关键词： 皮肤创面愈合   骨髓间充质干细胞   血管生成   猪  

摘要： 目的检测骨髓间充质干细胞治疗猪全层皮肤缺损过程中相关促血管化因子表达及血管数量变化,探讨骨髓间充质干细胞对大面积皮肤缺损治疗的临床应用价值。 方法选择2头一岁龄滇南小耳猪,多次在麻醉下使用骨髓穿刺针由髂骨处按15-20ml/次抽取骨髓,采用密度梯度离心和细胞贴壁培养法联合筛选单核细胞层。使用含15%胎牛血清和1%双抗(青霉素和链霉素)的F-12培养基,放入95%饱和湿度,37℃的CO2培养箱中培养。首次72h换液,之后每日倒置显微镜下观察细胞形态,隔日换液。达到80%融合时按1：3传代,传至第三代,留取备用。 猪麻醉后采用自身配对设计,沿脊椎两侧旁开2.5cm按24个／每头预制作3cm×3cm正方形全层皮肤缺损创面。按是否使用干细胞分为实验组(A/B/C组)和对照组(a/b/c组)。实验组按植皮方式分为三组,即微粒皮+干细胞治疗组(A组)、小皮片+干细胞治疗组(B组)、单纯干细胞治疗组(C组),按1×107/ml密度于每个创面注射干细胞1m1。术后第7天、第14天分别取新生上皮和／或肉芽组织行免疫组织化学血管平滑肌肌动蛋白染色计数微血管密度,同时采用实时荧光多聚酶链反应(RT-PCR)检测血管内皮细胞生长因子、血管细胞黏附分子、血管生成素mRNA相对表达量。 结果干细胞移植治疗实验组对创面愈合均有促进作用①第14天时创面大体观可见实验组愈合情况均优于各自对照组,实验组中B组创面已愈合优于A组的部分愈合及C组的肉芽创面。②免疫组化染色可见肉芽组织或新生表皮下血管平滑肌肌动蛋白棕染阳性的内皮细胞团簇,计数微血管密度可知第7、14天时B组血管密度显著高于其他5组(P<0.05)。③RT-PCR检测采用2.△△ct相对定量法可知血管内皮细胞生长因子mRNA在第7天时高表达,第14天表达水平显著下降。第7天时各实验组均高于对照组,实验组中C组表达最高,其次是B组。血管细胞黏附分子、血管生成素表达变化趋势与血管内皮细胞生长因子相似。 结论骨髓间充质干细胞移植可能通过促进血管新生进而促进创面愈合,其主要机制可能是通过促进VEGF、VCAM、ANG三种目的基因的表达来实现的。但是单纯干细胞治疗还不能取代治疗。

关键词： 骨髓间充质干细胞   Ⅷ因子   创伤性脑损伤  

摘要： 目的移植大鼠原代骨髓间充质干细胞治疗创伤性脑损伤模型,探索该方法的疗效及临床可行性。方法体外培养大鼠原代骨髓间充质干细胞,造模成功7d后将其移植入受损脑组织边缘,移植后养育14d,神经功能评分后处死模型取脑组织,记录实验组及对照组(未移植干细胞)的神经功能评分、组织形态学、Ⅷ因子表达血管计数。结果实验组脑组织受损坏死区域较对照组小,受损周边脑水肿较轻;数据显示实验组神经功能恢复优于对照组,血管计数多于对照组。神经功能评分及Ⅷ因子表达血管计数提示实验组与对照组有统计学差异,实验组有明显疗效(P<0.05)。结论移植原代骨髓间充质干细胞治疗创伤性脑损伤能够帮助神经功能恢复,并促进血管生长。推测骨髓间充质干细胞通过促进血管新生帮助脑组织修复。实验验证最短培养周期的原代干细胞早期移植即可应用于治疗急性创伤性脑损伤。

关键词： 骨髓间充质干细胞移植   大脑中动脉梗塞   移植途径   神经功能重塑   细胞分化   神经营养因子   行为学研究  

摘要： 研究背景和目的 脑血管疾病(cerebral vascular diseases, CVD)是一种常见的高致残致死率的临床疾病,是中国人口总体第三位死亡原因,也是所有血管性疾病的首位致死原因。其中在我国缺血性脑血管病(ischemic cerebralvascular disease, ICD)占脑血管疾病70%左右,在欧美国家比例则高达85%。脑血管病是致残率很高的疾病。据统计,在存活的脑血管病患者中,约有四分之三不同程度地丧失劳动能力,其中重度致残者约占40%。因此,积极预防和治疗脑缺血性脑血管病,降低脑缺血病的死亡率和重残率具有重大社会意义。 目前,治疗ICD除了发病急性期3-6小时内的溶栓治疗外,尚没有更为有效的治疗措施。但由于溶栓治疗的严格时间窗限制,临床中符合治疗条件的病例即使在欧美发达国家占总病例的比例也非常低,因此,临床上大部分的脑缺血治疗方案为对症保守治疗,效果难以令人满意。近年,随着干细胞治疗在相关领域的进展,多种干细胞系被用于脑缺血疾病临床前研究,并且取得令人振奋的动物实验结果。越来越多的研究者积极推动这一研究成果向临床应用转化。目前,美国FDA批准的自体骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性脑卒中的ⅠⅡ期临床试验已经完成,证明了自体骨髓间充质干细胞经静脉途径移植治疗脑缺血的可行性和安全性。但是,大量与临床治疗相关的问题仍没有得到解决,包括治疗病人的选择标准,治疗窗的选择,移植途径对治疗效果的影响,以及一些治疗机制的深入研究。移植途径的选择是临床研究很重要的一个部分。虽然目前临床前动物实验证明了通过血管内移植、脑实质或脑室立体定向移植骨髓间充质干细胞治疗脑缺血都起到了改善神经功能恢复的作用,但是最优的治疗途径是那一种仍然不清楚,因此在相同条件下模拟临床可能的移植途径,研究各种移植途径对干细胞治疗的影响的临床前实验研究有着重要的现实意义。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一种具有自我更新、高度增殖和多系分化能力的细胞群体,近几年,在脑缺血疾病的临床前期研究中颇受重视,本课题组也在前期的研究中证明其对大鼠脑缺血疾病治疗的安全性及有效性,并对骨髓间充质干细胞的治疗机制进行研究。在之前研究的基础上,本组研究选取急性期(模型后24h)采用经颈动脉、股静脉、脑实质、脑室、腰蛛网膜下腔途径人骨髓间充质干细胞治疗大鼠脑缺血疾病,观察研究各种移植途径对骨髓间充质干细胞迁移行为以及治疗效果的影响,选取最优的移植途径,为干细胞治疗脑缺血疾病在临床的应用提供实验依据。 研究内容和方法 拟建立大鼠大脑中动脉梗阻(middle cerebral atery occlusion, MCAO)脑缺血再灌注模型,采用颈动脉、股静脉、脑实质、脑室、腰蛛网膜下腔途径移植hBMSCs的方法进行动态研究。课题研究共分为两部分。第一部分：利用免疫组化／荧光技术、Western blot技术以及动物行为学评价体系研究经由不同途径移植人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)到脑缺血大鼠脑内的细胞的存活时间、迁移、分化特点,并且研究移植途径对骨髓间质干细胞治疗效果的影响。第二部分：采用颈动脉途径移植人骨髓间充质干细胞治疗大鼠脑缺血,观察干细胞治疗后梗塞灶周围血管新生以及脑灌注及脑代谢方面的变化,从功能学及影像学等方面探索BMSCs治疗缺血性脑卒中的机制和依据。 研究结果 1.人骨髓间充质干细胞治疗大鼠缺血性脑卒中有效,治疗效果与移植到梗塞灶周围的干细胞(2w)空间分布和数量相关。 2.不同的细胞移植途径影响了干细胞在梗塞灶周围的分布模式和数量,进而影响了细胞移植的治疗效果。血管途径移植具有空间分布上的优势,而脑实质注射移植则具备了数量优势。 3.急性期(造模后24h)经由不同途径移植人骨髓间充质干细胞(1×106)治疗大鼠缺血再灌注损伤效果比较：A组优于BCDE;C组优于BDE;B组优于DE;E组治疗早期有一定治疗效果,4w时与对照组差异不明显。 4.经动脉途径移植hBMSCs能够在缺血再灌注大鼠脑内存活,细胞在移植后向梗死灶迁移,与梗塞灶周围血管关系密切。 5.体内实验中表明hBMSCs在大鼠脑内能够向血管内皮分化。 6.经动脉途径移植hBMSCs能够增加梗塞灶周围VEGF分泌,促进血管新生,改善梗塞灶周围血流灌注情况,增强局部脑组织代谢水平。 结论 BMSCs移植可以显著改善脑缺血大鼠神经功能的恢复;移植细胞在大鼠脑内可以向病灶周围迁移,但是细胞存活有一定时限性;BMSC在大鼠脑内可以表达与神经功能重塑相关的蛋白标记;不同的移植途径可以影响进入脑实质内干细胞的数量和空间分布模式,进而影响干细胞的治疗治疗效果;动脉

关键词： 间充质干细胞   硫化氢   预处理   同种异体   细胞移植   急性心肌梗死  

摘要： 急性心肌梗死(AMI)及其引起的心力衰竭是目前世界范围内危害人类健康的重要疾病,近20余年来以干细胞治疗为代表的心肌再生医学成为动物实验和临床研究的热点,干细胞疗法已成为治疗AMI最有前途的方法之一,但多项临床研究均提示骨髓干细胞治疗对AMI后心功能的改善非常有限。移植后干细胞存活率低下是制约干细胞治疗效果的重要因素。有研究表明移植4天后局部干细胞的存活率仅为0.44%,随着时间的进一步延长,干细胞在心肌局部的存活率继续显著降低。基于这些研究发现我们有理由相信提高干细胞的存活率无疑可显著提高干细胞的治疗效果。 硫化氢是继一氧化氮、一氧化碳后发现的存在于人体内的第三类气体信号分子。其参与体内多个生理过程包括细胞保护、血管新生、血管扩张及抗动脉粥样硬化作用。虽然其细胞保护作用在多种细胞中发现,但目前尚无硫化氢与干细胞相互作用的相关研究。 本文着眼于提高干细胞存活率这一影响干细胞治疗效果的重要因素,从硫化氢对骨髓间充质干细胞的可能作用入手,分为体内、体外两个主要部分探讨了硫化氢对骨髓间充质干细胞的保护作用及其机制。 本实验主要分为以下三个部分： 第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及纯化 目的：分离培养符合实验要求的大鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定,为此后进一步的实验研究奠定基础。 方法：全骨髓培养法培养大鼠骨髓间充质干细胞并传代培养,观察培养细胞的形态及生长过程。以流式细胞仪鉴定其表面抗原,并检测体外标准诱导条件下该类细胞向脂肪细胞分化的能力。 结果：原代细胞呈梭形或不规则形,贴壁集落生长。体外传代培养2代后细胞呈较均一性成纤维样,均匀生长。流式细胞仪检测细胞表面抗原,结果表明培养细胞强表达干细胞标记CD90,而少表达造血干细胞抗原CD34。标准成脂诱导条件下,油红染色证实其可向脂肪细胞分化。 结论：全骨髓贴壁培养法可获取较高纯度的大鼠间充质干细胞,满足体内外实验要求。 第二部分硫化氢对缺氧诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的保护作用及机制研究 目的：证实硫化氢预处理对缺氧诱导间充质干细胞凋亡的潜在保护作用,并初步探讨其机制。 方法：体外分离培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞；建立体外缺氧诱导细胞凋亡模型；给予或不给予细胞硫化氢预处理,缺氧诱导后流式细胞仪及荧光显微镜检测细胞凋亡,台盼蓝染色及CCK-8法检测细胞活力；荧光显微镜检测细胞内活性氧水平；Western blot检测pAkt、pErk1/2、peNOS、pFox01、pGSK-3β、Fox01、Akt、Erk1/2、Pim-1、Bcl-2及Bax的表达变化。划痕实验评价硫化氢预处理对间充质干细胞迁移作用的影响。ELISA法检测培养液上清VEGF水平评价硫化氢预处理对干细胞旁分泌的影响。 结果：无糖、无血清培养条件下缺氧6小时可成功诱导间充质干细胞凋亡；10-300μmol/L硫化氢预处理30分钟可浓度依赖性减少缺氧诱导的细胞凋亡；此后本实验采用200μmol/L硫化氢作为干预浓度；结果提示200μmol/L硫化氢预处理可明显减少缺氧条件下细胞凋亡,流式检测细胞凋亡率由25.45%降至14.09%(P<0.05),200μmol/L硫化氢预处理可增强细胞活力(台盼蓝染色：67%vs 46%,P<0.05;CCK-8:52% vs 38%,P<0.05),此外硫化氢预处理还可明显减少缺氧诱导的细胞内活性氧水平升高；Western blot表明硫化氢预处理可明显提高间充质干细胞内Akt,Erk1/2及GSK-3β的磷酸化水平；并且在缺氧培养条件下显著上调Pim-1、Bcl-2的蛋白表达,抑制Bax的蛋白表达,提示硫化氢可能通过PI3K/Akt及MEK/Erk1/2/GSK-3β途径发挥细胞保护作用。硫化氢预处理对间充质干细胞迁移无明显影响,而且我们也未观察到其对干细胞旁分泌作用的影响。 结论：硫化氢预处理可明显减轻缺氧诱导的间充质干细胞凋亡,增强细胞活力。这种保护作用可能是通过激活PI3K/Akt及MEK/Erk1/2/GSK-3β途径并减少细胞内活性氧水平实现的。 第三部分硫化氢预处理骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性心肌梗死的在体研究 目的：体外实验中硫化氢预处理可明显减少缺氧诱导的间充质干细胞凋亡,本部分实验主要研究硫化氢预处理是否可增强间充质干细胞治疗急性心肌梗死的疗效。 方法：体外分离培养、扩增雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞。采用结扎前降支的方法建立大鼠急性心肌梗死模型,造模成功后即刻用微量注射器在左室前壁沿梗死边缘多点注射1×106个细胞／100ul或等量PBS。动物实验主要分为两个部分：(1)雌雄不匹配心肌梗死模型在体评价细胞移植后细胞存活率：选择雌性S

关键词： 骨髓间充质干细胞   脑出血   移植  

摘要： [目的]观察通过自体骨髓间充质干细胞移植治疗脑出血的近期临床疗效。[方法]选取神经内科收治住院治疗的280例脑出血患者作为治疗组,行手术血肿清除术后,通过腰椎穿刺蛛网膜下腔注射自体骨髓间充质干细胞悬液3.5ml。选择同期入院300例患者作为对照组。分别于移植前后6个月进行神经功能缺损程度评定(NIHSS评分)和日常生活活动能力评定(Barthel指数),行颅脑MRI、血生化指标,监测干细胞移植的安全性。[结果]治疗组移植6个月后与对照组及移植前比较,NIHSS评分均有显著降低(P﹤0.01),Barthel指数均有显著升高(P﹤0.01)。移植后6个月随访,颅脑MRI及血生化指标均未出现明显异常。[结论]自体骨髓间充质干细胞移植治疗脑出血是安全可行的,且在近期内疗效确定,远期疗效尚待进一步观察。

关键词： 小脑性共济失调   骨髓间充质干细胞   动物模型   治疗机制  

摘要： 第一章:小脑性共济失调大鼠模型的行为学和病理学研究　　目的:评价海人藻酸(kainic acid，KA)损毁单侧小脑顶核制备的小脑性共济失调大鼠模型。方法:用KA毁损大鼠左侧小脑顶核(fastigial nucleus，FN)，制备单侧小脑性共济失调模型;用平衡木试验及旋转杠试验检测该模型的行为学改变，并在光镜下观察小脑组织KA注射位置及小脑病理改变。结果:KA损毁组模型动物在平衡木上得分减少，通过平衡木时间延长，在旋转杠上持续运动时间减少，与假手术组相比，差异有显著性意义(P＜0.05)。镜下观察KA注射位置准确，动物小脑左侧顶核神经元细胞破坏，其它周围组织未受影响。在一个月的检测期内，动物生存能力好。结论:用KA制备的大鼠小脑性共济失调模型适合后续的治疗研究。　　第二章:骨髓间充质干细胞治疗小脑性共济失调大鼠模型　　目的:探讨同种异体BMSCs移植治疗小脑性共济失调的疗效及可行性，及其在小脑性共济失调大鼠模型小脑中的分化及对小脑中神经递质的影响。方法:对所有大鼠进行行为学训练后进行KA毁损左侧小脑顶核手术，术后将行为学符合成模标准的动物随机分为BMSCs治疗组和PBS治疗组，取第四代BMSCs鉴定后进行原位注射移植，移植后第1到8周每周进行一次行为学检测，8周后取小脑行HE染色，尼氏染色观察组织病理，免疫组化观察BMSCs的分化，HPLC检测GABA和GLU的含量。结果:治疗后两组大鼠行为学检测无明显差异(P＞0.05)，两组间小脑毁损核团处神经元损伤情况无改善，BMSCs在小脑内可以少量分化为GABA能神经元，不能分化为GLU能神经元，少量表达NeuN和GFAP。两组间小脑内GABA和GLU含量差异无统计学意义(P＞0.05)。而1例接受BMSC移植的大鼠出现小脑新生物瘤。结论:单纯的BMSCs移植治疗对小脑性共济失调大鼠模型疗效不明显，且具有致瘤性，可行性不大。

关键词： 迷走神经背核   迷走神经离断术   凋亡   单核细胞趋化蛋白-1   诱导型-氧化氮合成酶   烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶   骨髓基质干细胞   CXC趋化因子受体4   基质细胞衍生因子-1  

摘要： 第一部分外周神经损伤后中枢核团的逆行性病变 目的 建立大鼠单侧迷走神经离断模型,观察建立模型后不同时间点迷走神经中枢背核神经元的变化,包括神经元形态学和数量的变化;观察建立模型后不同时间点迷走神经中枢背核诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（NADPH）的表达;观察建立模型后不同时间点迷走神经中枢背核单核细胞趋化蛋白一1（MCP-1）的表达,以此来观察外周神经损伤后除了神经损伤部位的功能和生化发生改变外,损伤神经的更高位的通路比如脊髓和中枢核团是不是也会发生逆行性的改变,并初步探讨神经递质NO在迷走神经损伤后中枢背核逆行性病变中的意义及炎性细胞因子MCP-1在中枢背核逆行性病变中所起的作用。 方法 1.选择健康雄性SD大鼠,体重220-280g,10%水合氯醛（0.3ml/kg）,腹腔内注射麻醉,固定大鼠,在颈部分离出左、右迷走神经,离断右侧迷走神经,左侧迷走神经则不做处理,随后缝合切口。对照组大鼠只分离出左、右迷走神经,但均不予切断,随后缝合切口。 2.选择健康雄性SD大鼠,按方法1建立迷走神经离断模型,分别于术后1d、5d、10d做进一步研究,每组3只大鼠,每只大鼠5片切片。用10%水合氯醛深度麻醉大鼠后,即刻打开胸腔,显露心脏,经左心室插入灌注管,快速肝素化,剪开右心耳,快速灌注4℃冰生理盐水150m1,再以40g/L多聚甲醛行心脏灌注,灌注结束后开颅取脑,解剖出脑干,标本收集于40g/L多聚甲醛液中过夜,然后置20%蔗糖多聚甲醛浸泡3.0-4.0h,再置30%蔗糖磷酸缓冲液浸泡沉底,4℃保持12h,随之取出用冰冻组织包埋剂包埋后置于液氮冷冻固定,随后用Leica全自动冷冻切片机切片,片厚20μim,切片放置室温下1h干燥固定后置于-20℃恒温冰箱保存。 3.取右侧迷走神经离断后1d、5d以及对照组大鼠左、右侧冰冻脑干切片,置于甲酚紫染色液（CFV）中行尼氏染色,观察建立模型后不同时间点背核区神经元细胞的组织形态学改变并行神经元计数。 4.取右侧迷走神经离断后5d、10d以及对照组大鼠左、右侧冰冻脑干切片,行一步法TUNEL荧光染色,观察建立模型后不同时间点背核区神经元有无凋亡发生。 5.取右侧迷走神经离断后5d、10d以及对照组大鼠左、右侧冰冻脑干切片,行免疫组织化学染色,观察建立模型后不同时间点背核区iNOS和NADPH的表达变化。 6.取右侧迷走神经离断后5d、10d以及对照组大鼠左、右侧冰冻脑干切片,行免疫组织化学染色,观察建立模型后不同时间点背核区MCP-1的表达变化。 结果 1.1背核神经元的免疫组化观察 对照组大鼠左、右侧背核神经元形态完整,以大中型细胞为主,分布均匀,形态规则,大多数神经元呈椭圆形或锥体形,部分神经元可见突起分支,胞质轻微染色,胞核未见明显显色;有少量较小的神经元细胞,形态规则,结构完整。 迷走神经离断后1d左侧背核神经元形态和分布与对照组相比,除染色稍微深之外无明显差异;但在右侧背核区,大多数神经元染色明显加深,不均匀分布,其中较大的神经元大多数明显皱缩,突起缩短或消失,胞质深染,部分神经元的胞核消失,部分较小神经元也表现出同样的变化,但神经元细胞的数量与对照组相比未见明显减少。 迷走神经离断后5d左侧背核区神经元与对照组相比无明显变化,但在右侧背核区,神经元数量较左侧及对照组相比则明显减少,并有较多深染、胞膜皱缩的较小的神经元出现。 1.2背核神经元计数 为确认迷走神经离断后背核区神经元的死亡情况,模型组和对照组大鼠每只选5个切片,计数神经元数量。对照组大鼠左、右侧背核神经元计数分别为53±4/片和51±5/片;建立模型后1d大鼠左侧背核神经元数量为52±4,与对照组比无统计学意义,而右侧背核神经元数量为46±3,与对照组及同时间点左侧相比数量明显减少（p＜0.005）;建立模型后5d左侧背核神经元计数为51±6/片,与对照组比无统计学意义,而右侧背核神经元数量为35±5/片,与对照组及同时间点左侧相比数量明显减少（p＜0.01）。 2 TUNEL染色结果 对照组大鼠右侧背核区未见TUNEL阳性神经元,荧光强度深浅一致。 右侧迷走神经离断后5d大鼠右侧背核区,可见少数TUNEL染色阳性神经元出现,表现为染色明显增强,荧光更为明亮,均匀一致的团块样结构。 右侧迷走神经离断后10d的大鼠右侧背核区未观察到TUNEL染色阳性神经元,同时神经元细胞的致密程度较对照组相比有所减弱。 3 iNOS免疫组织化学染色结果 对照组大鼠左、右侧背核区均未见iNOS染色阳性神经元。 右侧迷走神经离断后5

关键词： 大鼠   后肢缺血   血管内皮生长因子-165基因   骨髓间充质干细胞  

摘要： 目的：检测分析携人血管内皮生长因子-165基因骨髓间充质干细胞对大鼠缺血后肢的治疗效果,为下肢缺血的临床治疗提供新思路。 方法：本实验设立三个实验组,分别为转染hVEGF-165基因BMSC组、BMSC组、空白对照组,每组有效样本8例,共48条肢体。采用结扎SD大鼠腹主动脉分叉处上方建立缺血模型,并通过术后观察、DSA血管造影、测股动脉血流速度及阻力检测鉴定；通过慢病毒介导hVEGF-165基因转染大鼠骨髓间充质干细胞,GFP荧光蛋白标记,荧光显微镜下检测hVEGF-165基因转染率；再采用大鼠后肢肌肉多点注射方法将1X106/ml浓度的干细胞移植到缺血的肢体内,一个月后通过观察、DSA血管造影、测股动脉血流速度及血流阻力检测疗效。 结果：1、荧光显微镜下检测慢病毒介导hVEGF-165基因转染BMSCs阳性率可达85%以上；2、采用结扎腹主动脉法制作缺血模型,术后30天所有大鼠出现跛行,足趾坏死,绝大部分大鼠肢体出现缺血性溃疡。彩色多普勒超声、后肢血管造影等检查显示结扎术后实验大鼠后肢血流、阻力指数显著下降,血管密度显著减少。3、移植术后30天检测疗效,大鼠后肢血流速度、阻力指数与微血管密度转基因BMSC组、BMSC组均明显高于空白对照组,而转基因BMSC组高于BMSC组(p<0.01)。 结论：慢病毒载体介导hVEGF-165基因转染BMSC阳性率高；采用SD大鼠腹主动脉分叉处上方结扎法制作后肢缺血模型缺血效果明显,持续时间长；相同移植条件下的携hVEGF-165基因BMSCs、单纯BMSCs均能改善缺血后肢的血供,但转染hVEGF165基因BMSCs促血管新生能力更有优势。

关键词： 骨髓间充质干细胞   脑挫伤   诱导   移植   神经元特异性烯醇化酶   胶质纤维酸性蛋白  

摘要： 创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是中枢神经系统的常见病和多发病，对脑神经元、神经胶质细胞、神经纤维和脑血管等结构有直接破坏作用。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs）具有强大的增殖能力和多向分化潜能，体内移植可分化为神经样细胞，但BMSCs移植成活率低且较少转化为神经样细胞。川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）是临床治疗脑损伤的常用药品，已有报道川芎嗪可诱导BMSCs向神经样细胞转化，本研究旨在探讨应用川芎嗪联合BMSCs治疗脑损伤过程中BMSCs存活率及向神经样细胞转化率的变化。 首先进行BMSCs的分离培养及生物学特性的研究，采集Wistar大鼠骨髓，密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化BMSCs。细胞生长每达80%融合时按（1:2）比例传代，取第2、4、6代BMSCs，细胞计数板计数并绘制细胞生长曲线。BrdU标记细胞。取第3代BMSCs进行冻存复苏实验。取第4代BMSCs分别进行CD44、CD29、CD34免疫细胞化学和免疫荧光细胞化学双标检测。然后进行诱导BMSCs向神经样细胞分化的研究，实验设计分为4组，分别为空白对照组、川芎嗪诱导组、脑匀浆诱导组、川芎嗪联合脑匀浆诱导组。用Wistar大鼠制作Feeney’s自由落体撞击伤模型，并于24h后提取创伤性脑组织匀浆，取第5代BMSCs，接种于6孔培养板，待细胞生长达到70%融合时，吸弃培养基，按分组情况分别加入相应诱导培养基。继续培养3d后，各组分别取部分细胞进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫细胞化学与免疫荧光细胞化学双标检测，计数诱导后1d、2d、3d、7d神经样细胞数并计算细胞分化率。最后进行川芎嗪联合BMSCs治疗大鼠脑挫伤的研究，实验设计分为5组，分别为假手术组、模型对照组、川芎嗪治疗组、BMSCs治疗组、川芎嗪联合BMSCs治疗组。除假手术组外，其他各组按Feeney’s自由落体撞击伤模型造模。BMSCs移植前进行BrdU检测。按分组情况行给药与细胞移植治疗，BMSCs移植采用原路打开手术切口注入，川芎嗪采用腹腔注射。分别于动物模型制作完成8d、15d处死实验动物制作切片。取模型对照组切片进行HE染色观察创伤灶病理变化。除假手术组、川穹嗪治疗组外，其他各组均取部分切片进行BrdU免疫荧光组织化学检验并计数BrdU阳性细胞。各组另取部分切片进行GFAP免疫组织化学检验并计数GFAP阳性细胞数。对数据进行统计学分析。 结果发现，①BMSCs生物学特性的研究：生长曲线显示传代BMSCs具有细胞生长的典型特征，依次经历迟滞期、对数增长期及平台期；BMSCs冻存复苏率达（79.5±8.6）%；第4代BMSCs检测CD44、CD29呈阳性表达，CD34呈阴性表达。②BMSCs向神经样细胞分化的研究：除空白对照组外，其余三组均有NSE、GFAP阳性表达，联合诱导组分化率高于单独诱导组，最高达70.6%。③川芎嗪联合BMSCs治疗大鼠脑挫伤的研究：HE染色可见创伤性脑损伤典型病理现象，实验造模成功。BMSCs治疗组与川芎嗪联合BMSCs治疗组BrdU阳性细胞数统计学分析无明显差异（P>0.05）。各组均有一定的GFAP阳性表达，且联合治疗组GFAP阳性细胞数最多，达（32.15±4.38）个，与BMSCs治疗组相比较（26.31±3.65）有统计学意义（P<0.05）。 上述研究结果表明，川穹嗪及创伤性脑组织匀浆均可诱导BMSCs向神经样细胞分化，且联合作用诱导率更高。川芎嗪不能明显提高BMSCs体内移植的存活率，但可以提高BMSCs移植后损伤区附近星形胶质细胞的数量，这可能与川芎嗪提高BMSCs在体内向神经样细胞分化的效率有关。

关键词： 骨髓间充质干细胞   脊髓损伤   细胞移植  

摘要： 目的:通过损伤局部直接注射法、股静脉注射法和腰椎穿刺法三种途径移植骨髓间充质干细胞到大鼠脊髓损伤部位,观察骨髓间充质干细胞对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的影响,并比较、筛选适用于临床应用的移植途径。 方法: 1.取4只6周龄、体质量120-140g的健康SD大鼠,采用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,经过传代、扩增至第五代行流式细胞仪鉴定。在细胞移植前48小时进行Brdu标记,倒置相差显微镜下观察细胞形态。 2. 48只SD大鼠采用改良Allen’s打击法建立T10脊髓损伤模型,成功造模3天后随机分为四组。A组:模型对照组不行细胞移植;B组:直接注射组在脊髓损伤部位上下位点注射骨髓间充质干细胞至损伤大鼠体内;C组:通过股静脉将骨髓间充质干细胞移植到损伤大鼠体内;D组:通过腰椎穿刺将骨髓间充质干细胞移植到损伤大鼠体内。在细胞移植后3、7、14、21天四个时间点进行观察。 3.用运动神经功能BBB评分观察大鼠后肢功能状态恢复的情况。 4.在各时间点取大鼠脊髓组织,观察损伤区病理学改变,并用免疫组化的方法检测各组Brdu阳性细胞、Brdu+GFAP、Brdu+NF-200双染阳性细胞,用专业图像分析软件计算各组GFAP、NF-200表达的平均光密度值。 5.统计学处理:实验数据以均数±标准差记录,使用统计学SPSS16.0软件进行单因素方差分析,以P<0.05差异有统计学意义。 结果: 1.通过全骨髓贴壁法分离、培养的大鼠骨髓间充质干细胞在体外进行传代、扩增,第五代细胞形态呈长梭形,漩涡状排列,并且经过流式细胞仪检测证实分离培养的细胞为骨髓间充质干细胞。 2. A、B、C、D四组大鼠后肢运动功能逐渐恢复,在细胞移植7、14、21天后B、C、D三组的运动功能BBB评分较A组明显增高,而且B组评分高于C、D两组(P<0.01),D组运动功能评分高于C组(P<0.01)。 3. HE染色结果显示,模型对照组脊髓组织有较多坏死区域,神经元大量坏死,空泡较多,间质水肿明显,而其它三个实验组的坏组织死较小,空泡少,间质水肿较轻。 4. B、C、D三组在细胞移植后均发现Brdu标记的阳性细胞,各时间点的B组细胞数目要显著多于C、D两组(P<0.01),而且经腰椎穿刺移植的D组阳性细胞数要多于经股静脉移植的C组,差异具有统计学意义。在细胞移植后14天可以看到Brdu+GFAP双染阳性的细胞,而Brdu+NF-200双染阳性细胞出现在移植后21天,而且数量很少。使用专业图像软件分析得出:在细胞移植后GFAP和NF-200的平均光密度值都有增加,B、C、D三组与A组的差异具有统计学意义,而且三个实验组之前也有差异,B组的值高于C、D两组,D组要高于C组,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论: 1.用全骨髓贴壁法可以在体外分离和培养骨髓间充质干细胞; 2.直接注射、股静脉注射和腰椎穿刺三种途径移植的骨髓间充质干细胞均可在脊髓损伤处存活并可分化为神经元样细胞和星形胶质细胞,而且骨髓间充质干细胞有助于脊髓损伤神经功能的恢复; 3.通过三种移植途径综合评判和比较,细胞移植经腰椎穿刺途径要优于直接注射组和股静脉注射组,腰椎穿刺注射是一种袭性较小、较为理想的细胞植入方式,比较适合于临床应用。