关键词： 心脏移植   急性排斥反应   间充质干细胞   miRNA-204-3p   巨噬细胞极化  

摘要： 研究背景:心脏移植(heart transplantation,HTx)是目前治疗各种原因导致的终末期心脏疾病的有效手段。随着外科技术的进步和免疫抑制剂的广泛应用,心脏移植的死亡率已明显下降,但术后发生的急性和慢性排斥反应仍然是严重影响患者生存的重要原因。其中急性排斥反应发生在移植术后早期,表现为严重的心肌水肿及坏死,大量的炎性细胞浸润。相比于慢性排斥反应,在急性排斥反应期间,移植心肌中充斥着更多的炎性细胞,造成更为强烈的细胞因子风暴,也就需要增加免疫抑制的强度。然而,免疫抑制剂的不良反应,如感染、骨髓抑制、肝肾功能损害以及肿瘤生成等,已经严重影响到心脏移植患者的生活质量和长期生存。因此,寻找一种可替代性的方法,对于治疗心脏移植的急性排斥反应具有重要的临床意义。巨噬细胞是心脏移植术后参与急性排斥反应的主要细胞。根据不同的激活方式,巨噬细胞可以被极化为经典活化型的M1型(classically activated macrophages)和可替代活化型的M2型(alternatively activated macrophages)。其中,具有抗炎作用的M2型巨噬细胞,能够在心脏移植反应的急性期起到抑制排斥反应的作用。同时,M2型巨噬细胞可以分泌具有较强抗炎作用的细胞因子IL-10,参与拮抗排斥反应。目前的研究表明,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可以通过促进巨噬细胞向M2极化实现抑制排斥反应的目的。然而,MSCs影响巨噬细胞极化的潜在机制尚不完全清楚。因此,促进MSCs在移植心脏组织中的浸润并加强其对巨噬细胞的极化作用对于减轻急性排斥反应具有重要的意义。间充质干细胞是一类起源于中胚层的具有多向分化潜能和低免疫原性的干细胞,主要来源于骨髓、脐带和脂肪。MSCs具有旁分泌作用,其分泌大量的活性分子是MSCs实现其功能的生物学基础。已应用于临床上多种疾病的治疗,主要包括免疫调节、血管生成和趋化作用等方面的应用,均取得了理想疗效,具有广泛的应用前景。研究表明,移植的MSCs发挥效果与迁移和归巢的能力密切相关。在众多趋化因子中,基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1a)是对MSCs趋化作用最强的趋化因子,MSCs 表面的 CXC 亚族趋化因子受体 4(CXC motif chemokine receptor4,CXCR4)是SDF-1a的特异性受体,CXCR4的高表达增强了 MSCs迁移和归巢能力。近年来研究已表明,肿瘤细胞表面的CXCR4可以促进肿瘤微环境中的巨噬细胞极化为M2型的巨噬细胞,后者可以促进肿瘤的进展。然而,目前尚未有报道表明MSCs表面的CXCR4是否对巨噬细胞有类似的极化作用。因此,我们的研究旨在明确MSCs表面的CXCR4对巨噬细胞极化的影响,能否诱导巨噬细胞成为抗炎的类型,以利于实现MSCs降低心脏移植术后急性排斥反应的目的。本研究旨在通过病毒转染MSCs,构建CXCR4过表达和沉默的模型,观察CXCR4对于MSCs的增殖、迁移的影响。构建心脏移植后急性排斥反应和免疫耐受的动物模型,研究免疫抑制剂CsA在急性排斥反应中对巨噬细胞的影响,为MSCs替代治疗提供依据。MSCs与巨噬细胞共培养,通过验证表型,明确MSCs表达的CXCR4能否影响巨噬细胞向M2型极化,成为治疗免疫排斥反应的靶点。通过数据库检索,预测出能够与CXCR4特异性结合的上游miRNA分子,通过双荧光素酶报告基因实验验证CXCR4为其靶分子。用脂质体转染MSCs,建立该miRNA的mimics和inhibitor模型,以及构建miRNA与慢病毒构建的CXCR4的双转染模型,继续验证该miRNA通过靶向作用于CXCR4能否调控MSCs的增殖、迁移。另外,验证该miRNA通过调控CXCR4是否影响巨噬细胞向M2类型极化,以发挥心脏移植术后的免疫调控作用。总的来说,本实验探讨MSCs表达的CXCR4对其增殖、迁移和免疫调控能力的影响及其机制,以实现能够降低心脏移植后急性排斥反应的目的。本研究包括以下三个部分。第一部分 CXCR4促进MSCs的增殖、迁移目的:通过慢病毒转染骨髓间充质干细胞(MSCs),构建CXC亚族趋化因子受体4(CXCR4)的过表达和沉默的细胞模型,研究CXCR4对于MSCs的增殖、迁移的影响。方法:1.用不同MOI(10、20、40、60、80、100)的慢病毒载体转染MSCs,72h后根据转染后的荧光强度和细胞状态,选择最佳MOI值进行后续实验。将构建的CXCR4过表达和沉默及其阴性对照的慢病毒载体转染MSCs。实验分四组:Ⅰ.NC-sh-CXCR4组;Ⅱ.sh-CXCR4 组;Ⅲ.NC-oe-CXCR4 组;Ⅳ.oe-CXCR4 组。转染 7

关键词： 炎症性肠病   骨形成   间充质干细胞   Wnt信号通路   外泌体  

摘要： 研究背景炎症性肠病(IBD)是慢性肠道炎症性疾病,肠源性炎症因子可经循环影响其他器官,IBD相关骨病是常见肠外并发症。破骨细胞过度激活和血清标志物升高证明骨吸收增加,而对骨形成的了解则较为缺乏。目前骨丢失的治疗以抗骨吸收药物为主,但促骨合成代谢更适于改善骨量低下,故明确IBD中骨形成的变化有利于开发有效的干预手段。骨形成由成骨细胞介导,与脂肪细胞共同起源于骨髓间充质干细胞(BMSC)。炎症因子能抑制BMSC增殖和成骨分化来减少骨形成,导致骨量和质量降低、骨髓脂肪组织积累。靶向给药调节BMSC分化命运能使其倾向于成骨而非成脂分化来改善骨丢失,因此是通过促骨合成代谢治疗IBD相关骨病的可行策略。BMSC增殖分化与血管生成相关,涉及血管内皮细胞迁移,共同组成“BMSC-内皮细胞生态位”。E-selectin在血管内皮细胞上表达,与配体高尔基糖蛋白1(GLG1)结合使循环中的细胞靶向骨组织。外泌体是天然的细胞外囊泡,生物相容性和循环稳定性优良,根据受体-配体相互作用还可被修饰为靶向载药纳米颗粒。本课题中我们通过体内实验明确IBD相关骨病中骨量、骨质量、骨形成、骨髓脂肪积累的变化,通过体外实验探讨IBD相关骨病中BMSC的成骨和成脂分化潜力以及炎症影响BMSC成骨分化的潜在机制,最终评估基于外泌体的靶向BMSC载药纳米颗粒对IBD相关骨病的治疗效果。研究目的第一部分:明确小鼠模型中IBD对松质骨、皮质骨、骨力学性能、骨髓脂肪组织以及骨形成、成骨细胞数量、脂肪细胞数量的影响。第二部分:探讨来源于IBD小鼠骨髓的BMSC在体外培养中的增殖能力、成骨和成脂分化潜力以及细胞信号通路变化,在体外模拟BMSC炎症微环境探索其影响BMSC成骨分化的潜在机制。第三部分:构建基于GLG1外泌体的靶向BMSC载药纳米颗粒,评估其治疗IBD相关骨病的效果。研究方法第一部分:(1)葡聚糖硫酸钠和吡罗昔康构建IBD小鼠模型。(2)μCT检查骨量和骨髓脂肪组织量。(3)应力实验评估股骨力学性能。(4)钙黄绿素双标实验评估小鼠股骨骨形成率(BFR)和矿物沉积率(MAR)。(5)H&E染色、TRAP染色、Goldner三色染色评估结肠和股骨组织形态学变化。(6)免疫荧光(IF)和免疫组织化学(IHC)染色评估成骨细胞和脂肪细胞数量。(7)q RT-PCR和WB检测成骨、成脂分化相关基因的表达。第二部分:(1)q RT-PCR检测细胞因子、成骨和成脂分化相关基因转录水平。(2)流式分选收集小鼠骨髓中的BMSC。(3)集落形成实验评价BMSC增殖能力。(4)茜素红染色、碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色评价BMSC成骨分化潜力,油红染色评价成脂分化潜力。(5)转录组测序(RNA-seq)探究BMSC细胞信号通路基因差异表达。(6)TNF-α体外模拟BMSC炎症微环境。(7)Co-IP检测β-catenin-p50相互作用。(8)IB检测β-catenin和NF-κB通路下游分子细胞内总量。(9)荧光素酶报告基因实验评估β-catenin转录活性。(10)放线菌酮追踪实验评估β-catenin降解速率。(11)Ch IP实验评估β-catenin调控的成骨分化相关基因的转录活性。第三部分:(1)构建过表达GLG1的NIH-3T3细胞系。(2)超速离心法收集外泌体,挤出法搭载Wnt通路激活剂,构建GLG1载药纳米颗粒(NP)。(3)透射电镜、粒径分析以及WB评估NP表征。(4)活体荧光成像检测NP的体内分布。(5)IF染色评估NP、血管内皮细胞以及BMSC的位置。(6)参照第一部分方法评价小鼠股骨或骨痂的骨量、骨髓脂肪组织量、力学性能、BFR、MAR、成骨细胞以及脂肪细胞数量。(7)番红固绿染色评估股骨软骨痂和矿化骨痂。研究结果第一部分:(1)IBD小鼠均表现出结肠短缩、体重减轻、结肠炎症浸润等。(2)μCT结果显示IBD小鼠相比于对照组,松质骨减少、皮质骨变薄、骨髓脂肪组织增多。(3)应力实验结果显示IBD小鼠股骨力学性能下降。(4)钙黄绿素双标实验显示IBD小鼠股骨BFR和MAR下降。(5)组织形态学染色证明IBD小鼠股骨松质骨和类骨质减少而脂肪细胞和破骨细胞增多。(6)IF、IHC染色分别显示IBD小鼠股骨内成骨细胞减少、脂肪细胞增多。(7)IBD小鼠成骨分化相关基因表达减少、成脂分化相关基因表达增加。第二部分:(1)IBD小鼠骨组织内的炎症因子转录水平高于对照组。(2)IBD小鼠的BMSC相比于对照组,形成集落数量更少,成骨诱导后碱性磷酸酶分泌和钙盐沉积更少,成脂诱导后含脂滴的细胞数量更多。(3)RNA-seq结果经GO分析、KEGG分析、GSEA分析后表明IBD小鼠BMSC中Wnt/β-catenin信号通路下调而PPARγ信号通路上调(p<0.05)。(4)T

关键词： 类风湿关节炎   人骨髓间充质干细胞   COX-2   TGF-β3   定向分化能力   关节腔内移植   炎症反应   关节软骨   核磁共振   卵清蛋白诱导型类风湿关节炎模型  

摘要： 研究背景类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性自身免疫性疾病,它会影响关节、结缔组织以及相关的骨骼和血管,并伴有全身的代谢和心理疾病的合并症。目前,RA的治疗药物可分为四大类:包括非甾体抗炎药(NSAIDs)、皮质类固醇、非生物性病情缓解抗风湿药(DMARDs)和生物性DMARDs。然而,相当多的RA患者对上述药物的治疗并不耐受或出现不同程度的耐药,从而无法控制病情发展最终导致关节毁损。严重的类风湿性关节炎将通过关节置换等手术方案治疗,给病人身体、心理以及经济带来沉重负担。因此,寻找其它治疗RA的分子靶点和方法是目前治疗RA的一个巨大的挑战。在细胞疗法中,间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)存在于骨髓、外周血、脂肪、滑膜和其他中胚层组织中,其具有分化成各种间充质谱系的能力,包括成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。此外,MSCs在调节T、B细胞的增殖和分化、树突状细胞的成熟和NK细胞的活性方面表现出强大的免疫抑制作用,已被应用于治疗多种自身免疫性疾病。目前,基因治疗为改善RA动物模型方面开辟了有趣的前景并取得了重大进展。环氧化酶(cyclooxygenase,COX)有两种亚型,包括介导生理功能的组成型COX-1和将花生四烯酸转化为前列腺素的诱导酶COX-2。COX-2在炎症发反应期对产生前列腺素E2(PGE2)起关键作用。转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)与多种风湿性和自身免疫性疾病有关。作为炎症反应的主要细胞因子,TGF-β促进T细胞分化,具有抑制和调节活性。在TGF-β的三种亚型中,TGF-β3通过增加基质沉积和促进软骨分化对MSCs表现出强烈的软骨形成作用。本研究利用组织工程和基因修饰的方法同时下调人骨髓间充质干细胞中的COX-2基因、过表达TGF-β3基因,经新型超顺氧化铁颗粒(Molday ION Rhodamine-BTM,MIRB)标记后移植入卵清蛋白诱导的类风湿关节炎(antigen-induced arthritis,AIA)模型关节腔内。进一步探究双基因双向调控的人骨髓间充质干细胞在类风湿关节炎中潜在的治疗效果。第一部分COX-2联合TGF-β3双基因双向调控、新型超顺磁性氧化铁颗粒标记人骨髓间充质干细胞定向分化能力的实验研究研究目的研究经COX-2基因沉默、TGF-β3基因过表达、新型超顺磁性氧化铁颗粒标记的人骨髓间充质干细胞定向分化能力的测定。研究方法1、利用组织工程原理,在人骨髓间充质干细胞中下调COX-2基因和过表达TGF-β3基因。2、采用实时荧光定量PCR检测双基因转染后人骨髓间充质干细胞中PGE2、SOX9、ACAN的mRNA表达水平,Western blot检测干细胞中COX-2和TGF-β3蛋白表达水平。3、选择MIRB标记双基因转染的人骨髓间充质干细胞并进行普鲁士蓝染色检测,分别通过油红O染色、茜素红S染色、阿利新蓝染色测定双基因转染后人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨的定向分化能力。研究结果1、在慢病毒转染48小时后通过荧光显微镜观察并计算病毒转效率。Lenti-shCOX-2在MOI=50时转染率约为90%,Lenti-TGF-β3在MOI=70时转染率约为80%。经慢病毒介导的双基因转染组hBMSCs有少数细胞漂浮死亡,但转染效率不受影响。2、经慢病毒转染后,通过PCR检测发现Lenti-shCOX-2和双基因共转染组的PGE2 mRNA水平显著降低(P<0.01)。Lentit-TGF-β3和双基因共转染组SOX9、ACAN mRNA水平显著升高。利用Western blotting检测发现Lenti-shCOX-2和双基因共转染组COX-2蛋白表达的灰度值显著低于空白对照组(P<0.05)。Lenti-TGF-β3及双基因共转染组TGF-β3蛋白水平显著升高(P<0.05)。3、荧光显微镜显示慢病毒携带绿色荧光EGFP在细胞质和细胞核内表达。MIRB标记后,在细胞质中发现红色荧光。普鲁士蓝染色同时证明了细胞质内铁的存在。在成骨和软骨分化方面,MIRB标记的Lenti-TGF-β3和双基因转染组中钙结节密度和细胞外基质蓝色深染程度明显高于其他组。结论1、shCOX-2和TGF-β3基因可通过慢病毒介导高效转染人骨髓间充质干细胞。经慢病毒转染后人骨髓间充质干细胞中COX-2基因沉默、TGF-β3实现高表达。2、MIRB标记不影响转基因人骨髓间充质干细胞的定向分化能力,TGF-β3转染促进人骨髓间充质干细胞成骨和成软骨分化。第二部分关节腔内移植双基因双向调控的人骨髓间充质干细胞对卵清蛋白诱导的兔类风湿关节炎模型的治疗评估研究目的评估关节腔内移植COX-2基因沉默、

关键词： 糖皮质激素   股骨头缺血性坏死   骨髓间充质干细胞   HIF-1α  

摘要： 目的 糖皮质激素(glucocorticoids,GCs)诱导的股骨头缺血性坏死(avascular osteonecrosis of femoral head,AOFH)是一种破坏性并发症,目前尚无治愈方法。研究表明,移植骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)可能阻止塌陷前AOFH的进展。基于以往的研究,本课题假设GCs通过环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)-前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE-2)-缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)轴诱导AOFH,并且对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)进行HIF-1α修饰后移植可能会提高其治疗效果。 方法 1.分离野生型(wildtype,WT)小鼠BMMSCs,用地塞米松(dexamethasone,Dex)和PGE-2处理细胞,通过Western Blotting实验和免疫荧光(immunofluorescence,IF)染色等实验评估Dex对COX-2-PGE-2-HIF-1α轴的影响。 2.分离EP1基因敲除(EP1-/-)、EP2基因敲除(EP2-/-)和EP4flox/flox小鼠BMMSCs,其中用Cre腺病毒(Ad-Cre)感染EP4flox/flox小鼠BMMSCs,用PGE-2处理各组BMMSCs,Western Blotting评估PGE-2对各组细胞HIF-1α蛋白表达的影响。 3.通过显微镜下观察、micro-CT扫描和3D重建以及免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色评估COX-2 基因敲除(COX-2-/-)小鼠股骨头结构。 4.通过体外管形成、胎鼠跖骨血管生成、IF染色和IHC染色等实验评估PGE-2和Dex对血管生成的影响。 5.将Dex添加到小鼠饮用水中,构建Dex诱导性AOFH小鼠模型。 6.将HIF-1α过表达慢病毒(Lenti-HIF-1α)感染的BMMSCs移植到AOFH小鼠股骨头中,通过micro-CT、3D重建和HE染色评估其产生的影响。 结果 *** 抑制小鼠 BMMSCs 中 COX-2-PGE-2-HIF-1α 轴。 ***-2主要通过EP4受体来调控BMMSCs中HIF-1α的表达。 ***-2-/-小鼠股骨头出现病理改变:窦状隙变小、骨小梁分离度增加,HIF1-α阳性细胞的数量减少。 ***抑制血管生成,而PGE-2增强血管生成,并部分逆转Dex对血管生成的抑制作用。 ***诱导小鼠股骨头坏死,成功建立小鼠AOFH模型。 6.移植Lenti-HIF-1α感染的BMMSCs减少股骨头坏死面积,增强骨修复,阻止小鼠AOFH的进展。 结论 在BMMSCs中,Dex通过抑制COX-2-PGE-2-HIF-1α轴来抑制血管生成和成骨。将过表达HIF-1α的BMMSCs移植到股骨头可阻止Dex诱导的AOFH小鼠中发生骨坏死改变。

关键词： 骨髓间充质干细胞   慢病毒   白细胞介素-10   炎症性肠病   辅助T细胞  

摘要： 目的:构建过表达白细胞介素(Interleukin,IL)10的大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs),研究其对葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium salt,DSS)诱导的小鼠炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)的治疗效果。方法:1、全骨髓贴壁法提取培养BM-MSCs;2、成骨成脂诱导鉴定BM-MSCs的分化能力;流式细胞术检测细胞表面标志物(CD11b、CD29、CD45和CD90)的表达;3、慢病毒(Lentivirus,LV)转染的方式构建过表达IL-10的BM-MSCs。BMMSCs分为三组:MSCs组(未转染的BM-MSCs)、LV-MSCs组(转染含EGFP基因的慢病毒)、IL-10-LV-MSCs组(转染含IL-10&EGFP基因的慢病毒),成骨成脂诱导和流式细胞术分别鉴定LV-MSCs和IL-10-LV-MSCs的分化能力及表面标志物(CD11b、CD29、CD45和CD90)、EFGP的表达水平;CCK8测定三组细胞数量的变化,qPCR和ELISA检测IL-10的表达;4、动物实验分为五组:Control组、DSS+PBS组(4%DSS诱导IBD使用PBS治疗)、DSS+MSCs组(4%DSS诱导IBD使用MSCs治疗)、DSS+LV-MSCs组(4%DSS诱导IBD使用LV-MSCs治疗)和DSS+IL-10-MSCs组(4%DSS诱导IBD使用IL-10-LV-MSCs治疗),使用4%DSS溶液诱导小鼠IBD后通过三次尾静脉注射对小鼠进行治疗,监测五组小鼠的生存时间、疾病活动性指数(Disease activity index,DAI)和体重变化,HE染色和结肠肉眼观察病变部位,qPCR检测结肠组织促炎因子肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、IL-1β和IL-6 m RNA的表达水平;5、LV-MSCs和IL-10-LV-MSCs与IBD小鼠脾脏淋巴细胞共培养检测淋巴细胞亚群T辅助细胞(T helper cell,Th)1、Th17和调节T细胞(Regulatory T cells,Treg)的比例,LV-MSCs和IL-10-LV-MSCs与RAW264.7共培养检测培养上清中TNF-α的分泌水平。结果:1、提取的BM-MSCs具有干细胞典型的长梭形形态,诱导分化后有脂滴和钙结节形成,细胞高表达CD29和CD90,低表达CD11b和CD45;2、LV-MSCs和IL-10-LV-MSCs诱导分化后有脂滴和钙结节形成,细胞高表达CD29和CD90,低表达CD11b和CD45。CCK8显示LV转染对BM-MSCs细胞数量没有影响(P>0.05),流式细胞术表明LV-MSCs和IL-10-LV-MSCs细胞经嘌呤霉素筛选后表达EGFP细胞的比例在75%以上。qPCR和ELISA结果显示LV-MSCs组IL-10 m RNA的表达水平和细胞培养上清液中IL-10的含量未见显著变化(P>0.05,P>0.05),IL-10-LV-MSCs组细胞IL-10 m RNA的表达水平和细胞培养上清液中IL-10的含量显著升高(P<0.01,P<0.001);3、生存曲线、疾病活动性指数、体重变化显示:DSS+PBS组小鼠体重持续下降,DAI持续升高,存活时间不超过8天。DSS+MSCs和DSS+LV-MSCs组小鼠体重下降趋缓偶见回升,两组小鼠间并无明显差异(P>0.05),DAI呈升高趋势但缓于DSS+PBS组,第8天开始不再升高,生存时间延长至10天。DSS+IL-10-LV-MSCs小鼠第7天开始体重不再下降,第11天体重明显回升,DAI第4天起低于另外三组,第6天开始明显下降,第7天与另三组有明显差异(P<0.001),第9天下降至3分以下(P<0.0001),存活时间超过10天。结肠肉眼观和长度统计可见DSS+PBS组小鼠结直肠萎缩变短肠内可见血,DSS+MSCs和DSS+LV-MSCs组小鼠结直肠长度较DSS+PBS组略长,肠内有血(P<0.01)两组之间并无明显差异(P>0.05),DSS+IL-10-LV-MSCs组小鼠结肠长度较DSS+PBS组显著变长(P<0.001),肠内可见成型粪便;4、qPCR结果显示,DSS+MSCs和DSS+LV-MSCs组小鼠IL-1β和IL-6 m RNA表达较DSS+PBS组明显下降(P<0.001),两组之间并无明显差异(P>0.05),DSS+MSCs和DSS+LV-MSCs组小鼠TNF-αm RNA表达较DSS+PBS组明显升高(P<0.001),两组之间并无明显差异(P>0.05),DSS+I

关键词： Au-Fe3O4复合纳米颗粒   磁共振成像   骨髓间充质干细胞   肝硬化   光声成像   给药途径  

摘要： 研究目的目前,肝硬化临床治疗手段有限,治疗效果有待进一步提高。间充质干细胞（MSCs）治疗肝硬化是当前研究的热点。然而,间充质干细胞在体内的分布、迁移和转归等情况尚不清楚,阻碍了MSCs治疗肝硬化的深入研究。如何实现MSCs在体内的实时示踪、定位及在肝脏部位的高效聚集是解决上述难题的关键。因此,本研究设计并制备了金-四氧化三铁复合纳米颗粒（Au-FeOsilica NPs）标记骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）,利用磁共振成像（MRI）和光声成像（PAI）对标记的BM-MSCs进行体内示踪。同时,利用MRI-PAI双模态成像比较经肝动脉途径给药组与经尾静脉途径给药组,BM-MSCs在肝硬化大鼠肝脏及其他重要器官中的分布特点,为优化BM-MSCs治疗肝硬化的给药途径提供科学依据。研究方法1、采用分步法合成Au-FeO silica NPs,首先采用种子介导生长法合成Au纳米粒子,采用共沉淀法合成FeO纳米粒子,再将二者按照2:1的质量比进行混合制备Au-FeO silica NPs。对Au-FeO silica NPs形貌、尺寸、Zeta电位、吸光度、磁性、稳定性及光声-磁共振成像性能等基本特征进行测量。2、采用密度梯度离心法提取大鼠BM-MSCs,进行CD11b、CD29、CD44、CD45、CD70以及CD90表面标志物鉴定。分别用浓度为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0吸光度（OD）的Au-FeO silica NPs标记BM-MSCs。通过CCK-8细胞活性检测、普鲁士蓝染色、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）及光声-磁共振双模态成像筛选Au-FeO silica NPs标记BM-MSCs的适宜参数。利用透射电镜观察Au-FeO silica NPs在BM-MSCs内的聚集情况。通过对标记后的BM-MSCs进行细胞增殖活力检测和表型鉴定,细胞因子分泌水平检测,成脂成骨诱导分化等,验证Au-FeO silica NPs标记BM-MSCs的安全性及可行性。3、采用腹腔注射40%（v/v）的CCl橄榄油混合溶液进行SD大鼠肝硬化模型的建立,建模周期为8周。随后,将SD大鼠肝硬化模型按照给药途径随机分为对照组,经尾静脉给药组（尾静脉组）和经肝动脉给药组（肝动脉组）,每组10只。每只大鼠输注Au-FeO silica NPs标记后的BM-MSCs数量为1×10～7/m L,输注体积为1.0 m L。各组大鼠分别在给药前,给药后6 h,24 h以及72 h进行MRI和PAI检查。给药后72 h（完成磁共振成像和光声成像后）,每组大鼠处死4只,获取心、肝、脾、肺、肾组织行普鲁士蓝染色,观察BM-MSCs在全身重要脏器的分布。给药后1个月,通过肝功能相关血液学指标（AST、ALT、TBIL、ALB）、纤维化血液学指标（IV型胶原纤维、透明质酸）及肝脏组织病理学检测,对比不同给药途径治疗肝硬化的疗效。研究结果1、本实验制备的Au-FeO silica NPs水动力学半径在300 nm左右,粒径分布较均一;呈不规则球形,由中心处的星状Au NPs和外周包含有颗粒状FeO NPs的硅层组成;在波长为800 nm近红外光处具有良好的吸收性能,具备光声成像性能;放置磁铁后,Au-FeO silica NPs吸附于磁铁一侧,展现出良好的磁性;在水（HO）,磷酸盐缓冲溶液（PBS）,DMEM培养基及胎牛血清（FBS）四种溶剂中,Au-FeO silica NPs在波长为785 nm近红外光处的吸光度在7天内始终维持在0.6 OD左右,具有良好的稳定性;光声及顺磁性能与Au-FeO silica NPs的浓度呈现出良好的线性相关性。2、提取得到的SD大鼠BM-MSCs呈贴壁性指数型生长,在培养过程中,BM-MSCs形态始终表现为长梭形。第3代大鼠BM-MSCs表达CD44、CD73、CD29及CD90等分子,不表达CD45和CD11b等分子;当Au-FeO silica NPs浓度在2.0 OD时,BM-MSCs可以保持约80%的细胞活性。普鲁士蓝染色、ICP-MS及光声-磁共振成像结果表明,当2.0 OD浓度的Au-FeO silica NPs和BM-MSCs共孵育24 h后,BM-MSCs显著摄取Au-FeO silica NPs,能够实现清晰的MRI及PAI双模态成像。透射电镜结果显示,标记后7 d,Au-FeO silica NPs仍然存在于BM-MSCs内部。此外,标记后的BM-MSCs可以保持较高的细胞增殖活力;细胞表面仍表达CD44、CD73、CD29和CD90,不表达CD45和CD11b;BM-MSCs分泌IL-6、IL-10、MMP-8、MCP-1水平在标记前后无显著差异。同时,标记后的BM-MSCs具有良好的成脂成骨

关键词： 糖皮质激素   股骨头缺血性坏死   骨髓间充质干细胞   干细胞治疗  

摘要： 糖皮质激素所导致的股骨头缺血性坏死,被认为是长期或过量使用类固醇治疗中最严重的副作用。糖皮质激素可以破坏骨髓间充质干细胞的正常分化,导致骨量的减少和骨髓脂肪组织的增加。然而,其潜在的发病机制仍不明确。尽管全髋关节置换术是治疗晚期股骨头缺血性坏死最有效的方法,但在年轻患者或活跃人群中,因为一些与假体相关的并发症,全髋关节置换术的效果往往不佳。骨髓间充质干细胞具有自我更新和多向分化的能力,包括分化为成骨细胞和内皮细胞,从而介导骨修复和血管生成。此外,骨髓间充质干细胞还可以通过旁分泌作用提供生长因子,从而促进坏死区的血液供应。因此,骨髓间充质干细胞治疗可以作为激素性股骨头缺血性坏死的保髋方案之一。

关键词： 原发性卵巢功能不全   女性青春期   月经稀发   骨髓间充质干细胞   卵巢早衰   功能减退   恢复措施  

摘要： 卵巢早哀(premature ovarian failure,POF)又称为原发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,P0I),是指女性青春期后至40岁之前卵巢功能的减退,主要表现为血清高促性腺激素、低雌激素、月经稀发、闭经、生育能力减退等[1]。目前,P0F的具体发病机制仍不明确,针对其卵巢组织结构受损、储备功能减退尚无有效的恢复措施。

关键词： 慢加急性肝衰竭   骨髓间充质干细胞   肝功能   Bax   Bcl-2   增殖细胞核抗原  

摘要： 目的探究骨髓间充质干细胞治疗大鼠慢加急性肝衰竭的效果。方法选取清洁级SD成年雄性大鼠40只,采用随机数字表法分为模型组与用药组,每组20只。经腹腔注射10%D-氨基半乳糖(D-Gal N)诱导大鼠急性肝衰竭模型。造模后12 h,用药组经尾静脉注射1.5 m L骨髓间充质干细胞(BMSCs)悬液,连续给药3 d,而模型组注射等体积无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)。比较两组肝脏功能及BCL2-Associated X蛋白质(Bax)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、增殖细胞核抗原(PCNA)表达情况。结果用药组天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆红素(TBil)水平均低于模型组,血白蛋白(Alb)高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);用药组Bcl-2、PCNA蛋白水平均低于模型组,Bax蛋白水平高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论骨髓间充质干细胞治疗大鼠慢加急性肝衰竭,能有效改善肝功能,促进肝细胞再生。

关键词： 类风湿性关节炎   仙龙颗粒   骨髓间充质干细胞   辅助性T细胞17   调节性T细胞  

摘要： 目的探讨仙龙颗粒联合骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSC)治疗类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)的疗效及对辅助性T细胞17(Thelper cell 17,Th17)/调节性T细胞(Tregulatory cells,Treg)平衡的影响。方法将35只8周龄SD大鼠随机分为模型组、泼尼松组、仙龙颗粒组、BMSC组、联合组5组,每组各7只。造模后7 d,模型组、泼尼松组、仙龙颗粒组分别给予生理盐水、泼尼松溶液、仙龙颗粒溶液灌胃;BMSC组、联合组尾静脉注射BMSC后,再分别给予生理盐水、仙龙颗粒灌胃,均连续灌胃4周。治疗后对各组大鼠进行关节炎指数(Arthritis,AI)、足肿胀程度,滑膜组织Th17、Treg细胞,血清肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-17(Interleukin-17,IL-17)、白介素-10(Interleukin-10,IL-10)及叉状头/翅膀状螺旋转录因子3(Forkhead/winged helix family transcription factor 3,FoxP3)和维甲酸相关孤儿受体γt(Retinoid-related orphan nuclear receptorγt,RORγt)mRNA水平测量。结果治疗后泼尼松组、仙龙颗粒组、BMSC组和联合组AI评分、足肿胀程度均低于模型组,且联合组均低于泼尼松组、仙龙颗粒组和BMSC组(P<0.05)。治疗后泼尼松组、仙龙颗粒组、BMSC组和联合组滑膜组织Th17、Th17/Treg、RORγt mRNA水平均低于模型组,Treg、FoxP3 mRNA水平均高于模型组,且联合组滑膜组织Th17、Th17/Treg、RORγt mRNA水平均低于泼尼松组、仙龙颗粒组和BMSC组,Treg、FoxP3 mRNA水平均高于泼尼松组、仙龙颗粒组和BMSC组(P<0.05)。治疗后,泼尼松组、仙龙颗粒组、BMSC组和联合组血清TNF-α、IL-17、IL-10水平均低于模型组,且联合组均低于泼尼松组、仙龙颗粒组和BMSC组(P<0.05)。结论仙龙颗粒联合BMSC治疗RA大鼠效果好,能够有效改善其AI评分和足肿胀度,还能够通过调节FoxP3 mRNA、RORγt mRNA水平改善RA大鼠的Th17/Treg细胞平衡状态,进而发挥抗炎作用。