关键词： 急性心肌梗塞   低氧诱导因子1α   骨髓间充质干细胞疗法   疗效评价  

摘要： 目的：观察低氧诱导因子-1α(HIF-1α)在骨髓间充质干细胞(BMMSCs)治疗大鼠急性心肌梗塞中的作用,并与单纯BMMSCs移植作比较。　　方法：①BMMSCs的提取、培养、标记。②普通级SD大鼠,建立心肌梗塞模型。③实验分组:随机分为4组:对照组:在梗死部位分4个点注射低糖DMEM培养液,50μl/点。BMMSCs组:梗死部位分4点注射已标记的BMMSCs,每点50μl。HIF-1α反义寡核苷酸组:已标记的BMMSCs注入梗死部位4个点,每点50μl,HIF-1α反义寡核苷酸99μg分4点注入梗死心肌。HIF-1α错义寡核苷酸组:已标记的BMMSCs注入梗死部位4个点,每点50μl,HIF-1α错义寡核苷酸99μg分4点注入梗死心肌。④观察指标:术后4周,测定大鼠左室收缩压、舒张末压、压力变化最大上升与最大下降速率,检测细胞移植情况及新生血管密度。　　结果：①大鼠血流动力学检测:与对照组、HIF-1α反义寡核苷酸组相比,BMMSCs组与HIF-1α错义寡核苷酸组左室收缩压、压力变化最大上升与最大下降速率均明显升高,舒张末压明显降低。②心肌超微结构检测:BMMSCs组与HIF-1α错义寡核苷酸组大鼠心肌超微结构损伤少于其他两组。③移植细胞存活情况:HIF-1α反义寡核苷酸组心肌观察到少量 BrdU阳性移植细胞,BMMSCs组、HIF-1α错义寡核苷酸组心肌均明显可见BrdU阳性的移植细胞。④心肌血管密度:BMMSCs组与HIF-1α错义寡核苷酸组大鼠梗死心肌内血管密度高于其他组。　　结论：HIF-1α反义寡核苷酸对BMMSCs治疗急性心肌梗塞具有抑制作用,BMMSCs对大鼠急性心肌梗塞的部分治疗作用可能是通过HIF-1α介导的。

关键词： 骨髓间充质干细胞   气管注射   肺动脉高压   Smad2   血管重构  

摘要： 背景肺动脉高压（Pulmonary arterial hypertension，PAH），2008年在美国南加州DanaPoint举行的第4届肺动脉高压会议上提出，在静息状态下，经右心导管测定的平均肺动脉压≥25mmHg为诊断标准。PAH可由许多心、肺和肺血管疾病引起，是很多疾病进展到一定阶段的表现，肺动脉高压也可以作为一种疾病而独立存在，主要表现为肺动脉压力的上升和肺血管阻力的增加，病理生理基础主要是由于肺血管重构引起肺循环血流动力学改变，逐渐出现右心衰竭，甚至死亡。因此，在早期干预治疗肺血管的重构是治疗PAH的重中之重，而随着国内外对干细胞治疗PAH研究的逐渐深入，大规模的动物实验研究表明干细胞对PAH的治疗作用是肯定的。本实验研究证实了骨髓间充质干细胞治疗早期血管炎性损伤导致PAH的相关机制，并且进一步改善了治疗途径，使干细胞治疗PAH更加安全可靠。 目的探讨通过气管注射骨髓间充质干细胞（MSCs）的方法，研究早期血管炎性损伤所致PAH的相关作用机制，并且观察治疗2周时MSCs对肺血管结构的影响。 方法取SD大鼠的骨髓，经贴壁筛选法体外培养并纯化得到MSCs，用带有红色荧光的腺病毒标记后备用。将实验动物随机分为生理盐水空白对照组（Con组）、早期炎性损伤导致的肺动脉高压组（PAH组）、MSCs气管注射治疗组（TMSCs组），MSCs静脉注射治疗组（VMSCs组）。VMSCs组、TMSCs组和PAH组大鼠皮下注射野百合碱（MCT）造成大鼠肺血管的早期炎性损伤，Con组皮下注射等量的0.9%生理盐水代替MCT。MCT注射7天后VMSCs组及TMSCs组SD大鼠分别经股静脉、气管注射携带红色荧光蛋白病毒转染的MSCs，Con组及PAH组注射等量的低糖DMEM培养基。分别于MCT注射10天、21天时，检测TMSCs组及VMSCs组大鼠荧光在肺组织的分布，于MCT注射21天时，检测各组大鼠肺血流动力学指标肺动脉收缩压（SPAP）、肺动脉平均压（MPAP）及与血管重塑相关的转化生长因子β（TGF-β）的作用底物Smad2、磷酸化Smad2表达情况，取新鲜肺组织做病理切片观察肺血管结构和血管壁厚度的变化。 结果SD大鼠注射MCT21天时PAH组其SPAP、MPAP显著高于Con组（P<0.05）,VMSCs组、TMSCs组测得SPAP、MPAP较PAH组明显下降（P<0.05），但高于Con组（P<0.05），差异有统计学意义。PAH组、TMSCs组、VMSCs组Smad2的水平没有明显差别，但稍高于Con组；磷酸化Smad2(p-Smad2)水平在PAH组高于TMSCs组、VMSCs组，高于Con组。测量各组肺血管的血管壁厚度，血管壁在PAH组较Con组明显增厚（P<0.05），VMSCs组、TMSCs组血管壁厚度与PAH组相比明显变薄（P<0.05），差异有统计学意义。VMSCs组、TMSCs组两组间在压力、Smad2及磷酸化Smad2、血管壁厚度方面无统计学差异。 结论MSCs可以降低肺动脉压力，减轻肺血管的重构作用，这可能与MSCs降低与血管重塑相关因子TGF-β的作用底物Smad2蛋白及其活性形式磷酸化Smad2蛋白的表达有关，MSCs是治疗早期血管炎性损伤导致PAH的有效方法，并且气管注射MSCs成为一种新的可靠的给药途径。

关键词： 骨髓间充质干细胞   再生障碍性贫血   护理  

摘要： 目的:观察骨髓间充质干细胞治疗再生障碍性贫血的临床效果,探讨其护理方法。方法:对比20例再生障碍性贫血患者采用MSC治疗前后的输血时间间隔、实验室指标变化。结果:经骨髓间充质干细胞治疗,20例患者中,有6例患者的外周血细胞计数、骨髓细胞学检查和活检结果全部恢复正常,无复发;5例缓解,3例进步,2例死亡。结论:应用骨髓间充质干细胞治疗再生障碍性贫血,患者的骨髓造血功能有了明显的改善。

关键词： 间充质干细胞   体外   培养   间充质干细胞   终末期肝病   肝炎病毒   乙型   Th1-Th2平衡  

摘要： 目的：体外培养异体骨髓间充质干细胞(MSCs),观察其生长状态及评估其生物安全性。 方法：应用全骨髓贴壁培养法体外培养异体骨髓间充质干细胞,观察细胞生长形态,鉴定细胞表面标记,行细胞悬液病毒细菌检测,染色体核型分析,观察其向骨样细胞和脂肪样细胞分化的能力。 结果：异体骨髓间充质干细胞体外培养传代后,细胞表面的标记及染色体的核型稳定,细胞悬液检测无细菌,病毒的污染,可以向骨样细胞和脂肪样细胞分化。 结论：体外间充质干细胞培养结果表明,体外生长状态良好。传代后骨髓间充质干细胞的细胞表型和核型稳定。一定条件下具有分化的潜能。 目的：初步探讨异体骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗终末期肝病的短期疗效及其对Th1/Th2轴的影响。 研究对象及方法：35例乙型肝炎终末期肝病患者分为两组,干细胞治疗(治疗组)13例,对照组22例,均采用内科综合治疗,治疗组在此基础上加用异体MSCs;观察治疗前,治疗后2和4周的丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、总胆红素(TBi1)、白蛋白(ALB)与凝血酶原活动度(PTA)等变化。应用流式细胞仪检测治疗组患者外周血IFN-γ与IL-4的水平,分析Th1/Th2的比例变化。比较两组治疗前后生化指标及治疗组Th1/Th2的变化情况。 结果：13例患者干细胞移植全部成功且未出现不良反应和并发症,治疗组术后4周无死亡病例。治疗组患者的肝功能及凝血功能恢复优于对照组,其中ALT、PTA(?)(?)标与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；而ALB、TBIL与对照比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗组患者干细胞治疗后IFN-y升高,其中慢性乙型肝炎肝衰竭患者术后IL-4升高；而乙型肝炎肝硬化患者术后IL-4下降,治疗组干细胞治疗后Th1/Th2较治疗前升高。 结论：MSCs治疗乙型肝炎终末期肝病是安全有效的,其对Th1/Th2轴可能有免疫调节作用,机制有待进一步研究。

关键词： 犬   骨髓   间充质干细胞   诱导分化   多功能心腔内导管   急性心肌梗死   干细胞   移植   血管新生   干细胞   移植   心功能   血流动力学   心室重构  

摘要： 目的：探讨犬骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、纯化、扩增的方法，证实其自我更新能力及多向分化潜能，为细胞移植治疗急性心肌梗死(AMI)做准备。 方法：无菌条件下用骨髓穿刺针获取骨髓液，用密度为1.073g/ml的Percoll分离液通过密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液种植细胞，通过贴壁筛选法获得纯化的MSCs。细胞生长融合达80%左右时，用胰酶消化传代细胞，细胞消化、传代培养三代后，可获得大量的纯度较高的MSCs。对不同代MSCs进行细胞计数，并绘制生长曲线，观察细胞生长特性。应用流式细胞仪对MSCs表面标记蛋白CD29、CD34进行表面抗原鉴定。取第3代MSCs分别进行成骨组织以及脂肪组织的诱导分化，通过茜素红以及油红O染色检测是否诱导分化为成骨组织以及脂肪组织。 结果：采用密度梯度法获得犬骨髓单个核细胞，刚分离的细胞体积较小，呈圆形。细胞培养72小时后观察可见单个或少量成集落样生长的贴壁细胞克隆，形态大多呈短梭形，原代细胞培养10-12天达到传代标准。细胞传代后增殖较快，MSCs生长曲线绘制显示，MSCs生长曲线呈S型，第6-7天生长达到高峰。流式细胞检测显示犬MSCs CD29呈阳性表达，CD34呈阴性表达。多向分化能力检测显示，在不同诱导环境下MSCs可向成骨组织以及脂肪组织分化。 结论：犬MSCs取材方便，通过密度梯度离心法可获得单核细胞。利用贴壁筛选法在体外培养、扩增可在短期内获得大量纯化的、性质稳定的MSCs。传代后MSCs生长迅速，在不同的诱导环境下可以向成骨组织以及脂肪组织分化，证实其具有多向分化能力，可为体外移植治疗急性心肌梗死提供丰富的细胞来源。 目的：探讨多功能心腔内导管移植骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗急性心肌梗死(AMI)的可行性及对缺血心肌血管新生的影响。 方法：通过结扎犬冠状动脉左前降支的方法建立AMI模型，AMI模型建立一周后，将存活的犬随机分成细胞移植组和PBS对照组。分离颈动脉，在超声心动图的引导下，沿颈动脉将多功能导管逆主动脉送入左心室。在心腔内超声图像下，识别左室前壁心肌搏动较弱区域或搏动不规则区域，在心腔内超声监控下，通过镍钛合金注射针将体外培养、扩增的MSCs注射到梗死中心区以及梗死边界区，每个点注射0.2ml，每只犬注射5个点，对照组注射相同剂量的PBS液。完成注射后，动物继续饲养4周，处死动物，取心肌组织作冰冻切片和石蜡切片。通过冰冻切片观察移植细胞存活情况，采用HE染色以及vWF免疫组化染色观察心肌梗死区组织结构变化以及血管新生情况。 结果：所有动物均成活到实验结束，无动物死亡。镍钛合金注射针插入心肌内注射时，可发现室性早搏，但无恶性心律失常发生。整个实验过程中动物生命体征平稳，无心跳骤停、室性心动过速、血栓形成等严重并发症发生。在所有动物中，多功能心腔内导管显示靶向心肌解剖结构，能够实时观察到注射针在心肌内的位置，能够区分低回声信号的心腔、心肌以及高回声信号的注射针。组织冰冻切片显示，靶向移植心肌有移植细胞存活。HE染色显示对照组心肌梗死区心肌组织炎性细胞浸润，心肌细胞消失，纤维瘢痕组织增生显著。细胞移植组心肌细胞排列紊乱，炎性细胞浸润较少，纤维瘢痕组织增生较少。光学显微镜下观察，VWF染色微血管为棕黄色，细胞移植组新生血管数量较多，对照组血管数量较少，两组比较差异有统计学意义。 结论：多功能心腔内导管经心内膜移植MSCs治疗AMI安全、可行，可以将MSCs递送到靶向心肌， MSCs可以促进缺血心肌血管管再生。 目的：探讨多功能心腔内导管移植骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗急性心肌梗死(AMI)对缺血心肌心室重构的影响。方法：通过结扎犬冠状动脉左前降支的方法建立AMI模型，AMI建模前、建模后1周以及细胞移植4周后分别对动物进行心功能进行检测。获取二维超声心动图，于左心室乳头肌水平描记M型超声，分析心脏功能，测得左室射血分数(LVEF)。同时获得心尖2腔或4腔切面，使用双平面Simpson法验证，取三个心动周期测量的平均值。细胞移植4周后，将测量导管缓慢送入左心室，连接生理通道记录仪，描记心率、左心室收缩末压力、左心室舒张末压力，并计算左心室压力最大上升和下降速率。动物取材后，称取心脏总质量，计算心脏质量指数。标本石蜡包埋后进行VG染色,显微镜下观察染色情况并获取图片，测量左室截面积和纤维瘢痕面积，计算梗死面积。 结果：超声心动图显示，动物建模前，细胞移植组和对照组左心室射血分数LVEF相似。动物建模1周后，细胞移植组和对照组LVEF相似，都出现明显的降低。细胞移植4周后，细胞移植组LVEF有所增加，对照组LVEF减少，与对照组相比较，细胞移植组平均LVEF

关键词： 骨髓间充质干细胞   Ⅷ因子   创伤性脑损伤  

摘要： 【研究背景】 创伤性脑损伤是中枢神经系统的常见病和多发病，其可直接破坏颅内结构，导致患者神经系统功能严重、永久受损，甚至可出现植物生存状态或危及生命。 骨髓间充质干细胞具有向其他细胞分化的巨大潜能。国内外学者就这种多能干细胞是否能修复神经系统的不可逆损伤，恢复受损神经功能已展开研究。 【目的】 本课题研究利用原代培养BMSCs模拟患者受伤即时提取自体干细胞，以干细胞培养的最短周期移植BMSCs治疗创伤性脑损伤，试探索临床应用自体干细胞移植治疗急性创伤性脑损伤。 【方法】 健康成年雄性SD大鼠，体重300±20g，采用改良的Feeney方法建立模型，用大鼠立体定向仪选取位点，开骨窗，以300g·cm功力冲击大鼠大脑皮层，24h后做改良的神经功能缺损评分。建模成功后单纯随机法进行分组，分为实验组和对照组，每组10只，共用大鼠20只。选取2月龄成年雄性SD大鼠作为骨髓源。分离提取骨髓细胞，孵箱培养原代骨髓间充质干细胞。实验组在立体定向仪定位下移植原代干细胞，对照组注射生理盐水。干预14天后再次做改良的神经功能缺损评分，并将评分结果进行统计学分析。后处死大鼠取脑组织切片，用HE染色法行病理组织学检查，通过Ⅷ因子表达做血管计数，并做统计学分析。 【结果】 1．病理组织学：肉眼观察大鼠脑表面。实验组脑表面较平整，可见圆形受损区域，周边水肿带不明显；对照组脑表面粘连，组织形态错乱，坏死区域及水肿带较明显。HE染色后，可见受损区坏死脑组织，受损周边炎细胞浸润，实验组坏死区域较对照组小； ***评分：实验组评分低于对照组（P <0.05）； 3．微血管计数：两组血管计数有统计学差异，实验组血管计数高于对照组（P <0.05）。 【结论】 1．移植原代骨髓间充质干细胞治疗组神经功能恢复优于对照组； 2．移植原代骨髓间充质干细胞治疗组血管密度高于对照组； 3．原代骨髓间充质干细胞能够帮助创伤性脑损伤模型恢复神经功能，并促进血管生长。推测其通过促进血管新生帮助脑组织修复； 4．实验验证最短培养周期的原代干细胞早期移植对于治疗急性创伤性脑损伤有意义。

关键词： 骨髓间充质干细胞   重症急性胰腺炎   心肌损伤   肺损伤  

摘要： 目的： 探讨同种异体移植骨髓间充质干细胞治疗大鼠重症急性胰腺炎并发心肌、肺损伤的价值及其机制，为临床应用骨髓间充质干细胞治疗重症急性胰腺炎心肌、肺损伤提供实验理论依据。 方法： 通过全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞（BMSCs）至第三代备用；经流式细胞术鉴定BMSCs。将90只健康雌性SD大鼠，体重200±20g,根据随机数字表法分为假手术组（S组)、模型组(SAP组)和治疗组（B组）。SAP组、B组采用胰腺被膜下多点注射4％牛磺胆酸钠(0.5ml/kg)复制SAP模型。造模后24h经大鼠尾静脉注射1mlBMSCs悬液（1.0×106个/mL）于S组和B组，而SAP组只注射1mlPBS。于移植后第1、7、14d通过腹主动脉放血法将大鼠分批处死，采集血清检测血淀粉酶（AMY）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）；用ELISA法检测血清TNF-a、IL-10；并将胰腺、心肌及肺组织置于4%中性甲醛溶液中固定，常规切片、HE染色；采用免疫组织化学方法检测心肺组织中TNF-a、IL-10的表达。 结果： 1、通过全骨髓贴壁法可提取骨髓间充质干细胞，10h后可见少许细胞贴壁，培养至第10天即可生长约90%融合，传至第三代后可见细胞大小形态比较均一的骨髓间充质干细胞。 2、BMSCs定位：移植组（B组）及假手术组（S组）各时间点大鼠胰腺、肺组织、心肌组织中均可检测到Sry基因片段(雄性大鼠细胞来源的标记物)。 3、淀粉酶（AMY）：SAP组及B组血淀粉酶在各时间点显著升高，与S组比较差异有显著差异（P<0.01）；移植后24小时B组血淀粉酶低于SAP组，但差异无统计学意义（P>0.05）；移植后7天、14天有显著差异（P<0.01）。 4、肌酸激酶同工酶（CK-MB）：SAP组及B组血清CK-MB在各时间点显著升高，与S组比较有统计学意义（P<0.05）；移植后24小时B组血清CK-MB与SAP组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；移植后7天、14天有显著差异（P<0.01）。 5、胰腺组织学评分：①SAP组、B组各时间点与S组比较，有显著性差异（P<0.01）。②移植24小时后，B组与SAP组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；移植第7天、第14天相比有显著性差异（P<0.01）。 6、肺组织学评分：①SAP组、B组各时间点与S组比较，有显著性差异（P<0.01）。②移植24小时后，B组与SAP组比较，差异无统计学差异（P>0.05）；移植第7天、第14天相比有显著性差异（P<0.01）。 7、心脏组织学评分：①SAP组、B组各时间点与S组比较，有显著性差异（P<0.01）。②B组与SAP组各时间点比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 8、组织中TNF-α、IL-10蛋白的表达：①心肌：B组、SAP组各时间点与S组比较，有显著性差异（P<0.01）；B组与SAP组各时间点比较，差异无统计学意义（P>0.05）。②肺：SAP组、B组移植后第1、7天与S组比较，有显著性差异（P<0.01）；B组与SAP组相比，移植后第1天，差异无统计学意义（P>0.05）；移植后第7天有统计学意义（P<0.05）；移植第14天后，表达有显著性差异（P<0.01）。 结论： 1、经胰腺被膜下点状注射4%牛磺胆酸钠可成功复制重症急性胰腺炎模型，并对肺脏、心脏造成不同程度损伤。 2、经尾静脉移植的骨髓间充质干细胞可迁移至损伤胰腺、肺脏、心肌组织。 3、同种异体移植骨髓间充质干细胞可以减轻SAP胰腺、肺脏病理学损伤,但对心脏病理学损伤效果稍差。 4、同种异体移植骨髓间充质干细胞可能是通过下调组织中炎性因子的表达，上调抗炎因子的表达来减轻心肺损伤。

关键词： 骨髓间充质干细胞   自身免疫性肝炎   动物模型   细胞移植   免疫抑制  

摘要： 目的： 自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)的发病与诱发因素、自身抗原应答、遗传易感性和免疫调节网络等相关。单用糖皮质激素或联合免疫抑制剂存在疾病完全缓解率低,需要长期服药和类肾上腺皮质功能亢进综合症等多种副作用。AIH最终可进展为肝硬化并需要肝移植,寻找更安全、有效和经济的治疗方法将有深远的意义。对间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的理化特性和实际应用的研究为AIH的治疗提供了新的方向。MSCs具有免疫抑制、多向分化和抗纤维化等多方面的作用。本研究探讨MSCs对AIH小鼠模型的治疗作用及其可能的机制,并观察MSCs预移植对AIH小鼠成模的影响。 材料和方法： ***小鼠动物模型的建立。分次腹腔注射同种异体小鼠肝s-100抗原与弗氏完全佐剂乳化液,首次注射后第4周予以鉴定模型是否建立。 ***移植对AIH小鼠模型疗效观察。AIH小鼠随机分为三组：MSCs移植治疗组(组1),给予1×106/只MSCs单次尾静脉注射；地塞米松治疗组(组2),给予0.25mg/g·周DXM分次腹腔注射；空白对照组(组3),给予0.05ml/只·周PBS腹腔注射；实验第5周和第9周取肝脏制作病理切片,取血清测谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase,ALT)水平 3.观察MSCs对AIH成模的影响。分为两组：首日MSCs移植,隔日给予造模处理(组Ⅰ)；首日给予磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)注射,隔日造模处理(组Ⅱ)。首次注射后4周取肝脏做病理检查,取血清标本测ALT。 4.体外MSCs上清液对脾淋巴细胞增殖的影响：凝胶层析技术分离小鼠肝s-100抗原第1峰(s-100-1),用小鼠淋巴细胞分离液分离出正常小鼠的脾脏淋巴细胞,进行分组：刀豆蛋白A培养组(组A)；刀豆蛋白A联合MSCs上清液培养组(组B)；s-100-1培养组(组C)；s-100-1联合MSCs上清液培养组(组D)。对各组进行淋巴细胞增殖抑制实验,后测各组吸光度(optical density,OD)值。 结果： ***小鼠模型的建立：AIH小鼠肝脏平均炎症评分为2.67±0.516, Knodell评分5.50±1.975,血清学AIL水平为122.00+15.476。 2. MSCs移植于AIH小鼠的疗效观察： 2.1造模后(第4周)小鼠血清ALT为122.00±15.476U/L。第5周,组1、组2和组3小鼠血清ALT分别为：101.43±9.144U/L、115.00±10.315U/L和118.33±15.161U/L。三组间差异有统计学(P<0.05),组1和组2两组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。第9周,组1、组2和组3小鼠血清ALT分别为：84.00±6.557U/L、98.83+15.767U/L和107.50±11.777U/L,三组间差异有统计学意义(P<0.05),组1和组2两组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。 2.2造模后(第4周)小鼠肝脏Knodell评分为5.50±1.975。第5周,组1、组2和组3小鼠肝脏Knodell评分分别为：3.00±1.528、3.33±1.366和4.67±1.862,三组间差异无统计学意义(P>0.05),组1和组2差异无统计学意义(P>0.05)。第9周,组1、组2和组3小鼠肝脏Knodell评分分别为：2.00±1.291、2.67±0.516和4.33±2.066,三组间差异有统计学意义(P<0.05),组1和组2差异无统计学意义(P>0.05)。 3. MSCs预移植对小鼠AIH模型成模的研究： 3.1组Ⅰ和组Ⅱ小鼠的ALT水平分别为：52.17±15.741U/L和122.±15.476U/L,差异有统计学意义(P<0.05)。 3.2组Ⅰ和组Ⅱ小鼠的肝脏Knodell评分分别为：3.33±0.816和5.50±1.975,差异有统计学意义(P<0.05)。 4.体外MSCs上清液对脾淋巴细胞增殖的影响：组A的OD值为0.267±0.167,组B的OD值为0.217±0.128,两组间差异有统计学意义(P<0.05)。组C的OD值为0.165±0.187,组D的OD值为0.082±0.051,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论： 1.同种异体肝抗原与弗氏完全佐剂乳化液注射方法可以复制出AIH小鼠模型。 2. MSCs移植可以减低AIH小鼠血清ALT水平和肝脏炎细胞浸润,提示MSCs移植对AIH小鼠具有治疗作用。 3. MSC

关键词： 急性肺损伤   骨髓间充质干细胞   信号通路   趋化因子   细胞分化   疗效评价  

摘要： 本文从以下几部分进行论述：　　第一部分 大鼠急性肺损伤(ALI)模型的建立　　目的：　　建立大鼠急性肺损伤(ALI)模型，检测肺组织损伤和肺纤维化程度，探讨ALI大鼠肺组织的趋化因子SDF-1表达情况。　　方法：　　1、SD雄性大鼠腹腔麻醉后，盐酸滴鼻建立急性肺损伤(ALI)模型。在ALI模型建立后于1、3、5、7、14天断颈处死大鼠，组织病理切片观察肺组织损伤情况，马松染色检测肺组织胶原蛋白沉积情况，确认ALI模型建立成功。　　2、取1、3、5、7、14天ALI模型大鼠肺组织和血清，通过RT-PCR、蛋白免疫印迹(Western Blot)和ELSIA方法检测基质细胞衍生因子(stromalcell-derived factor-1，SDF-1)在损伤肺组织内和血清中的表达水平。　　结果：　　1、HC1滴鼻可以导致大鼠急性肺损伤，组织病理切片表明ALI模型建立后，肺泡上皮损伤和肺间隙水肿，炎症细胞聚集于肺，肺泡壁变厚和肺间质纤维化;马松染色表明肺间质胶原蛋白沉积，肺纤维化发生。　　2、 ALI模型大鼠肺组织损伤24小时后肺组织和血清中趋化因子SDF-1表达明显升高，达到峰值，并可以维持表达一周左右。　　结论：　　盐酸滴鼻成功地建立了大鼠急性肺损伤模型，损伤导致肺实质细胞损伤和肺间质水肿，炎症细胞浸润，肺泡和肺间质纤维化。　　第二部分 MSCs移植对ALI的修复作用研究　　目的：　　构建CXCR4重组腺病毒，转染MSCs并检测目的基因CXCR4的表达情况，确定适宜的感染剂量和移植时间。研究SDF-1/CXCR4趋化轴对MSCs定向迁移的作用，评估移植MSCs对ALI的作用和效果，探讨调控定植的MSCs分化的分子机制。　　方法：　　1、购买构建好的重组CXCR4腺病毒以MOI=10的比例转染HEK293A包装细胞系，反复扩增3次，提取病毒液，PCR鉴定后用TCID50(Tissue CultureInfection Dose50)法进行病毒滴度测定。　　2、差速贴壁分离法培养大鼠MSCs，选择稳定培养3代的MSCs，流式细胞仪技术鉴定MSCs表面标志CD45、CD90、CD79、CD34、CD44、CD29、CD73、CD11b、CD133的表达。　　3、重组腺病毒以MOI=20、50、100、200、400、800转染第三代MSCs，荧光显微镜下观察转染效率，CCK8法绘制细胞生长曲线，RT-PCR、免疫荧光和Western Blot技术检测MSCs转染后目的基因CXCR4的表达情况。　　4、ALI模型建立后，经尾静脉注射转染的MSCs，ALI模型鼠随机分为3组，ALI组:尾静脉注射生理盐水;ALI+MSC-GFP组:尾静脉注射Ad-GFP转染的MSCs;ALI+MSC-CXCR4组:尾静脉注射Ad-CXCR4转染的MSCs。空白对照组（Control组）:未经HCl滴鼻处理，也不接受MSCs移植;对照组（Control组）:未经HCl滴鼻处理，尾静脉注射Ad-CXCR4转染的MSCs。　　5、免疫荧光、免疫组化和Western Blot技术检测肺组织Wnt/β-catenin信号通路的表达情况。　　结果：　　1、重组CXCR4腺病毒感染293A细胞，经大量扩增纯化后，最终得到1×1011pfu/ml的高滴度病毒液，RT-PCR鉴定证明腺病毒携带目的基因CXCR4。　　2、大鼠MSCs聚集生长，呈长梭型，漩涡状排列。3-6代MSCs表达CD44、CD73、CD90、CD29(+)，不表达CD11b、CD34、CD45、CD133(-)，符合骨髓间充质干细胞特征。　　3、重组腺病毒以MOI=100时转染MSCs为最佳，不会导致MSCs出现病理反应且转染效率最高，达到80％左右，细胞生长曲线亦表明腺病毒转染(MOI=100)对MSCs增殖能力无明显影响。　　4、流式细胞和免疫荧光检测结果表明ALI+MSC-CXCR4组肺组织内MSCs定植数量明显高于ALI+MSC-GFP组，Control+MSC-CXCR4组MSCs未见MSCs定植。　　5、免疫荧光、免疫组化和Western Blot技术检测到ALI组、ALI+MSC-CXCR4组和ALI+MSC-GFP组肺组织内β-catenin异常高表达，表明Wnt信号通路处于高度激活状态。　　结论：　　CXCR4基因修饰可显著提高MSCs在损伤肺组织内定植数量，SDF-1/CXCR4趋化轴在MSCs迁移和定植方面起着重要作用，是MSCs归巢的重要调节机制。MSCs的移植并未有效地修复损伤肺组织，反而在一定程度上促进了肺纤维化的发生发展。　　第三部分 调控Wnt信号通路对移植MSCs修复ALI作用的研究　　目的：　　探讨Wnt/β-catenin信号通路对定植的MSCs定向分化的调控机制，

关键词： 骨髓间充质干细胞   类风湿性关节炎   BMP-6   腺病毒载体  

摘要： 骨髓腔内含有造血和基质两大细胞组织系统。前者由造血干细胞及其分化的造血细胞组成,后者是一个异质细胞群体,包括成纤维细胞、网状细胞、脂肪细胞、巨噬细胞及内皮细胞等,其中含有多能干细胞(multi-potential stem cell),亦称为骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cell, BMSC)。又由于其来源于中胚层的间充质,系胚胎发育过程中少量原始间充质细胞迁移填充组织间隙时定居骨髓腔而来,并且可在特定情况下分化为间充质来源的各种组织以修复缺损,所以又被称为骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)。1986年,Friedenstein等最早证实了骨髓间充质干细胞的存在。骨髓间充质干细胞是一类可进行自我复制和更新的细胞,在不同的理化环境和细胞因子的诱导下能够跨胚层向骨、软骨、脂肪、神经、肌肉等多种谱系分化。骨髓间充质干细胞的主要优点有：1、易于从自身取材,无免疫排斥反应之忧,因而也就更易为病人所接受；2、成体干细胞,涉及较少伦理问题；3、体外易于扩增。易分离、扩增以及体外操作简便。基于骨髓间充质干细胞的以上优点,其在组织器官缺损性疾病,组织器官退行性疾病,遗传缺陷性疾病等方面都有重要的应用前景。 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性、自身免疫性、炎症性关节病。表现为对称性多关节炎性病变,可侵犯多个大、小关节,并伴有晨僵,乏力,体重减轻及全身多器官、多系统受累。其病理特征为滑膜血管的增生与炎性细胞的浸润,后者进一步导致滑膜、软骨乃至软骨下骨组织的受损,最后引起关节破坏。 类风湿性关节炎的发病机制尚未完全明确,因而还缺乏特异性治疗措施。目前临床上的治疗方法有：1、非药物性物理疗法2、药物治疗3、自体造血干细胞移植(HSCT)4、基因治疗5、外科手术治疗等。然而,现有的治疗方法主要是控制症状,延缓病情的发展,调节机体的免疫应答反映。但是对于已经发生的关节内软骨及骨损伤,仍然没有很明显的疗效,寻找和探讨新的有效治疗方法,成为医学工作者的义不容辞的责任。随着骨髓间充质干细胞研究的深入发展,采用干细胞治疗某些疑难病症的研究探讨临床上已经有诸多报道,但采用骨髓间充质干细胞治疗类风湿性关节炎的研究尚属少见,本研究将为类风湿性关节炎的治疗开辟了一个新的途径。 骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)属于转化生长因子-β(transforming growth factor B, TGF-β超家族的成员,1965年Urist等人首先从脱钙骨基质提取物中分离得到的一种具有活性的蛋白质,这种蛋白具有使未分化的间充质细胞定向分化为成骨细胞,并进而可合成胶原性蛋白,形成钙化的骨组织能力,因此命名为骨形态发生蛋白。在体(in vivo)和离体(invitro)实验表明BMPs具有调节成骨细胞和成软骨细胞的分化,诱导异位骨形成,促进骨折愈合,及其具有控制哺乳动物骨骼不同形态特征形成的功能。随着研究的深入,研究者发现BMPs的生物学作用不仅限于骨的发育和形成,而且几乎涉及全身所有系统,包括心血管、胃肠、呼吸、泌尿生殖、体被及神经系统的胚胎发育、生长和分化。目前,已确认的BMPs家族成员达40多个。BMP-6最初是从鼠胎盘cDNA文库中分离得到的,并根据其与爪蟾属相类似,被命名为生长相关苍白基因(Vgr-1)。1990年Celeste等从人的胎盘及胎脑cDNA文库中分别克隆到Vgr-1的同源基因,根据它与BMP家族的同源性而定名为hBMP-6。研究表明,BMP-6能启动软骨细胞成熟,诱导间充质细胞向成软骨细胞方向分化,是软骨细胞分化的一个自分泌刺激因子。目前关于BMP-6诱导或是作为目的基因整合入MSCs诱导其分化的研究国内外仍然较少。 基于以上研究背景,我们拟建立类风湿性关节炎的大鼠模型,体外分离培养扩增骨髓间充质干细胞,利用腺病毒载体,介导hBMP-6基因转染MSCs,并注入模型关节内,诱导达到抗炎及软骨修复的双重治疗效果。目的 构建携带hBMP-6目的基因的腺病毒载体；转染骨髓间充质干细胞,使其在关节炎模型大鼠体内分化为软骨细胞并分泌目的基因蛋白,为骨髓间充质干细胞临床治疗类风湿性关节炎提供新的思路和实验依据。方法 1.骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定：取幼年Wistar大鼠股骨和胫骨髓腔内细胞,用贴壁培养法分离骨髓基质干细胞,培养、传代并纯化。细胞纯化后,用流式细胞仪检测干细胞表面抗原CD14,CD20,CD34和CD90的表达,其中CD29和CD90呈阳性,CD14和CD34呈阴性,即所测细胞为MSC。 ***-hBMP-6腺病毒载体的构建与骨髓间