关键词： 间质干细胞   终末期肝病   肝炎病毒   乙型   Th1-Th2平衡  

摘要： 目的初步探讨异体骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗终末期肝病的短期疗效及其对Th1/Th2平衡的影响。方法 35例乙型肝炎终末期肝病患者分为两组,干细胞治疗(治疗组)13例,均采用内科综合基础上加用MSCs移植治疗;对照组22例,予以内科综合治疗。观察治疗前,治疗后2和4周的丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、总胆红素(TBil)、白蛋白(ALB)与凝血酶原活动度(PTA)等指标变化。应用流式细胞仪检测患者外周血IFN-γ与IL-4的水平,分析Th1/Th2的变化。比较两组患者治疗前后生化指标及治疗组Th1/Th2的变化情况。结果 13例患者干细胞移植全部成功且未出现不良反应和并发症,治疗组后4周无死亡病例。治疗组患者的肝功能及凝血功能恢复优于对照组,其中ALT、PTA与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05);而ALB、TBil与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗组患者干细胞治疗后IFN-γ均升高,其中慢性乙型肝炎肝衰竭患者干细胞治疗后IL-4升高,而乙型肝炎肝硬化患者干细胞治疗后IL-4下降。治疗组干细胞治疗后Th1/Th2较治疗前升高。结论 MSCs治疗乙型肝炎终末期肝病是安全有效的,对Th1/Th2轴可能有免疫调节作用,但其机制有待进一步研究。

关键词： 植入功能不良   继发性   造血干细胞移植   间质干细胞   第三方  

摘要： 目的评价第三方骨髓来源的间充质干细胞（Msc）对异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后继发性植入功能不良（PGF）的治疗效果及安全性。方法2007年4月至2010年9月入组5例allo-HSCT后发生继发性PGF的患者，分别在继发性PGF发生后中位第47（35-61）天接受体外扩增的第三方供者骨髓来源的Msc，以1×10^6细胞／kg的剂量单独治疗，若中性粒细胞绝对值（ANc）和PLT分别未达到〉1．5×10^9／L和〉50．0×10^9／L的造血恢复标准则于28-30d后接受第2次同等剂量的Msc输注。结果1例患者接受1次、4例患者接受2次Msc治疗，所有患者ANC和PLT均达到恢复标准，其达到恢复的中位时间在第1次MSC输注后的34（25-49）d与47（26-54）d。中位随访761（204-1491）d未见不良反应。3例患者分别在Msc治疗后第42、48、108天出现EBV血症，其中2例转化为EBV相关的移植后淋巴细胞增殖性疾病。结论第三方供者骨髓来源MSC对移植后继发性PGF有效，MSC是否会增加EBV感染及EBV相关性淋巴细胞增殖性疾病的发生率有待于进一步研究。

关键词： 间质干细胞   肝硬化   综述文献  

摘要： 肝纤维化、肝硬化是多种慢性肝脏疾病的终末期病理表现，目前传统的治疗手段难以从根本上修复肝脏的不可逆变化，肝脏原位移植是治疗各种终末期肝病的有效方法，但是由于供体来源不足、操作复杂、移植后免疫排斥、治疗费用昂贵等问题，限制了临床肝移植的发展。随着细胞移植技术的成熟，

关键词： 骨髓间充质干细胞   心肌梗死   血管新生   Netrin-1基因   一氧化氮释放   心脏功能  

摘要： 骨髓间充质干细胞(MSCs)是修复损伤心肌的理想干细胞，但其在缺血缺氧微环境下的低存活率已成为MSCs临床应用的瓶颈。Netrin-1是一种神经介导蛋白，近年来发现其在心血管方面的重要作用，Netrin-1可以促进心肌和内皮细胞一氧化氮(NO)的分泌，在心肌梗死中保护心脏，而且Netrin-1对MSCs的增殖和迁移有促进效果。本研究通过逆转录病毒转导使MSCs过表达Netrin-1基因，在RNA和蛋白水平上检测Netrin-1基因的表达，NO的分泌量以及Netrin-1-MSCs的增殖和迁移能力，评估Netrin-1对MSCs的影响。注射Netrin-1-MSCs到大鼠心肌梗死部位，完成心肌坏死面积，胶原含量及心脏功能等方面的研究。\n 用贴壁法从大鼠腿骨中分离培养骨髓间充质干细胞，在细胞传代至三代的时候能得到较纯的MSCs。成功构建pMSCV-Netrin-1-IRES-GFP质粒，并通过双酶切和PCR进行鉴定。用磷酸钙法包装含有目的基因Netrin-1的逆转录病毒，高效转导大鼠间充质干细胞。用流式细胞仪检测Netrin-1基因转导百分率，可达到60％以上。\n 采用RT-PCR及Western blot在RNA水平和蛋白水平上检测到MSCs中Netrin-1的过表达。用NO试剂盒检测过表达Netrin-1基因MSCs的NO分泌水平，发现Netrin-1-MSCs的NO分泌水平较MSCs有显著提高(P<0.05)，通过MTT实验和损伤分析实验，发现Netrin-1-MSCs的增殖速度和迁移能力与MSCs相比有明显提高。\n 我们建立了大鼠心肌梗死模型，将200-230g大鼠心脏左前降支冠状动脉永久结扎，然后向心肌中注射1×106个Netrin-1-MSCs。动物分组为4组：1.假手术组(n=5)；2.心肌梗死+生理盐水注射(n=9)；3.心肌梗死+MSCs注射(n=5)；4.心肌梗死+Netrin-1-MSCs注射(n=7)。30天后，处死动物，取出心脏样品切片进行分析。通过H&E染色和Masson’s染色检测，发现Netrin-1-MSCs组较之盐水组心肌损伤面积和胶原含量得到显著改善，通过vWF和isolectin免疫染色，发现Netrin-1-MSCs组较之盐水组血管再生的情况显著改善，与MSCs组相比也有一定程度的改善，通过WGA免疫染色发现Netrin-1-MSCs组较之盐水组和MSCs组心肌肥大的情况均得到显著改善。\n 在心血管领域，首次引入Netrin-1基因，将其应用于心脏疾病的治疗研究。本研究将转基因技术与干细胞技术相结合，利用骨髓干细胞取材方便，又可以分化成心肌细胞帮助心肌修复的功能，同时结合Netrin-1可以促进细胞增殖迁移，减少细胞凋亡，释放NO保护心肌等特点，为心肌梗死的治疗开辟新途径。相信随着研究的深入，Netrin-1在心脏中的保护作用和相关调节将会逐渐变得清晰，为疾病临床治疗提供新的思路与希望。

关键词： 糖尿病   勃起功能障碍   骨髓间充质干细胞   细胞分化   旁分泌   细胞移植   基因治疗   血管内皮生长因子  

摘要： 勃起功能障碍(erectile dysfunction, ED)是糖尿病常见的并发症,糖尿病男性患者中ED的发生率比非糖尿病患者高3倍。5型磷酸二酯酶抑制剂(type5phosphodiesterase inhibitor, PDE5I)是治疗ED的一线口服药物,也是目前治疗糖尿病性ED的主要方法,但是由于糖尿病性ED发病机制复杂,PDE5I治疗糖尿病性ED的效果不甚理想。故探索治疗糖尿病性ED的新方法是十分重要的临床意义。骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)是存在于骨髓组织中的一种成体干细胞,在一定的条件下BM-MSCs也向多种组织细胞分化,BM-MSCs还能分泌多种营养因子促进组织生长。前期已经有研究证实BM-MSCs能够改善老年大鼠及勃起神经损伤性大鼠的勃起功能,但BM-MSCs改善勃起功能的具体机制并不十分明确。本课题使用BM-MSCs海绵体内注射治疗糖尿病性ED,并探索BM-MSCs提高糖尿病大鼠勃起功能及改善糖尿病大鼠阴茎海绵体组织结构的可能机制。 第一部分：BM-MSCs海绵体内移植治疗糖尿病性ED 目的：探索BM-MSCs阴茎海绵体内注射提高链脲佐菌素(STZ)诱导的I型糖尿病大鼠勃起功能的效果。 方法：雄性Sprague Dawley大鼠腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠模型,对照组大鼠仅注射缓冲液。分离、培养BM-MSCs并在糖尿病模型成模8周后移植到糖尿病大鼠阴茎海绵体内。移植4周后测定大鼠勃起功能并对阴茎海绵体组织进行组织学分析。电刺激大鼠勃起神经并记录海绵体内压(intracavernous pressure, ICP),使用ICP与平均动脉压(mean arterial pressure, MAP)的比值来评估大鼠勃起功能。免疫组化染色来测定大鼠阴茎海绵体组织中平滑肌和内皮的含量。马松三色染色测定大鼠阴茎海绵体组织的纤维化情况。 结果：BM-MSCs阴茎海绵体内移植后,治疗组大鼠ICP/MAP较糖尿病对照组明显提高。治疗组大鼠阴茎海绵体内平滑肌和内皮的含量较糖尿病对照大鼠也有明显的提高。同样,治疗组大鼠阴茎海绵体内纤维化程度较对照组大鼠有所降低。结论：阴茎海绵体内移植BM-MSCs对于改善糖尿病大鼠勃起功能并提高海绵体组织中内皮和平滑肌的含量有一定的效果。 第二部分：BM-MSCs海绵体内移植治疗糖尿病性ED的机制探索 目的：探索BM-MSCs提高链脲佐菌素(STZ)诱导的I型糖尿病大鼠勃起功能的可能机制。 方法：雄性Sprague Dawley大鼠腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠模型,将糖尿病大鼠随机分为三组：糖尿病对照组,BM-MSCs治疗组和BM-MSCs条件培养基治疗组。BM-MSCs阴茎海绵体内移植后1天,3天,1周,2周分别随机从BM-MSCs台疗组抽取3只实验大鼠,取大鼠阴茎海绵体组织寻找BM-MSCs。BM-MSCs移植后4周,电刺激勃起神经记录阴茎海绵体内压(ICP)评估大鼠勃起功能。免疫荧光染色测定大鼠阴茎背神经中神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)和神经丝(Neurofilament, NF)的表达。免疫荧光染色鉴定BM-MSCs的分化情况。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测定BM-MSCs条件培养基中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),神经生长因子(nerve growth factor, NGF)和脑源性神经生长因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF)的浓度。 结果：BM-MSCs能够合成、分泌一定量的VEGF, BDNF和NGF。阴茎海绵体内移植BM-MSCs能够改善糖尿病大鼠勃起功能并提高阴茎背神经内nNOS和NF的含量。组织学结果显示,BM-MSCs阴茎海绵体内移植后,随着时间的推移,阴茎海绵体内BM-MSCs的数量逐渐减少。移植后第4周,阴茎海绵体内的BM-MSCs数量有限,但部分BM-MSCs能够表达内皮细胞特异性抗原CD31和vWF,部分BM-MSCs能够表达平滑肌细胞特异性抗原α-SMA以及calponin。更重要的是,BM-MSCs条件培养基也具有改善糖尿病大鼠勃起功能和阴茎海绵体组织结构的作用,BM-MSCs提高勃起功能,改善阴茎组织结构的作用能够部分被BM-MSCs条件培养基所代替。结论：阴茎海绵体内移植BM-MSCs对于改善糖尿病大鼠勃起功能有一定的效果。移植后BM-MSCs能够向

关键词： 阿托伐他汀   间充质干细胞   白噬   凋亡   AMP活化蛋白激酶   小分子G蛋白RhoA   Rho激酶   胞外信号调节激酶  

摘要： 目的：骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有多向分化潜能,是急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)后干细胞移植治疗的理想供体。MSCs移植能够改善AMI后心功能,但心梗后局部恶劣的微环境不利于移植细胞的存活,严重影响了其疗效。既往的研究表明他汀类药物能够抑制体外缺氧/无血清(hypoxia/serum deprivation, H/SD)及体内缺血导致的MSCs凋亡,提高干细胞移植疗效,但具体机制不清。自噬是细胞“自我吞噬”的复杂过程,可能在他汀对细胞存活和凋亡的调节中起到了重要的作用,但自噬是否参与H/SD条件下他汀对MSCs凋亡的保护尚未明确。单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)途径是调控细胞能量代谢的关键信号通路,可以通过间接抑制它主要的下游效应分子,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的活化而激活白噬。因此本实验旨在通过H/SD模拟体内缺氧缺血环境,探讨白噬在H/SD诱导的MSCs凋亡中的作用;并假设临床上最常用的他汀类药物,阿托伐他汀(atrovastatin, ATV)能够通过AMPK/mTOR通路激活自噬而发挥其对MSCs凋亡的保护作用。 方法：分离并培养Sprague-Dawley大鼠MSCs,将第三代细胞随机分为正常组(normal)、对照组(H/SD)、不同浓度梯度阿托伐他汀组(ATV0.001μM-10μM)、自噬抑制剂3-methyladenine组(3-MA,5mM)、自噬促进剂雷帕霉素组(rapamycin,10nM)、AMPK通路抑制剂Compound C组(10μM)。流式细胞仪检测MSCs自噬及凋亡比例;蛋白免疫印迹法(Western bolt, WB)检测自噬相关蛋白LC3、beclinl水平,凋亡相关蛋白bax、bcl-2、细胞色素C水平及AMPK、mTOR,总蛋白及其磷酸化的水平,透射电镜观察自噬体的形成,荧光显微镜观察AVO阳性细胞。 结果：H/SD条件下ATV可以升高自噬细胞比例、增加LC3-Ⅱ的表达并促进自噬体的形成。自噬抑制剂3-MA在抵消ATV自噬促进作用的同时也增加了ATV组MSCs的凋亡率和促凋亡蛋白bax和细胞色素C的表达。与H/SD对照组相比,ATV各组AMPK的磷酸化水平显著升高而mTOR磷酸化水平显著下降。与ATV组相比,AMPK抑制剂Compound C组的AMPK磷酸化水平下降,mTOR磷酸化水平升高,并且MSCs自噬水平显著被抑制。 结论：ATV可以抑制H/SD诱导的大鼠MSCs凋亡,这种保护机制主要与AMPK/mTOR通路介导的自噬激活有关。 目的：骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)被广泛用于心肌再生医学研究。已有的证据表明急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)后移植MSCs可以改善心功能,但由于AMI后缺血缺氧等恶劣的微环境导致大部分移植MSCs死亡而使其疗效受限。他汀类药物具有抗炎、抗氧化等多效性,能够提高移植疗效,但具体机制不清。因此,本实验在体外建立H9C2心肌细胞系缺氧/无血清(hypoxia/serum deprivation, H/SD)模型,并通过性别错配法在心梗大鼠体内移植异体骨髓MSCs,观察阿托伐他汀(atorvastatin, ATV)对移植MSCs存活及疗效的影响,并进行相关信号通路的分析和机制探讨。 方法：体外实验分为浓度梯度实验与机制探讨两部分。其中浓度梯度部分设为正常组(normal组)、缺氧/无血清对照组(H/SD组)、阿托伐他汀各浓度组(ATV0.001μM、ATV0.01μM、ATV0.1μM、ATV1μM、ATV10μM)共7组;机制探讨部分设为normal组、H/SD组、最适ATV浓度组、焦磷酸牦牛儿基牦牛儿酯组(geranyl geranyl pyrophosphate, GGPP10μM)、ATV+GGPP组共5组。分别以Western Blot及ELISA方法检测相关因子及信号通路的水平变化。体内试验将140只雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠(6-8周龄)随机分为7组(每组20只)：假手术组(Sham)、AMI对照组(AMI)、单纯阿托伐他汀组(ATV),单纯MSCs移植组(MSCs),联合ATV+MSCs移植组(ATV+MSCs),联合ROCK抑制剂法舒地尔组(Fasudil), Fasudil+MSCs移植组(Fasudil+MSCs)。通过开胸结扎冠状动脉左前降支模拟AMI,30分钟后给予心肌内注射MSCs60μ

关键词： 慢病毒   基因修饰   骨髓间充质干细胞   碱性成纤维生长因子血管再生   肢体缺血  

摘要： 目的 探讨以慢病毒为载体介导人碱性成纤维生长因子（human basic fibroblastgrowth factor,hbFGF）基因修饰骨髓间充质干细胞（bone marrow stem cell,BMSC）治疗肢体缺血的可行性。 方法 1、采用密度梯度离心方法获取SD(Sprague Dawley)大鼠BMSC，用含有10%胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)作为培养基，获取第3—5代BMSC。 2、以慢病毒构建人碱性成纤维生长因子基因载体，转染大鼠BMSC，获取人碱性成纤维生长因子基因修饰BMSC。 3、24只SD大鼠均切除右侧股动脉及其分支，形成后肢缺血模型鼠。成模后随机分为4组（每组6只）：bFGF-BMSC组，缺血后肢肌内多点注射bFGF基因修饰的BMSCs；GFP-BMSC组，缺血后肢肌内多点注射携带绿色荧光蛋白（greenfluorescent protein，GFP）空载病毒转染的BMSCs;BMSC组，缺血后肢肌内多点注射普通BMSCs；PBS组，肌内注射与前者等体积的磷酸盐缓冲液（phosphatebuffer saline，PBS）。 4、细胞移植4周后，取内收肌和腓肠肌组织，一部分用于冰冻切片，记数微血管密度并观察移植细胞的改变；另一部分用于western blot实验，检测bFGF、VEGF等在动物体内的表达。 结果 1、通过密度梯度离心方法，可获得相对纯化的BMSC。 2、 BMSCs接受慢病毒转染2d后，在荧光显微镜下观察到强烈的绿色荧光。 3、细胞移植2周后，受体动物体内可见绿色荧光阳性细胞，其中GFP-BMSC组，GFP+细胞数（15.4±3.85）个/视野低于bFGF-BMSC组（26.6±3.51）个/视野（t=4.811，P=0.001） 4、干细胞在体内分化为血管内皮细胞，但是GFP-BMSC组的GFP+CD31+细胞数（7.0±2.12）/视野低于bFGF-BMSC组（14.0±1.58）/视野（t=5.916，P=0.000）。 5、 BMSC组微血管密度为（24.0±4.3）/视野，明显高于PBS组（8.8±4.5）/视野（t=2.65，P=0.017）；GFP-BMSC组（28.6±4.2）/视野，与BMSC组无差异（t=0.8，P=0.434）；bFGF-BMSC组（55.0±16.5）/视野，高于BMSC组（t=5.4，P=0.000） 6、实验动物接受细胞移植2周后，在bFGF-BMSC组动物缺血区的肌组织中，能够通过western blot检测到人源性bFGF。 结论 慢病毒介导的基因修饰细胞可在体内存活，人碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的BMSC，可在受体体内存活并表达人碱性成纤维细胞生长因子，以此促进BMSC在体内分化为血管内皮细胞，促进受体缺血区的血管再生，而不对受体动物产生危害。

关键词： 大鼠   骨髓间充质干细胞   脂肪源性干细胞   脊髓损伤   抗凋亡  

摘要： 一、脂肪源性干细胞和骨髓间充质干细胞的培养和鉴定 目的：体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）和脂肪源性干细胞（rADSCs），通过形态学、表面标记物和成骨、成脂及成神经诱导分化鉴定，为后续实验提供充足的细胞来源。 方法：采用反复贴壁培养法分离培养rBMSCs， I-型胶原酶消化加贴壁培养法分离培养rADSCs，通过流式细胞仪（FCM）以CD29、CD34和CD90表面标记物鉴定rBMSCs，以CD29、CD34、CD45和CD90表面标记物鉴定rADSCs，并分别进行成骨、成脂、成神经诱导分化，成骨诱导以碱性磷酸酶和Von Cassa染色鉴定，成脂肪细胞以油红染色进行鉴定，以NSE、MAP2免疫细胞化学染色鉴定成神经分化。结果：反复贴壁培养法分离培养的rBMSCs和I-型胶原酶消化加贴壁培养法分离培养的rADSCs，经3代培养后细胞增殖速度都较好，形态较为均一。表面标记物检测显示rBMSCs阳性表达CD29和CD90，阴性表达CD34。rADSCs阳性表达CD90和CD29，阴性表达CD34和CD45。rBMSCs和rADSCs分别经诱导分化后都出现成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞形态，经碱性磷酸酶、Von Cossa染色证实为成骨细胞，经油红染色证实为脂肪细胞，经NSE和MAP2免疫细胞化学染色鉴定证实为神经细胞。3代培养后细胞大量繁殖。 结论：采用反复贴壁培养法分离培养rBMSCs和I-型胶原酶消化加贴壁培养法分离培养rADSCs，经过3代培养后可获得相对纯化，细胞生长状态较好，通过诱导分化检测，表明两者都具有多向分化能力。 二、脂肪源性干细胞和骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤大鼠脊髓神经细胞凋亡的影响。 目的：比较rBMSCs和rADSCs移植治疗大鼠脊髓损伤的抗凋亡作用。 方法：6周龄SD大鼠8只，用于rBMSCs和rADSCs的分离培养。成年SD大鼠96只，根据手术方式和移植物不同随机分为6（A～F）大组，每组16只，每组又按照处死时间不同分为两组，每个亚组8只，共12组：***假手术14天组；***假手术28天组；***手术14天组；***手术28天组；***假手术14天组；***假手术28天组；D1. rBMSCs手术14天组；D2. rBMSCs手术28天组；***假手术14天组；E2. rADSCs假手术28天组；F1. rADSCs手术14天组；***手术28天组。各模型组均以改良Allen法制造大鼠下胸段脊髓损伤模型，假手术组仅咬除相应节段棘突及椎板，不干预脊髓。造模后7天，于腰椎水平(L4/L5间隙)蛛网膜下腔向各组注射相应移植物。观察各组动物造模前后及移植前后后肢运动功能，以BBB评分对其进行评估。按组别相应于移植术后第14天、第28天处死大鼠，灌注后以损伤节段或相应节段为中心取脊髓组织，石蜡包埋后行HE染色，原位末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的脱氧尿苷三磷酸(d-UTP)缺口末端标记技术(TUNEL)染色观察。 结果：12组大鼠在造模前BBB评分均为21分(满分)。术后麻醉苏醒后，假手术组（A1、A2、C1、C2、E1、E2）大鼠BBB评分恢复到21分。手术组（B1、B2、D1、D2、F1、F2）大鼠造模术后第3天和第7天BBB评分均低于假手术组，有统计学意义(P<0．05)。rBMSCs移植治疗后，rBMSCs手术组（E1、E2）大鼠BBB评分持续增加，高于PBS手术组（B1、B2）大鼠（P<0.05）。但仍低于rBMSCs假手术组（C1、C2），有统计学差异(P<0.05)。rADSCs移植治疗后，rADSCs手术组（F1、F2）大鼠BBB评分也持续增加，高于PBS手术组（B1、B2）大鼠（P<0.05），但仍低于rADSCs假手术组（D1、D2），具有统计学差异(P<0.05)。rBMSCs手术组（E1、E2）和rADSCs手术组（F1、F2）大鼠BBB评分无明显差异（P>0.05）。PBS假手术组（A1、A2）大鼠BBB评分无明显变化。从移植术后第7天开始，rBMSCs手术组和rADSCs手术组大鼠BBB评分均高于相对应假手术组，有统计学差异(P<0.05)。脊髓组织切片行HE染色结果：移植后14天、28天，假手术组（A1、A2、C1、C2、E1、E2）脊髓组织切片均正常。各手术组（B1、B2、D1、D2、F1、F2）脊髓组织切片均可见空洞形成，PBS手术组空洞形成更为明显。移植术后14天，PBS手术组（B1）TUNEL染色细胞数多于rBMSCs手术组（D1）和rADSCs手术组（F1），有统计学差异(P<0.05)。而rBMSCs手术组（D1）和rADSCs手术组（F

关键词： 多肽   自组装   纳米纤维   凝胶   支架   功能性   多肽   自组装   髓核细胞   髓核组织工程   功能性   多肽   自组装   骨髓间充质干细胞   髓核组织工程   功能性   多肽   自组装   骨髓间充质干细胞   髓核组织工程  

摘要： 第一部分功能性多肽的合成及功能性多肽自组装成纳米纤维凝胶 目的：设计合成含有连接蛋白核心序列Link N的功能性多肽两亲性分子RLN,研究其自组装形成凝胶支架的超微结构。 方法：将RADA16和RLN多肽分别溶解于10%无菌蔗糖溶液中,浓度为1%(10mg/ml, m/v),将RADA16与RLN多肽溶液等比例混合(1：1)并用等体积细胞培养基DMEM/F12溶液触发多肽自组装,原子力显微镜检测。 结果：成功合成RADA16和RLN多肽两亲性分子,多肽溶液RLN与RADA16 (1:1)混合自组装形成凝胶。原子力显微镜检测显示：单独RLN多肽不能自组装形成纳米纤维,RADA16和RLN混合多肽(1：1)自组装形成纳米纤维,直径D=31.9±3.8mm,长度可达到几微米。 结论：多肽RADA16和RLN可以自组装形成纳米级凝胶支架(RLN/RADA16, LN-NS),其可以作为髓核组织工程的生物支架材料。 第二部分功能性自组装多肽纳米纤维凝胶支架对髓核细胞生物学行为的影响 目的：研究自行设计的新型、功能性LN-NS凝胶支架对兔髓核细胞生物学行为的影响。 方法：取3周龄普通级日本大耳白兔,无菌条件下取其胸腰段椎间盘髓核组织,Ⅱ型胶原酶消化提取髓核细胞,透射电镜鉴定髓核细胞。在RLN/RADA16多肽混合溶液和RADA16多肽溶液中加入等量细胞培养基DMEM/F12溶液,触发形成LN-NS和RADA16凝胶支架。收集兔髓核细胞,制备单细胞悬液,将细胞接种于多肽凝胶支架材料的内部或表面,钙黄绿素/碘化丙啶(Calcein-am/PI)检测细胞在凝胶内部的存活情况,激光共聚焦显微镜观察细胞三维迁移情况,CCK-8试剂盒检测凝胶支架材料对髓核细胞的黏附情况,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测髓核细胞中聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA的表达,观察功能性功能性LN-NS凝胶支架的细胞学毒性及对髓核细胞黏附、三维迁移及细胞外基质分泌的影响。 结果：髓核细胞贴壁后呈团簇状生长,细胞分为两类：圆形或类圆形的脊索细胞,梭形或多角形的类软骨细胞。透射电镜显示两种细胞内均由大量糖原聚集,其中脊索细胞中含有大小不等的囊泡。Calcein-am/PI检测发现功能性LN-NS凝胶支架无明显的细胞学毒性；激光共聚焦显微镜三维重建图像证实功能性LN-NS凝胶支架明显促进了髓核细胞向凝胶材料内部的迁移；CCK-8试剂盒检测发现功能性LN-NS凝胶支架较RADA16凝胶支架明显促进了细胞的黏附；RT-PCR检测证实功能性LN-NS凝胶支架明显促进了髓核细胞中聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA的表达。 结论：成功分离培养兔椎间盘髓核细胞；功能性自组装多肽纳米纤维凝胶材料LN-NS具有良好的细胞相容性和生物学活性,具有支架和生物活性双重作用,可作为椎间盘组织工程支架材料。 第三部分功能性自组装多肽纳米纤维凝胶支架对骨髓间充质干细胞生物学行为的影响 目的：研究自行设计的功能性LN-NS凝胶支架对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)生物学行为的影响。 方法：取5周龄普通级日本大耳白兔股骨骨髓,淋巴细胞分离液法分离纯化BMSCs,流式细胞仪检测CD44、D29、D34、D45等表面抗原的表达。收集第三代兔BMSCs,制备单细胞悬液,将BMSCs接种于LN-NS(实验组)和RADA16(对照组)多肽凝胶支架材料的表面,钙黄绿素/碘化丙啶(Calcein-am/PI)检测凝胶材料对BMSCs的毒性情况,CCK-8试剂盒检测凝胶支架材料对髓核细胞的黏附及增殖情况,免疫荧光检测BMSCs细胞外基质(II型胶原)的分泌情况,观察功能性LN-NS凝胶支架对兔BMSCs生物学行为的影响。 结果：纯化细胞贴壁后呈形态均一的长梭形或纺锤形,旋涡状生长,流式细胞仪检测法显示：纯化细胞高表达CD29、CD44,阳性率分别为88.1%和96.2%；低表达CD34、CD45,阳性率分别为3.9%、4.4%。Calcein-am/PI检测发现功能性LN-NS多肽凝胶支架与RADA16凝胶支架具有相似的细胞学毒性；CCK-8试剂盒检测发现功能性LN-NS多肽凝胶支架较RADA16凝胶支架明显促进了细胞的黏附；免疫荧光检测发现培养在功能性LN-NS多肽凝胶支架上的细胞II型胶原分泌高于对照组。 结论：成功分离培养兔BMSCs;功能性LN-NS多肽凝胶材料具有良好的细胞相容性和生物学活性,是一种有前途的髓核组织工程材料。 第四部分功能性自组装多肽纳米纤维支架联合兔骨髓间充质干细胞治疗兔椎间盘退行性变的实验研究 目的：观察功能性LN-NS多肽凝胶材料与兔BMSCs联合移植治疗兔椎间盘退行性变的效果。 方法：采用纤维

关键词： 激素性股骨头坏死   动物模型   髓芯减压   骨髓间充质干细胞(BMSCs)   血管内皮生长因子-α(VEGF-α)  

摘要： 研究目的 股骨头坏死包括骨细胞、骨髓组织和脂肪细胞的坏死,晚期股骨头会发生塌陷、变形,髋关节间隙变窄甚至消失,临床表现主要为髋关节疼痛和活动范围受限。目前该病早期缺乏有效的治疗方法,晚期只有全髋关节置换术(THA)才可以有效改善髋关节功能。在非创伤性股骨头坏死中,激素性股骨头坏死的发病率最高,其发病年龄低、病情进展快的特点决定了很多患者在比较年轻的时候接受了THA。由于假体寿命的限制,年轻时接受该手术难免要行1次甚至多次翻修术,不仅要承受多次手术的痛苦和经济压力,翻修术的效果也明显不如初次置换,因此,在激素性股骨头坏死的早期控制病情发展具有十分重要的意义。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是组织工程常用的种子细胞,在股骨头坏死的治疗中有着广阔的应用前景,就BMSCs的来源、分离与培养方法、移植途径等方面还需进一步研究。血管内皮生长因子(VEGF)在骨与血管生成的调控中居于中心地位,在其5种异构体中VEGF-α是发挥作用的主要成分,其表达水平可有效反映骨组织的生理状态。目前对骨组织中该因子表达的研究多停留在定性阶段,我们采用荧光定量PCR (RT-PCR)技术定量比较不同组之间VEGF-α的表达水平,可以更精确的分析BMSCs移植后骨组织生理状态的变化。本研究采用激素法建立股骨头坏死动物模型,从自体胫骨骨髓中分离BMSCs体外培养并移植,在组织病理学观察的基础上采用RT-PCR技术定量检测VEGF-α的表达来评估治疗效果,以探索早期股骨头坏死的治疗方法。 材料与方法 实验一 1.约3月龄的新西兰大白兔20只,随机分为模型组与对照组,每组10只,模型组肌肉注射甲泼尼龙琥珀酸钠20mg/kg,共1次,对照组同时肌肉注射等量生理盐水。所有动物肌肉注射青霉素钠4×105IU,每周2次。 2.给药6周后,空气栓塞法处死所有动物,严格无菌操作取下双侧股骨头,一侧置于10%福尔马林溶液中固定,另一侧冻存于-80℃低温冰箱中,分别用于组织病理观察和RT-PCR检测。 实验二 1.约3月龄新西兰大白兔30只,随机分为A(动物模型组)、B(生理盐水组)、C (BMSCs治疗组)3组,每组各10只。所有动物采用与实验一相同的方法建立动物模型,用药后肌肉注射青霉素钠4×105IU,每周2次。 2.给药4周后C组动物在静脉麻醉下抽取双侧自体胫骨骨髓约10ml,简单离心法分离BMSCs并体外培养,传代1次后制成细胞悬液。 3.C组动物静脉麻醉后用手摇钻在左侧大转子下钻孔,将细胞悬液注入骨髓腔,B组动物采用相同方法注入等量生理盐水,术后所有动物肌肉注射青霉素钠4×105IU,每天1次,5天后改为每周2次。 4.移植术后4周空气栓塞法处死所有动物,严格无菌操作取出左侧股骨头,沿冠状面剖开,一半置于10%福尔马林溶液中固定用于组织病理观察,另一半冻存于-80℃低温冰箱中留作RT-PCR检测,观察VEGF-α表达的变化。 结果 实验- 组织病理切片(HE染色)：模型组9例标本进入结果分析,病理观察可见软骨下区骨组织内出现大量空骨陷窝,脂肪细胞体积与排列紊乱,细胞边界不清,骨髓组织中细胞数量减少、细胞核固缩,可见均质红染的坏死区,部分标本可见骨小梁断裂,模型组9例标本中有7例诊断为骨坏死,对照组没有标本符合骨坏死诊断标准。]RT-PCR检测：模型组VEGF-α的表达较对照组明显降低。 实验二 组织病理切片(HE染色)：C组标本中空骨陷窝的分布明显少于另外两组,脂肪细胞的体积与排列较A、B两组规则,骨髓组织中细胞非常密集；而A、B两组脂肪细胞体积与排列紊乱,细胞边界不清,骨髓组织中细胞数量较少,可见均质红染的坏死区。C组中有2例诊断为骨坏死,而A、B组中各有7例符合骨坏死诊断标准。 RT-PCR检测：C组VEGF-α的表达最高,与A、B组相比均有统计学差别,A组和B组之间的差别没有统计学意义。 结论 1.短期大剂量糖皮质激素冲击可显著抑制血管内皮生长因子-α (VEGF-α)的表达。 2.兔自体胫骨骨髓是骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可靠来源,简单离心法分离纯化后体外培养可满足治疗的需要。 3.自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植可显著上调血管内皮生长因子-α(VEGF-α)(?)表达,是治疗兔早期激素性股骨头坏死的有效方法。 4.1次肌肉注射甲泼尼龙琥珀酸钠20mg/kg可成功建立兔激素性股骨头坏死的动物模型。