关键词：
帕金森病模型
大鼠
骨髓间充质干细胞
酪氨酸羟化酶
Neurturin
基因修饰
多巴胺
3，4-二羟基苯乙酸
摘要：
帕金森病(Parkinson's disease, PD)是常见的神经系统退行性疾病,其基本的临床症状包括静止性震颤、僵硬、运动迟缓和姿势异常等。由于PD是一种逐渐进展的变性疾病,常导致多种运动障碍,且患病人数逐年增加,因此对社会和经济影响已经越来越大。其主要病理变化是黑质多巴胺(dopamine, DA)能神经元的变性,结果导致纹状体内DA及其代谢产物3,4-二羟基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid, DOPAC)含量明显减少。目前治疗PD的主要方法有药物治疗、手术治疗、细胞移植和基因治疗。药物和手术治疗对PD起到缓解症状的作用,不能延缓或阻止疾病进程。细胞移植治疗通过移植细胞替代损失的DA能神经元以恢复黑质多巴胺的神经传递,虽有效果但不持久。目前认为：理想的PD治疗方法应该不仅能纠正脑内DA含量的不足,而且能保护残留的DA能神经元,基因治疗是实现这一目标的最佳途径之一,已成为PD治疗的研究热点。
基因治疗通过把目的基因转染到细胞内再进行脑内移植或者通过质粒或病毒载体直接把目的基因转染到脑内病变部位。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)因来源丰富,取材简便,在体外易于培养和扩增,且自体移植克服了免疫排斥和伦理道德等特点,而成为理想的载体细胞。常用的外源基因主要包括促进DA合成的酶类如酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)、各种神经营养因子基因及抗凋亡基因等。其中TH是DA合成过程中的限速酶,是神经系统内DA能神经元的蛋白标志。研究发现把外源性的TH基因导入PD模型大鼠纹状体内,可增加脑内DA的水平,改善阿扑吗啡(apomorphine, APO)诱导的旋转症状,对PD有治疗作用。
Neurturin(NTN)在结构和功能上与胶质细胞源性神经营养因子(Glial derived neurotrophic factor, GDNF)有关,二者同属于GDNF亚家族,对DA能神经元具有特异性的营养、支持、保护和损伤修复作用。研究证实NTN在体内外都能促进胚胎中脑神经元的存活,阻止神经退行性病变的发生,是治疗PD的种有效的神经保护因子。
研究发现将TH或NTN基因修饰的细胞分别移植到PD大鼠脑内,均能明显改善PD大鼠的行为、提高纹状体内DA含量。但进一步研究发现单基因不足以维持DA水平及症状的持续改善,目前研究趋向于多基因共转染的治疗方法；研究发现与单转染TH组相比,将TH与AADC(芳香族氨基酸脱羧酶,DA合成过程中一种重要的酶)共转染PD大鼠纹状体后行为学改变较明显,且不依赖外源性四氢喋呤(BH4),而单转染TH组只有在外源性四氢喋呤(BH4)存在时才可检测到DA。本研究将TH和NTN结合起来进行基因治疗,设想此方法既可增加脑内DA的合成,同时又能保护DA能神经元,二者协同作用以达到双重治疗效果。而目前将TH和NTN双基因共转染BMSCs脑内移植治疗PD的研究国内外尚未见报道。
本研究首先利用密度梯度离心法对BMSCs进行体外分离、培养与扩增,研究其生物学特性、增殖情况以及相关特异性抗原的表达,以证实所培养的细胞为BMSCs;随后利用含有两个多克隆位点pIRES质粒,将TH和NTN基因串联起来的,构建TH和NTN双基因表达载体并转染到BMSCs中,获得稳定携带pIRES-TH-NTN的BMSCs,并测定TH-NTN-BMSCs中TH和NTN mRNA和蛋白的表达；最后将TH-NTN-BMSCs移植到PD大鼠纹状体区,观察对PD模型大鼠的治疗作用,并通过多种手段对移植前后PD大鼠行为学、特异性神经递质、组织学以及相关基因与蛋白进行比较分析,为PD的基因治疗探索一种新的有效的方法。本研究分为以下三个部分：
第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学鉴定
方法：
1.无菌条件下获取大鼠骨髓,密度梯度离心法分离BMSCs,进行原代培养。
2. BMSCs传代培养,采用MTT法测定其生长活性。
3.利用流式细胞技术和免疫细胞化学染色测定CD34和CD29分子的表达。结果：
1.接种后24h内,体积较大的圆型细胞开始贴壁生长：2-3d后细胞大部分贴壁,开始大量伸展；数天后,细胞增殖旺盛,从形态学上判断为BMSCs。
2.传代后细胞生长迅速,生长活性测定结果显示随着培养时间的推移,吸光度值逐渐增加,在培养第6-11d时,细胞增殖最为迅速。
3.流式检测CD34阳性率仅为2.40%,而CD29阳性率高达93.93％,免疫细胞化学检测CD29呈阳性,CD34呈阴性表达,利用排除法确定培养细胞为BMSCs。
第二部分TH
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