深层次机制,还有待进一步研究.我们结合参与肝纤维化的重要因素-肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs),就BMSCs治疗肝纤维化的研究现状作一综述.

关键词： 脑梗死后遗症   骨髓间充质干细胞   培养   移植   腰椎穿刺  

摘要： 背景:骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,而且取材方便,扩增迅速,免疫原性低,在移植过程避免了免疫排斥等反应,是治疗脑梗死等神经系统疾病的理想种子细胞。目的:探讨自体骨髓间充质干细胞培养后经腰穿治疗脑梗死后遗症的安全性、可行性及疗效。方法:6例脑梗死后遗症患者进行自体骨髓间充质干细胞移植,骨穿采集自体骨髓单个核细胞,体外分离培养骨髓间充质干细胞4d后经腰椎穿刺移植蛛网膜下腔,移植后观察疗效及并发症。结果与结论:培养后骨髓间充质干细胞数量明显增多,患者手术前后肌力和NIHSS评分通过统计分析有显著性差异(P<0.05),总体症状改善较术前有明显改善;移植后无严重不良事件发生。结果提示,自体骨髓间充质干细胞培养后移植治疗可使脑梗死后遗症患者症状明显改善,治疗安全有效且不良反应小。

关键词： 骨性关节炎   磁共振成像   骨髓间充质干细胞   膝关节   腔内注射   兔  

摘要： 背景:作者已对FS-3D-FISP序列诊断骨性关节炎做出研究评价,该序列对早期骨性关节炎的分级与病理有较好的一致性。目的:用骨髓间充质干细胞治疗兔早期骨性关节炎,运用MR观察软骨厚度及信号的改变评价治疗效果。方法:将新西兰大白兔随机分成对照组、骨性关节炎模型组和骨髓间充质干细胞组。骨髓间充质干细胞组在造模后第4周左膝关节腔内注射骨髓间充质干细胞。分别在术后第2周,1,2及3个月行膝关节核磁共振检查,每次每组随机选3只实验兔;扫描使用FS-3D-FISP序列测量膝关节软骨厚度,T2-FSE双回波序列测量T2值治疗前后改变,并取膝关节标本行病理观察进行Mankin’s评分,评价兔膝关节骨性关节炎治疗的效果。结果与结论:与骨性关节炎组相比,骨髓间充质干细胞组MRI示关节软骨厚度接近正常,T2值减低,无关节腔积液。提示MR显示膝关节软骨厚度及信号的改变可用于评价骨性关节炎治疗前后的改变。

关键词： 骨髓间充质干细胞   急性肺损伤   急性呼吸窘迫综合征  

摘要： 急性肺损伤／急性呼吸窘迫综合征是临床危重症之一，目前尚无特效疗法。骨髓间充质干细胞是多分化潜能的干细胞，可以归巢至肺脏并长期地定植，通过诱导分化，进行组织修复。骨髓间充质干细胞在受到损伤时释放，分泌大量免疫和营养相关的生物活性因子。在免疫调节中，抑制受损组织的淋巴细胞的免疫监视，逃避自身免疫，是异基因骨髓间充质干细胞广泛运用于临床治疗的基础，为急性肺损伤／急性呼吸窘迫综合征的治疗提供新思路。

关键词： 骨髓间充质千细胞   神经元样细胞   移植   脊髓损伤  

摘要： 目的：研究骨髓间充质干细胞源性神经元样细胞移植治疗成鼠脊髓损伤的可行性。方法：选取成年SD大鼠32只,两只用以提取骨髓间充质干细胞,其余被分为3组,其中细胞移植组10只,PBS缓冲液组10只,空白对照组10只。骨髓间充质干细胞分离传代培养并诱导成神经元样细胞后用Hoechst33342标记,损伤1周后采取静脉注射移植的方法移植于大鼠脊髓损伤区,移植六周后用免疫荧光方法检测细胞的存活及与宿主脊髓的整合情况。脊髓损伤后的16周对各组动物进行BBB评分,用SPSS12.0进行数据分析。结果：细胞移植组动物的BBB评分提高显著,于其他两组差异有统计学意义。细胞移植组免疫荧光显示,移植细胞在体内大量存活并桥接于脊髓损伤区的两端,存活的多数细胞神经元特异性标记物NSE、NF-200、星形胶质细胞特异性标记物GFAP表达呈阳性。结论：移植定向诱导的神经元样细胞有助于大鼠脊髓损伤后的功能恢复。