关键词： 骨髓间充质干细胞   贴壁培养法   密度梯度离心法   独参汤   骨髓间充质干细胞   心肌梗死   心功能   血管内皮功能   VEGF   ICAM-1   VCAM-1  

摘要： 第一部分:大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、培养及鉴定 背景:干细胞是一门新兴的技术,其在体外具有自我更新及多向分化的潜能,采用细胞移植的方法干细胞可以用于治疗多种难治性疾病。骨髓间充质干细胞是目前研究最多的干细胞,但它在骨髓中的含量极低,约每100,000个单核细胞中仅含有2-5个,这使科学研究受到极大限制,要想为实验研究提供所需数量及纯度的骨髓间充质干细胞,就需要对其进行有效的体外扩增。因此,使用有效的分离、纯化、培养的方法尤显重要。 目的:目前对骨髓间充质干细胞分离、纯化、扩增比较常用的方法有以下几种:贴壁培养法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法、免疫磁珠分离法、特制培养板筛选法和渗透压筛选法,且各有其优缺点。依据各方法之特点,结合研究需要,通过实验探索并验证行之有效的体外细胞分离、纯化、培养的方法。 方法:采用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合的方法对骨髓间充质干细胞进行体外培养。 1.每次取Wistar雄性大鼠1只,断颈处死,浸于体积分数为75%乙醇中10分钟,无菌条件下取出大鼠的股骨及胫骨,剔除骨表面附着组织,用无菌PBS将表面冲洗干净。除去骨的两端,使骨髓腔暴露,再将骨关节面祛除后用注射器（60mL）抽取无菌的PBS将骨髓腔多次反复冲洗干净。 2.将收集到的骨髓液加入预先加入50mL DMEM培养基的无菌离心管中,用注射器反复抽吸,将组织打散成为细胞悬液。在淋巴细胞分离液（1.077 Ficoll）上轻轻叠加刚得到的细胞悬液,离心20分钟（转速:2000r/min）,将单个细胞层吸取出来。用DMEM培养基将细胞漂洗两次,离心5分钟（转速:1000r/min）,弃去上清,留取细胞沉淀。然后向细胞沉淀中加入含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基。将细胞密度调整约为1×10～6/mL,接种于25cm2细胞培养瓶中,在恒温细胞培养箱（温度37℃,饱和湿度CO2体积分数为5%）中培养48小时后,更换培养基,除掉未贴壁细胞,之后每隔3天照此法换液1次。 3.在80%左右的原代细胞融合时予以传代,弃掉旧的培养基,用无菌的PBS漂洗3次后加入0.25%胰酶,室温下进行消化约5分钟,待细胞形态变圆时将其加到含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基中终止消化。用吸管轻轻吹打,再将消化液转入到15mL的无菌离心管中,离心10分钟（转速:1000r/min）。除去上清取出细胞沉淀,将其加入到含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基中,按照1:2的比例进行传代。鉴定:用流式细胞学对传代后骨髓间充质干细胞表面标志CD44、CD90、CD34、CD45进行检测。 结果: 1.骨髓间充质干细胞形态观察:新分离接种的细胞镜下观察呈圆形,数量较多,大小不一; 48小时后见多数细胞贴壁生长,呈圆形或椭圆形,体积增大,大多数细胞为单核细胞,此后梭形细胞逐渐出现;7天后细胞多呈梭形,可见明显集落形成,并随集落的不断扩大,融合呈漩涡状或放射状;原代细胞10天左右达85%以上融合,传代后细胞约1周左右达85%以上融合;传至5代细胞形态呈较一致的长梭形。 2.间充质干细胞流式检测: CD44阳性细胞占92.4%,CD90阳性细胞占88.9%,CD34阴性细胞占96.6%,CD45阴性细胞占95.6%。 结论:运用贴壁培养法和密度梯度离心法相结合的方法对骨髓间充质干细胞进行体外培养,可获得足够数量纯度较高的骨髓间充质干细胞。 第二部分:独参汤联合骨髓间充质干细胞对急性心肌梗死大鼠心功能的影响 背景:急性心肌梗死后心功能的改善程度直接关系到其预后,如何更好的改善心梗后心功能是目前热点话题。有研究发现,中药与骨髓间充质干细胞移植相结合可以起到协同增效、优势互补的作用,但选用何种中药对骨髓间充质干细胞进行干预能够对心功能起到更好的改善作用尚在探索之中。 目的:观察独参汤联合骨髓间充质干细胞对大鼠急性心肌梗死后心功能的影响。 方法:选择雌性清洁级Wistar大鼠40只,采用Olivette方法结扎左冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型。将造模后的大鼠随机分为4组:①急性心肌梗死对照组（ n=10）:大鼠心肌梗死后注射等量培养基;②干细胞组（n=10）:急性心肌梗死大鼠接受同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗（2×10～6 BMSCs /100μL,分4点注入）;③独参汤组（n=10）:大鼠急性心肌梗死后2小时开始灌服独参汤,每日二次,共用一周;④干细胞组+独参汤组（n=10）:大鼠急性心肌梗死后接受同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗（2×10～6 BMSCs /100μL,分4点注入）,2小时后开始灌服独参汤,每日二次,共用一周。分别于造模前及骨髓间充质干细胞移植后

关键词： 股骨头坏死   大转子骨瓣   骨髓间充质干细胞   临床研究  

摘要： 目的：对股骨大转子骨瓣联合骨髓间充质干细胞治疗股骨头缺血性坏死的临床疗效进行随访观察与总结,探讨股骨大转子骨瓣联合骨髓间充质干细胞治疗股骨头缺血性坏死,特别是早期或早中期(FicatⅡ-Ⅲ)的临床疗效。为临床进行此类手术提供理论及实践依据。 方法：2008年9月至2010年10月对22例(34髋)成人股骨头坏死(ONFH)患者施行股骨大转子骨瓣结合自体骨髓间充质干细胞移植治疗,并获得临床随访的患者按照国际分期标准(Ficat或ARCO)分期、分型进行回顾分析；应用Harris髋关节功能评分系统及手术前后Ficat分期改变予以影像学评价。将确诊的22例34髋患者随机分为治疗组(即应用大转子骨瓣结合骨髓间充质干细胞治疗)和对照组,对照组采用药物促进局部微循环并结合电刺激及高压氧,并配合药物外敷,治疗组和对照组全部患者有髋关节、膝关节疼痛,跛行18例,髋关节功能障碍13例。治疗组和对照组的发病年龄、Ficat分期和致病原因及病变分期等情况进行统计学分析具有均衡性,且表明具有可比性。 结果：对术后22例患者定期进行随访,随访时间3～24个月(平均]6.2月),治疗组髋关节疼痛缓解9例(82%),关节功能改善7例(64%),行走时间延长8例(73%)。术后效果满意率77.8%。术后髋关节保存率为73.0%～92.2%,其中创伤性及特发性术后髋关节保存率及髋关节功能改善较好,激素性及酒精性较差。治疗组与对照组比较,术后优良率与总有效率相比有显著性差异。 结论：施行股骨大转子骨瓣结合自体骨髓间充质干细胞移植治疗方法确实可靠,患者依从性较好,较对照组采用药物促进局部微循环并结合电刺激及高压氧,并配合药物外敷疗效为好,是一种治疗股骨头缺血性坏死,特别是FicatⅡ-Ⅲ期较为有效的治疗方法。

关键词： 骨髓间充质干细胞   肝硬化   大鼠   移植途径  

摘要： 干细胞具有很强的自我更新和分化的能力,在特定环境中可以定向分化为有功能的细胞。国内外的研究已经证实了干细胞在治疗器官损伤及细胞再生中能够发挥很独特的作用,干细胞的研究已广泛涉足到血液系统、骨骼系统、神经系统、心血管系统、消化系统等领域。成体干细胞包括造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。造血干细胞已经在血液疾病的治疗中发挥了很好的疗效,为研究者们对干细胞在再生医学的研究增强了信心,给许多疾病的治愈带来了新的希望。间充质干细胞可以来源于骨髓、脂肪、脐血等组织。其中骨髓间充质干细胞作为人体中的一种成体干细胞,数量多,获取方法简单,抽取过程及抽取完后对身体影响较小,逐渐被学者们和临床医生所重视。在特定的环境中,骨髓间充质干细胞可以分化为各种成体细胞,促进损伤器官的修复,改善器官的功能。 在肝损伤的修复中,干细胞可以转分化为肝细胞,分泌白蛋白,促进肝脏的修复,并改善肝脏功能。国内外基础及临床研究,已经证实了骨髓间充质干细胞移植对肝硬化、肝衰竭等疾病具有明确的治疗作用。目前,在我国、日本、欧洲等国相继已经开展了自体骨髓间充质干细胞对肝硬化的临床治疗,疗效确切,目前暂未发现明显副作用的报道。在临床运用中,有关学者及医生提出了关于移植途径的问题,常见有三种移植方式治疗终末期肝病,分别是门静脉途径、肝动脉途径、外周静脉途径,到底哪种途径移植干细胞的疗效更好呢?然而,关于这方面的报道较少,为此我们拟进行该问题的研究,阐明这三种移植途径是否对肝硬化治疗的疗效有影响。 为了模拟临床中的干细胞移植治疗肝硬化的特征,我们建立了大鼠肝硬化模型,并培养大鼠骨髓MSCs,通过常用的三种途径将骨髓MSCs移植到模型大鼠体内,移植后4周观察比较这三种途径移植骨髓MSCs对肝硬化模型大鼠的疗效差别,为临床应用提供参考。 研究方法: 1、购SD雌性大鼠,58只,200～230g,利用四氯化碳液体橄榄油混合液皮下注射和酒精喂养的方法,并逐渐增加四氯化碳和酒精的浓度,建立肝硬化大鼠模型。2月后将存活下来的肝硬化模型大鼠随机分为肝硬化未移植组(n=8)、门静脉移植组(n=8)、肝动脉移植组(n=8)、尾静脉移植组(n=8)。 2、取健康SD大鼠骨髓,利用全骨髓贴壁的方法原代培养骨髓MSCs。 3、取第3代骨髓MSCs,利用CM-DiI标记MSCs。 4、分别通过门静脉途径、肝动脉途径、尾静脉途径将标记好的MSCs移植到肝硬化模型大鼠体内。 5、移植后4周取肝组织行冰冻切片,Hoechst染核,激光共聚焦显微镜观察干细胞在肝脏的分布及数量。 6、取肝组织行HE和Masson染色,观察肝硬化程度。 7、检测血清白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、直接胆红素、间接胆红素、Ⅳ型胶原等指标。 研究结果 1、激光共聚焦显微镜观察MSCs在肝内分布情况 计数每个视野下定植于肝组织中MSCs数量,三种移植途径分别为:门静脉移植组22.80±2.12,肝动脉移植组25.04±2.36,尾静脉移植组23.36±4.07,无统计学差异(P>0.05),提示三种途径移植MSCs,经过4周后定植在肝脏的MSCs的数量无明显差异。 2、肝脏大体形态改变及病理学检查结果 (1) MSCs移植后4周,观察肝脏大体标本外观,见不同途径移植组的大鼠肝硬化程度均有所减轻;肝硬化未移植组的组织学仍呈现典型肝硬化改变。 (2) HE染色见移植后各组大鼠肝脏切片内肝细胞变性、坏死有所减轻,肝细胞索较规则,小叶结构稍变清晰,汇管区炎细胞浸润减轻。 (3) Masson染色见移植后各组大鼠肝脏假小叶数量减少,肝组织内纤维束减少、变细。但三种不同途径移植组的肝脏病理学改善程度无显著区别。 (4)根据Masson染色结果,按照Chevallier肝纤维化组织学半定量计分系统(SSS)评分,肝硬化未移植组:21.35±2.16,门静脉移植组:11.48±1.66,肝动脉移植组:11.46±1.02,尾静脉移植组:10.75±0.90,统计结果表明三种途径移植MSCs后的大鼠肝脏的纤维组织较未进行MSCs移植的肝硬化大鼠明显减少(P<0.05);但三种途径移植MSCs后的大鼠肝纤维化程度之间无显著差异(P>0.05)。 上述结果提示移植后,肝细胞损伤减轻,肝硬化程度有所改善,但三种不同途径移植组间改善程度无明显差异。 3、血清学检查结果 通过三种途径移植MSCs到肝硬化模型大鼠体内,4周后发现移植组模型大鼠的肝功能均得到明显改善,血清白蛋白较肝硬化未移植组显著

关键词： 急性肝损伤   肝纤维化   骨髓间充质干细胞   移植方法   动物模型   肝样细胞  

摘要： 【目的】　　在建立骨髓间充质干细胞体外培养及扩增体系的基础上，通过将其诱导分化为具有部分肝细胞功能的肝样细胞;以不同途径将所得肝样细胞移植入急性肝损伤模型大鼠体内，以比较选择最佳的移植方法，为临床治疗的应用探寻安全可行的途径;探讨干细胞移植治疗急性肝损伤并减轻受损肝纤维化的机制。　　【材料和方法】　　利用密度梯度离心法将雄性大鼠的BMSC由骨髓中分离，及培养、传代后，通过贴壁培养法进行纯化;利用细胞形态学及流式细胞仪观察检测BMSC的的干细胞潜能;通过在培养基中加入HGF、EGF及FGF-4将BMSC定向诱导分化为肝样细胞;利用免疫组化、免疫荧光染色以及RT-PCR检测分化所得细胞是否具有肝细胞功能;将经检测具有部分肝细胞功能的肝样细胞以腹腔注射（A组）、肝内注射（H组）及尾静脉注射（T组）等三种方式植入CCL4诱导的急性肝损伤大鼠模型体内，与假手术组建立对照研究;对比各组大鼠生存率，血清学检测比较肝功，并用DAPI荧光定位观察各移植组组移植干细胞在肝内定植情况;大鼠肝脏病理切片经HE染色、VG染色比较肝纤维化程度，并利用Scheuer评分法比较各组肝脏炎症活动度，免疫组化法检测α-SMA表达以比较HSC的激活情况;利用Real-timePCR、ELISA及原位凝胶酶谱等方法，探讨BMSC移植对受损肝纤维化修复可能的机制。　　【结果】　　1.大鼠BMSCs原代细胞经密度梯度离心法自大鼠骨髓中分离后，原代培养24h更换培养液时，可见细胞分布不均匀，在培养瓶底呈分片聚集，首次半量换液后每3d全量换液1次，7d后观察，细胞集落多，细胞规则，呈长梭形、椭圆形，折光性强，细胞间相互融合基本铺满瓶底。待大鼠BMSCs原代培养达80～90％融合后，经0.25％的胰蛋白酶消化后传代，经多次传代换液后，细胞形态均一，呈长梭形，轮廓清楚，折光性强，生长迅速，以栅栏状为主，少量集落排列呈漩涡状，传代细胞5d后即可铺满瓶底。流式细胞仪检测BMSCs标志物结果显示，我们培养出的BMSCs标志物CD29和CD90的表达率分别为95.4％±0.3％和93.7％±1.8％，CD34和CD45分别表达为1.1％±0.3％和42.8％±4.6％，符合BMSCs的细胞表型特点。BMSCs经三种生长因子联合诱导培养7d时可见白蛋白和甲胎蛋白免疫反应阳性细胞，细胞体积较大，呈不规则的圆形或卵圆形。荧光显微镜下，白蛋白阳性细胞呈红色荧光，甲胎蛋白阳性细胞呈绿色荧光。诱导分化所得细胞经RT-PCR检测ALB、AFP、CK-18mRNA的表达可发现，从培养1w起细胞开始表达以上三种肝细胞特异性蛋白，此后随时间逐步增强表达。　　2.荧光显微镜观察比较各移植组肝组织内移植细胞的荧光分布，发现T组即尾静脉注射组在定值数量及在肝窦的定植能力要好于其他2组。比较各实验组大鼠生存率，移植组大鼠死亡时间集中在移植后6h～24h内，24h～72h后仅C组仍出现大鼠死亡，移植组再未出现大鼠死亡;C组15只大鼠中存活9只;H组15只大鼠存活10只;T组15只大鼠存活12只;A组15只大鼠存活10只。在存活率上，C组与T组、H组、A组及各移植组间均无显著差异(P>0.05)。动态检测比较各组存活大鼠ALT、TBIL、ALB结果，各组大鼠移植后24h血清生化指标较造模前值均有明显改变，表现ALT和TBIL升高，ALB降低;术后4dT组指标均较C、H、A组有所改善，其中ALB、ALT改善更明显(P<0.05)，TBIL在数值上有改善，但统计学上无显著性差异。术后7d各组间血清生化指标统计学上无显著性差异。各实验组大鼠肝脏HE、VG染色结果显示T组肝脏纤维化程度明显轻于其他各实验组;各实验组肝损伤炎症程度(Scheuer评分法)及α-SMA免疫组化结果比较显示，T组Scheuer及α-SMA评分均值分别为0.33和0.42，较C组的3.44和2.11有显著差异(P<0.01);较H组的1.00和0.60无明显差异(P>0.05);与A组的1.80和1.50均有明显差异(P<0.05)。　　3.通过Real-timePCR检测比较我们发现，移植建组3d后，尾静脉移植组大鼠较肝内注射组、腹腔注射组大鼠肝组织中MMP-2,9、IL10mRNA含量增高明显(P<0.05)，而TIMP-1、IL-1β,-6、TNF-α及TGF-β1的增高明显低于其余两组(P<0.05)。动态检测各移植组大鼠建组后3d，7d，14d外周血中IL10含量，我们可以发现，尾静脉移植组大鼠外周血中IL10含量持续高于其余两组。通过原位凝胶酶谱我们发现，尾静脉移植组大鼠肝组织中MMPs的整体活性较对照组及其余两个移植组明显增强。　　【结论】　　***经诱导后可定向分化为具有部分肝细胞功能的肝样细胞，这为获得干细胞移植治疗肝损伤疾病

关键词： 骨髓间充质干细胞   门静脉   外周静脉   移植   肝硬化  

摘要： 研究背景与目的：终末期肝病严重危害人类健康,肝移植被认为是治疗终末期肝病最有效的方法,但因肝源、费用及抗排斥药物的不良反应等问题受到限制。干细胞移植治疗终末期肝病作为一种新方法显示出良好的应用前景。骨髓问充质干细胞(BMSCs)具有极强的自我复制能力和多向分化潜能,且低免疫源性,有望成为治疗终末期肝病的一种新型种子细胞。目前实验研究认为BMSCs参与受损肝组织的修复,但机制尚不明确,是否为多数研究者认为的干细胞跨胚层分化?目前国内外已有研究将干细胞移植治疗终末期肝病应用于临床,获得了一定疗效,但目前移植效率的问题,如移植途径是否影响移植效率,目前尚不清楚。因此本课题基上述两个问题,将采用体外诱导实验明确BMSCs是否可向肝样细胞分化,为体内干细胞移植治疗肝病终末期提供实验依据。借助动物模型经门静脉、外周静脉移植BMSCs,分析其定植情况及对肝功能的影响,明确两途径对干细胞治疗肝病疗效的影响,为临床研究提供实验基础。 方法：(1)本研究采用密度梯度离心法和贴壁细胞联合培养法分离骨髓间充质干细胞,经培养传代获得纯化的BMSCs。(2)将纯化后的BMSCs在肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor HGF)和成纤维生长因子-4(basic fibroblast factor FGF-4)的作用下进行诱导培养后,免疫细胞化学检测肝细胞表面标志物白蛋白、甲胎蛋白、角蛋白18的表达,明确BMSCs是否可分化为肝样细胞。(3)将CC14轮替注射大鼠四肢内侧皮下,建造肝硬化大鼠模型。将GFP标记后的BMSCs经外周静脉、门静脉移植入肝硬化模型大鼠体内,荧光显微镜检测干细胞在肝内的定植情况,检测血清肝功能及免疫组化检测肝组织白蛋白的表达情况。 结果：(1)采用密度梯度离心法和贴壁细胞联合培养法分离的骨髓间充质干细胞纯度高,体外培养增殖能力活跃。(2)大鼠骨髓间充质干细胞经HGF和FGF-4共诱导培养共28天,分别在14天、21天、28天免疫细胞化学检测肝细胞标志物。随着诱导时间延长,白蛋白及角蛋白18表达阳性率逐渐增加,甲胎蛋白表达逐渐降低。未诱导组白蛋白、角蛋白、甲胎蛋白表达阴性。(3)HE及Masson染色显示肝硬化大鼠模型建立成功。体外分离培养的骨髓间充质干细胞,经携带绿色荧光蛋白的慢病毒转染后在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达。经门静脉及外周静脉移植BMSCs28天后,两移植组大鼠肝脏组织切片均可见散在的绿色荧光蛋白阳性细胞,表明BMSCs移植后能定植于肝硬化大鼠模型体内。实验组各肝功能指标ALB、ALT、AST均随时间变化逐渐好转,门静脉实验组与其对照组比较各肝功能指标差异均有统计学意义,尾静脉实验组与其对照组比较各肝功能指标差异均有统计学意义,两实验组之间比较各肝功能指标差异均无统计学意义。免疫组化检测肝组织白蛋白表达,门静脉实验组与其对照组比较差异有统计学意义,尾静脉实验组和对照组比较差异有统计学意义,两实验组之间比较差异无统计学意义。 结论： 1.骨髓间充质干细胞在体外可分化成为肝样细胞； 2.经尾静脉、门静脉移植的骨髓间充质干细胞能定植于大鼠受损的肝脏内,骨髓间充质干细胞移植可在一定程度上改善肝功能； 3.尾静脉、门静脉移植干细胞治疗肝病的效率无差别。

关键词： 帕金森病模型   大鼠   骨髓间充质干细胞   酪氨酸羟化酶   Neurturin   基因修饰   多巴胺   3，4-二羟基苯乙酸  

摘要： 帕金森病(Parkinson's disease, PD)是常见的神经系统退行性疾病,其基本的临床症状包括静止性震颤、僵硬、运动迟缓和姿势异常等。由于PD是一种逐渐进展的变性疾病,常导致多种运动障碍,且患病人数逐年增加,因此对社会和经济影响已经越来越大。其主要病理变化是黑质多巴胺(dopamine, DA)能神经元的变性,结果导致纹状体内DA及其代谢产物3,4-二羟基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid, DOPAC)含量明显减少。目前治疗PD的主要方法有药物治疗、手术治疗、细胞移植和基因治疗。药物和手术治疗对PD起到缓解症状的作用,不能延缓或阻止疾病进程。细胞移植治疗通过移植细胞替代损失的DA能神经元以恢复黑质多巴胺的神经传递,虽有效果但不持久。目前认为：理想的PD治疗方法应该不仅能纠正脑内DA含量的不足,而且能保护残留的DA能神经元,基因治疗是实现这一目标的最佳途径之一,已成为PD治疗的研究热点。 基因治疗通过把目的基因转染到细胞内再进行脑内移植或者通过质粒或病毒载体直接把目的基因转染到脑内病变部位。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)因来源丰富,取材简便,在体外易于培养和扩增,且自体移植克服了免疫排斥和伦理道德等特点,而成为理想的载体细胞。常用的外源基因主要包括促进DA合成的酶类如酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)、各种神经营养因子基因及抗凋亡基因等。其中TH是DA合成过程中的限速酶,是神经系统内DA能神经元的蛋白标志。研究发现把外源性的TH基因导入PD模型大鼠纹状体内,可增加脑内DA的水平,改善阿扑吗啡(apomorphine, APO)诱导的旋转症状,对PD有治疗作用。 Neurturin(NTN)在结构和功能上与胶质细胞源性神经营养因子(Glial derived neurotrophic factor, GDNF)有关,二者同属于GDNF亚家族,对DA能神经元具有特异性的营养、支持、保护和损伤修复作用。研究证实NTN在体内外都能促进胚胎中脑神经元的存活,阻止神经退行性病变的发生,是治疗PD的种有效的神经保护因子。 研究发现将TH或NTN基因修饰的细胞分别移植到PD大鼠脑内,均能明显改善PD大鼠的行为、提高纹状体内DA含量。但进一步研究发现单基因不足以维持DA水平及症状的持续改善,目前研究趋向于多基因共转染的治疗方法；研究发现与单转染TH组相比,将TH与AADC(芳香族氨基酸脱羧酶,DA合成过程中一种重要的酶)共转染PD大鼠纹状体后行为学改变较明显,且不依赖外源性四氢喋呤(BH4),而单转染TH组只有在外源性四氢喋呤(BH4)存在时才可检测到DA。本研究将TH和NTN结合起来进行基因治疗,设想此方法既可增加脑内DA的合成,同时又能保护DA能神经元,二者协同作用以达到双重治疗效果。而目前将TH和NTN双基因共转染BMSCs脑内移植治疗PD的研究国内外尚未见报道。 本研究首先利用密度梯度离心法对BMSCs进行体外分离、培养与扩增,研究其生物学特性、增殖情况以及相关特异性抗原的表达,以证实所培养的细胞为BMSCs;随后利用含有两个多克隆位点pIRES质粒,将TH和NTN基因串联起来的,构建TH和NTN双基因表达载体并转染到BMSCs中,获得稳定携带pIRES-TH-NTN的BMSCs,并测定TH-NTN-BMSCs中TH和NTN mRNA和蛋白的表达；最后将TH-NTN-BMSCs移植到PD大鼠纹状体区,观察对PD模型大鼠的治疗作用,并通过多种手段对移植前后PD大鼠行为学、特异性神经递质、组织学以及相关基因与蛋白进行比较分析,为PD的基因治疗探索一种新的有效的方法。本研究分为以下三个部分： 第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学鉴定 方法： 1.无菌条件下获取大鼠骨髓,密度梯度离心法分离BMSCs,进行原代培养。 2. BMSCs传代培养,采用MTT法测定其生长活性。 3.利用流式细胞技术和免疫细胞化学染色测定CD34和CD29分子的表达。结果： 1.接种后24h内,体积较大的圆型细胞开始贴壁生长：2-3d后细胞大部分贴壁,开始大量伸展；数天后,细胞增殖旺盛,从形态学上判断为BMSCs。 2.传代后细胞生长迅速,生长活性测定结果显示随着培养时间的推移,吸光度值逐渐增加,在培养第6-11d时,细胞增殖最为迅速。 3.流式检测CD34阳性率仅为2.40%,而CD29阳性率高达93.93％,免疫细胞化学检测CD29呈阳性,CD34呈阴性表达,利用排除法确定培养细胞为BMSCs。 第二部分TH

关键词： 溃疡性结肠炎   骨髓间充质干细胞   粒细胞集落刺激因子   移植治疗  

摘要： 目的：探讨骨髓间充质干细胞联合粒细胞集落刺激因子对大鼠实验性结肠炎的作用　　 方法：①4只健康SD(Sprague-Dawley)大鼠，雌雄不限，3至4周龄，股骨提取骨髓间充质干细胞(MSCs)于体外贴壁培养和移植。在第四代MSCs融合前72小时以终浓度为10umol/L5-溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)标记细胞。②另取健康SD大鼠60只，雌雄各半，体重200±20g，分为正常组(A组)，模型组(B组)，5-氨基水杨酸(5-ASA)组(C组)，间充质干细胞组(D组)，间充质干细胞联合粒细胞集落刺激因子组(E组)，每组各12只，除A组外其余四组采用三硝基苯磺酸与酒精复合法灌肠建立溃疡性结肠炎动物模型。③造模24小时后A、B组生理盐水1ml灌胃，C组给予5-ASA(100mg/kg)1ml灌胃，D组经尾静脉注射1ml细胞悬液(约2×106个MSC)，E组经尾静脉注射1ml细胞悬液(约2×106个MSCs)，并皮下注射粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)250ug/(kg.d)，应用两日。各组分别于模型处理后第14及28天各处死6只，心脏采血分离血清测定肿瘤坏死因子a(TNF-a)，白细胞介素10(IL-10)，取全段结肠组织送免疫荧光检测移植后的骨髓间充质干细胞在受损肠道的定位情况，测定肠道组织中髓过氧化物酶(MPO)的含量，病理学检测肠道组织损伤程度，免疫组化及免疫印迹法检测核因子κBp65(NF-κBp65)表达。　　 结果：1.原代MSCs在三天后开始贴壁，十天后铺满培养瓶底，第四代长梭形，漩涡状细胞集落，细胞仪检测CD29的阳性率为93％，CD44的阳性率为96％，CD45的阳性率为2.6％。2.移植后的MSCs在E组受损肠道的定位情况显著高于同时期D组，其他未移植组未见。3.E组在移植第14天疾病活动指数(DAI)，TNF-a，IL-10，NF-κBp65水平与同时期B，D组比较无显著差异(P>0.05)，移植后第28天E组上述指标较同时期B，D组有统计学差异(P<0.05)，病理学评分无显著差异(P>0.05)　　 结论：1.同种异体BMMSCs可在溃疡性结肠炎受损肠道定植，且应用短程高剂量粒细胞集落刺激因子(G-CSF)能够增加细胞定植数量。***移植联合G-CSF能够改善溃疡性结肠炎症状。***移植联合G-CSF能够抑制溃疡性结肠炎的免疫因子，从而抑制免疫反应。***移植联合G-CSF短期不能改善病理学。

关键词： 骨髓间充质干细胞   Sox9基因   椎间盘退变   基因转染  

摘要： 目的 建立兔退变椎间盘的动物模型,应用慢病毒载体介导Sox9基因体外转染兔MSCs,将其移植入椎间盘内,观察对兔退变椎间盘的影响。 方法 1.纤维环穿刺髓核抽吸法建立兔退变椎间盘模型 取健康新西兰大白兔,术前排除脊柱畸形及退行性病变。麻醉后,取腹膜后外侧入路,暴露L3/4、L4/5、L5/6椎间盘,21G针头刺入椎间隙,深度控制在5mm,反复抽吸至吸出髓核。术前,术后定期行X线和MRI检查,观察椎间隙高度指数及髓核在T2像上的信号变化。12周后处死动物,取材行大体标本观察,并行病理学观察、免疫生化检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达情况。 2.体外分离培养兔MSCs 取2月龄新西兰大白兔,体重1.5～2.5 kg。麻醉后,无菌操作下抽取骨髓4～6ml(内含3000U/ml的肝素0.2m1),Percoll法分离骨髓单个核细胞,PBS洗涤细胞2次,以2×105/cm2的密度接种于40ml培养瓶。原代培养细胞接近70%～80%融合后,1:3比例进行传代培养,倒置显微镜观察细胞的形态和生长状态并拍照。取第3代MSCs,制成单细胞悬液,鉴定。 3. Sox9慢病毒载体转染MSCs 取第3代生长状态良好的MSCs,细胞达到70%～80%融合时,密度为5×105 /cm2,加入Sox9慢病毒载体,感染复数(muhiplicities of infection,MOI)为30,轻轻混匀,置于湿润的并含有5%CO2培养箱中37℃过夜培养,48小时后荧光显微镜观察绿色荧光的表达并计算转染率,Western-blot法检测Sox9蛋白的表达情况。 4.移植Sox9基因修饰后的MSCs,观察其对兔退变椎间盘的治疗作用 退变模型手术后,对照组损伤椎间盘不作任何处理;MSCs组损伤椎间盘移植入浓度为1×10～6/ml的MSCs,基因转染组注入Sox9基因修饰过的MSCs,每个椎间隙注入量为20μl。术后定期行X线及MRI检察,观察椎间隙高度指数和髓核T2像信号变化。12周后取材,通过免疫组化检测Ⅱ型胶原表达情况。分光度法检测蛋白多糖的含量变化。 结果 1.实验组术后4周MRI观察到髓核信号降低,术后12周发现椎间隙高度和髓核信号明显降低,退变明显。免疫生化结果显示实验组Ⅱ型胶原和蛋白多糖含量较对照组明显减少(P<0.05)。 2.体外分离、培养和传代的兔MSCs具有增殖快,可重复性强等优点,是较理想的组织工程种子细胞之一。 3. Sox9慢病毒载体转染MSCs后在倒置显微镜下细胞呈多角形,胞体增大,生长良好,胞内充满绿色荧光物质,转染率为90%以上。经MTT法和流式细胞仪检测发现转染对细胞的增殖以及细胞凋亡率无影响。Western-blot检测结果显示基因转染组Sox9蛋白表达明显高于空白对照组和空慢病毒载体转染组。 4.术前,术后第4、8、12周行X线及MRI检查,对照组随着时间的推移椎间隙高度和髓核信号进行性降低;MSCs组椎间隙高度及髓核信号出现轻度降低;基因转染组椎间隙高度及髓核信号未见明显降低。免疫生化检测发现Ⅱ型胶原、蛋白多糖的含量在基因转染组最高,MSCs组次之,对照组最低。基因转染组疗效优于MSCs组(P<0.05)。 结论 1.纤维环后外侧穿刺髓核抽吸法可建立兔退变椎间盘模型。 2.移植Sox9基因转染后的MSCs可以有效抑制兔椎间盘的退变,促进椎间盘的修复,疗效优于单纯移植MSCs。

关键词： 桡骨骨折   骨髓间充质干细胞   细胞培养   骨折不愈合  

摘要： 尽管骨科近年来发展迅速，但骨折不愈合仍是临床中面临的一个重要问题，在正常的骨折愈合过程中，未分化的骨髓间充质干细胞在骨形态蛋白(BMPs)和调节因子的影响下增值，分化成软骨细胞和骨细胞，最终形成骨，达到修复损伤。然而一部分骨折没有由于没有完成修复过程，最终导致延迟愈合或者不愈合，增加手术次数，延长住院时间。骨折不愈合的诊断是建立在一系列临床症状和物理检查上的，它包括疼痛，骨折端的活动以及放射学检查。骨折治疗6－8个月后仍没有愈合考虑骨折不愈合，不同部位的发病率约5％-20％。　　 近年来随着干细胞培养、分离等技术的发展使骨折不愈合的治疗有了更多的选择。从骨髓提取分离、纯化间充质干细胞(mesenehymalstemcells，MSCs)能演变为多种组织细胞，在多种因素的刺激下可分化为几乎各种中胚层细胞，如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，可作为各种组织修复的选择。本实验即以同种异体兔骨髓间充质干细胞修复兔骨折不愈合模型，观察其修复兔桡骨骨折不愈合模型的效果，从而探讨同种异体MSCs的体内修复骨折不愈合的机制，为进一步使用同种异体MSCs治疗骨折不愈合提供实验支持。　　 目的：　　 研究兔骨髓间充质干细胞的体外分离、培养、纯化方法，以及观察兔骨髓间充质干细胞生长情况。用兔桡骨制作骨折不愈合的模型。通过骨髓间充质干细胞的培养扩增，治疗兔桡骨骨折不愈合模型，研究骨髓间充质干细胞移植治疗骨折不愈合的效果及机制，以及不同数量的细胞移植对骨折不愈合的影响。从而进一步为人自体、异体骨髓间充干细胞的体外培养应用治疗骨折不愈合提供依据。　　 方法：　　 1、用Brownlow法制做新西兰大白兔桡骨骨折不愈合模型，将其一侧桡骨干中远1/3截断，去除5mm骨质及骨膜，用骨蜡封闭骨折端，使骨折保持5mm的间隙。术后8周，使其形成兔桡骨萎缩性骨折不愈合的模型。　　 2、采用贴壁筛选法从兔股骨近端髓腔骨髓组织中分离、纯化BMSCs，进行体外培养扩增，应用免疫组化染色方法对细胞表型、纯度进行鉴定。　　 3、将培养的细胞低温保存，待骨折不愈合模型完成后，复苏MSCs，扩增培养，消化培养瓶中的细胞，PBS洗涤后，计数，制成细胞浓度为1×106/ml的细胞悬液，将骨折不愈合模型随机分为3组，A组给予不愈合部位0.2ml细胞悬液注射。B组给予不愈合部位0.4ml细胞悬液注射。C组不愈合部位仅打通髓腔。分别在给予MSCs移植治疗4周和8周行X线检查，观察骨折愈合情况。　　 结果：　　 1、骨折不愈合模型制作术后8周，影像学和组织学检查，其形成类似于临床萎缩性骨折不愈合的模型。　　 2、培养的兔骨髓间充质干细胞贴壁生长，细胞多为为短梭形或纺锤形，典型的为漩涡状排列，比较均一;采用免疫细胞化学检查发现培养的细胞表达细胞表面抗原CD44，不表达CD34，证实所培养的细胞为兔BMSCs。　　 3、BMSCs移植治疗骨折不愈合术后8周行X线检查和组织学显示：A组中7只兔桡骨骨折愈合，3只未愈合;B组中9只兔桡骨骨折愈合，1只未愈合;C组中有2只兔桡骨骨折愈合，8只未愈合。干细胞治疗组较对照组骨折愈合率高，p<0.05，差异具有显著性。　　 结论：　　 1、通过贴壁筛选法可分离、纯化骨髓间充质干细胞，经过体外培养扩增可获得成分较均一的BMSCs。该方法简便有效，分离、纯化效果较理想，为细胞移植治疗提供良好的来源。　　 2、同种异体骨髓间充质干细胞可以成功治疗兔桡骨骨折不愈合的模型，并且随着移植细胞数量的增加骨折愈合率增加。

关键词： 骨髓间充质干细胞   细胞培养   诱导分化   大鼠   骨髓间充质干细胞   肠道   放射损伤   治疗作用  

摘要： 第一部分:SD大鼠骨髓间充质干细胞分离、培养、纯化及其生物学特性鉴定的研究 目的:探讨SD大鼠骨髓间充质干细胞( Bone Marrow-derived Mesenchymal Sstem Cells,BMSCs )体外分离、纯化和培养方法,并鉴定其生物学特性,建立起理想的大鼠BMSCs体外分离培养体系,为BMSCs实验研究应用奠定基础。 方法:取4-6周龄的雄性SD大鼠,无菌条件下分离大鼠后肢,PBS冲洗骨髓腔,收集骨髓。联合运用密度梯度离心法和全骨髓贴壁培养法分离、纯化和培养SD大鼠BMSCs。光镜下进行细胞形态学观察、采用MTT法绘制细胞生长曲线、应用流式细胞术测定细胞表面标记,并检测BMSCs向成骨、成脂肪细胞分化的潜能。 结果:显微镜下体外分离培养的SD大鼠BMSCs呈梭形、成纤维细胞样形态,大小均一,漩涡状生长。细胞生长曲线呈“S”形。P3代SD大鼠BMSCs纯度达98%以上;细胞表面表达CD44、CD90等抗原分子,不表达CD34抗原。诱导P3代BMSCs可向成骨细胞及成脂肪细胞分化。 结论:本实验建立起了一种理想的大鼠BMSCs体外分离培养体系。根据这种方法培养出的大鼠BMSCs纯度高、生物学特征稳定,可用于对BMSCs的实验研究。 第二部分:骨髓间充质干细胞治疗急性放射性肠道损伤的实验研究 目的:观察骨髓间充质干细胞对急性放射性肠道损伤的修复作用,并探讨骨髓间充质干细胞可能的归巢机制,为临床放射性肠道损伤的患者治疗提供新的思路。 方法:30只雌性SD大鼠随机分为2组(各15只),即对照组与实验组(BMSCs治疗组)。两组均接受医用直线加速器单次12 Gy的全腹部照射。BMSCs治疗组于照射后4小时内尾静脉输注2×106/ml的雄性SD大鼠BMSCs悬液1ml;对照组于照射后4小时内尾静脉输注生理盐水1ml。照射后第3天、14天每组随机选取6只大鼠处死,留取血浆与末端回肠标本。用ELISA方法检测血浆中瓜氨酸的含量;光镜下观察肠道组织结构的变化;免疫组化SP法测定肠道组织趋化因子细胞基质衍生蛋白-1(SDF-1)的表达;提取肠组织DNA,用PCR方法检测雌性受鼠肠内Y染色体的Sry基因,确定供鼠BMSCs的植入情况。 结果:照射后第3天,与对照组大鼠相比, BMSCs治疗组光镜下回肠粘膜上皮细胞坏死和炎性细胞浸润较少,绒毛及腺体数量较多。照射后第14天,与对照组大鼠相比,BMSCs治疗组回肠粘膜结构完整,粘膜绒毛及固有腺体更丰富。照射后第3,14天,BMSCs治疗组回肠绒毛高度分别为(245.54±12.75)μm、(321.36±18.21)μm;高于对照组(215.46±13.52)μm、(303.3±16.65)μm,P<0.05。BMSCs治疗组回肠隐窝深度分别为(148.82±10.12)μm、(204.25±13.58)μm;高于对照组(132.72±11.96)μm、(192.5±12.23)μm, P<0.05。照射后第3、14天,BMSCs治疗组大鼠血浆瓜氨酸分别为(11.32±1.42)μg/ml、(17.66±2.39)μg/ml,高于对照组(9.15±1.56)μg/ml、(14.48±2.10)μg/ml, P<0.05。照射后第3天,两组大鼠回肠组织细胞基质衍生蛋白-1表达阳性,且BMSCs治疗组表达量明显高于对照组,P<0.05。PCR检测BMSCs治疗组大鼠回肠组织有Y染色体特异性基因片段的存在。而检测对照组各大鼠此基因片段均为阴性,证实雄性大鼠BMSCs参与了受照射大鼠的肠道修复。 结论:BMSCs可定植于辐射损伤的肠道组织,并参与肠黏膜结构和肠道功能的修复。BMSCs的归巢与SDF-1/ CXCR4轴密切相关。